מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
עובר דרוזופילה כבר זמן רב מודל מעבדה רב עוצמה להבהרת מנגנונים מולקולריים וגנטיים המפקחים על פיתוח. הקלות של מניפולציות גנטיות עם המודל הזה החליפו גישות תרופתי כי הם דבר שבשגרה במודלים של בעלי חיים אחרים ומבחנים מבוססי תאים. כאן אנו מתארים ההתקדמות בפרוטוקול המאפשר יישום של מולקולות קטנות לעובר זבוב הפירות הפיתוח. השיטה מפרטת צעדים כדי להתגבר על האטימות של קליפת הביצה, תוך שמירה על כדאיות עובר. permeabilization קליפת הביצה על פני מגוון רחב של שלבי התפתחות מושגת על ידי יישום של permeabilization שתואר קודם לכן d-limonene עובר ממס (EPS 1) ועל ידי עוברי הזדקנות בטמפרטורה נמוכה (18 ° C) לפני טיפולים. בנוסף, שימוש בצבע מרחיק אדום (Cy5) כאינדיקטור permeabilization מתואר, אשר תואם עם יישומים במורד הזרם מעורבים שפעת אדומה וירוקה סטנדרטיתצבעי orescent בהכנות בשידור חי וקבועות. פרוטוקול זה הוא ישים למחקרים באמצעות תרכובות ביו לחקור מנגנוני התפתחות, כמו גם למחקרים שמטרתם להעריך את הפעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized.
מבוא
עובר דרוזופילה ממשיך להיות מודל המוביל לחקירה של מנגנונים בסיסיים של פיתוח 2. מודל רב עוצמה זו נתמך על ידי מערך רחב של כלים גנטיים מולקולריים המאפשרים מניפולציות של מהות כל גן בכל נקודת זמן ובמסגרת כל איבר מתפתח. הגודל הקטן, התפתחות מהירה, ואפיון המקיף של המורפוגנזה של עובר דרוזופילה להפוך אותו למודל של בחירה עבור מסכי גנטיים, שרבים מהם נחשפו מסלולים התפתחותיים בסיסיים 3,4. פנוטיפים רבים בעובר דרוזופילה אופיינו ולפרש בקלות, לעתים קרובות מתן אמצעים לזיהוי מנגנונים גנטיים מולקולריים שבבסיס אחראי לתכונה חריגה.
מבחי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תרבויות טוס, פתרונות, ומכשירי טיפול בעובר
- הכן את תרבות כלוב של דרוזופילה. הנח 500 זבובים + הזדווגות של הזן הרצוי במצוידים בצלחת ענבים אגר 10 סנטימטר ומקום של שמרים להדביק כלוב אוכלוסייה. לשמור על התרבות בחממה מבוקרת C לחות 25 °. הערה: תרבויות כלוב דורשות יום או ימים של אוויר, כדי לרכוש דפוסי עובר הנחת עקביים. צלחות ענבים עם שמרים להדביק משתנות פעם בבוקר ופעם בערב באוויר.
- הכן EPS. פתרונות חמים של חומרים פעילי שטח (DEA cocamide ואלכוהול Ethoxylated) ב 37 ° C.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מכשירי טיפול בעובר הם בתמונה באיור 1 על מנת לסייע בלדמיין את המכשירים "תוצרת הבית" למניפולציה בפרוטוקולים לעיל. תוצאות ניתן לראות באיור 2 ממחישות את ההשפעה החזקה של גידול עובר ב18 מעלות צלזיוס ביכולת שלהם להיות permeabilized ידי EPS בשלבים מאוחרים של התפתחות. מצב זה מיושם בשלב הפרוטוקול 2.1. יעילות של צבע החומצה קרבוקסילית Cy5 כדי לחשוף את הרמות השונות של חדירות לראות בדרך כלל בEPS עוברי מטופלים לראות באיור 3. הדינ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה הנ"ל מתארת אמצעי להשגת עוברי דרוזופילה קיימא, כי הם נגישים לטיפולי מולקולה קטנים על פני מגוון רחב התפתחותית. שיטה זו מציגה את הרומן וממצא פשוט שהזדקנות עוברים על 18 מעלות צלזיוס מאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר באותה היעילות כפי שניתן לראות בעבר רק בעוברים בשלב מוקדם. בנוסף, שימוש בחומצה מרחיק האדומה צבע Cy5 קרבוקסיליות כאינדיקטור חדירות הוכחה כיעילה ביישומים שלאחר תיקון, ואינו מתערב בסמני ניאון אדומים וירוקים קונבנציונליים שניתן להשתמש בם כדי לחשו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NIEHS R03ES021581 (הוענק ל-M.D.R.) ועל ידי המרכז לבריאות הסביבה של אוניברסיטת רוצ'סטר (NIH/NIEHS P30 ES001247).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כלוב זבוב | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| קוקמיד DEA [נינול 11-ס"מ] | Stepan Chemical | קוראת להזמנה מיוחדת | http://www.stepan.com/ |
| אלכוהול אתוקסילט [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | קוראת להזמנה מיוחדת | http://www.stepan.com/ |
| d-לימונן (דרגת טוהר גבוהה במיוחד) | Florida Chemical Co. | קול קורא להזמנה מיוחדת | http://www.floridachemical.com/ |
| נתרן היפוכלוריט | פישר | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | פישר | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS אבקת | סיגמא | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| רודמין B | סיגמא | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 חומצה קרבוקסילית | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | סיגמא | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| מגנים וסאנג M3 בינוני | סיגמא | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| רשת ניילון Nitex | Flystuff.com | 57-102 | |
| http://flystuff.com/misc.php ממברנת חמצן מומס (DO) | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 מ"מ עגול מס' 1 תלוש כיסוי מס' 1 | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| תערובת צלחות ענבים-אגר | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
מקורות
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J. Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Gene....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
