Ex vivo מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

סיכום

פרוטוקול זה מתאר דיסקציה של אנלאגן בלוטת התריס העוברי של עכבר ותרבית של צמחים על מסננים נקבוביים למחצה או על שקופיות פלסטיק במיקרוסקופיה. מערכת זו אידיאלית לחקר אירועים מורפוגנטיים או התמיינות המתרחשים במהלך התפתחות בלוטת התריס של עוברים מסוג בר או נוק-אאוט, והיא ניתנת לניסויים של רווח ואובדן תפקוד.

תקציר

בלוטת התריס היא בלוטה האנדוקרינית bilobated המקומית בבסיס הצוואר, ייצור הורמוני בלוטת התריס T3, T4, וקלציטונין. T3 ו-T4 מיוצרים על ידי thyrocytes המובחן, שאורגן בתחומים סגורים הנקראים זקיקים, בעוד קלציטונין הוא מסונתז על ידי C-תאים, וביניהם בין הזקיקים ורשת צפופה של נימי דם. למרות שארכיטקטורה של בלוטת התריס למבוגרים ופונקציות כבר מתוארים בהרחבה ולמדו, היווצרות של היחידות "Angio-פוליקולרית", ההפצה של C-תאים בparenchyma והתקשורת אוטוקריני בין האפיתל ותאי האנדותל היא רחוק מלהיות מובן.

שיטה זו מתארת ​​את השלבים רציפים של נתיחת עכבר בלוטת התריס עוברית anlagen ותרבותה על מסנני semiporous או בשקופיות פלסטיק מיקרוסקופית. בתוך פרק זמן של ארבעה ימים, מערכת זו התרבות בנאמנות משחזרת בהתפתחות בלוטת התריס vivo. ואכן, מיליארדים (i)obation של האיבר מתרחש (לexplants E12.5), (ii) thyrocytes מבשרים לארגן לתוך זקיקים ולקטב, (iii) thyrocytes ו-C-תאים להבדיל, וכן (iv) בתאי האנדותל הנמצאים ברקמה להתרבות microdissected, נודדים לתוך אונות של בלוטת התריס, ושיתוף הפעולה הדוק לקשר עם תאי אפיתל, כפי שהם עושים בגוף חי.

ניתן להשיג רקמות בלוטת התריס מסוג בר, נוקאאוט או עוברים מהונדסים ניאון. יתר על כן, explants תרבות ניתן להשפיע על ידי תוספת של מעכבים, חסימת נוגדנים, גורמי גדילה, או אפילו תאים או בינוניים מותנה. Ex vivo פיתוח ניתן לנתח בזמן אמת, או בכל עת של התרבות על ידי immunostaining וRT-qPCR.

לסיכום, התרבות explant בלוטת התריס בשילוב עם כל הר במורד הזרם או בפרופילי הדמיה סעיפים וביטוי גנים מספק מערכת רבת עוצמה עבור מניפולציה ולומד אירועי morphogenetic ובידול של o בלוטת התריסrganogenesis.

מבוא

בלוטת התריס היא אוסף של תחומים אפיתל עצמאיים, המכונה זקיקים, מוקף רשת צפופה של נימי דם אנדותל. ארגון זה מאפשר תפקוד בלוטת התריס: נימי אנדותל לספק thyrocytes עם יוד, הנדרש לסינתזת הורמון T3 ו-T4, ולהפיץ את אלה האחרונים לכל הגוף. מפוזר בין הזקיקים ונימי הדם, C-תאים לייצר את הורמון hypocalcemic calcitonin ^1. למרות שהארכיטקטורה של בלוטת התריס למבוגרים ופונקציות ידועות, המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים בהתפתחות בלוטת התריס עוברית (היווצרות זקיק ובידול) הם רחוקים מלהיות מובן.

במהלך עובר, thyrocytes אב מקורו כעיבוי (anlage קו האמצע) של קיר הגחון של האנדודרם המעי הקדמי ביום עוברי (ה) 8.5 בעובר של העכבר, ואילו אבות C-תאים שמקורם בE11.5 כבליטות דמוי טיפה ( bo ultimobranchialמת) של שקיות בלוע הרביעית ^2-6. ניצן קו האמצע ואז מתנתק מהאנדודרם, מרחיב בילטרלי הפתיל בE13.5 עם גופי ultimobranchial בכל צד של קנה הנשימה. לבסוף, thyrocytes לארגן לתוך זקיקים ו-C-תאים להתמיין.

ידע הנוכחי על היווצרות בלוטת התריס בעיקר מגיע מניתוח היסטולוגית של רקמות קבועות, אבל אירועי morphogenetic המעורבים בהיווצרות בלוטת התריס הם דינמיים מאוד וכרוכים בתקשורת ויחסי גומלין בין תאים מסוגים שונים ועם מטריקס. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אבות thyrocyte לייצר רמות גבוהות של VEGF לגייס תאי האנדותל לבלוטת התריס מתפתח, ו, בתורו, גייסו את תאי האנדותל לקדם היווצרות זקיק והתמיינות תאי ^C-7.

רוב מחקרי vivo לשעבר בבלוטת התריס בוצעו על תאי שמקורם בבלוטת תריס למבוגרים מבודדים, גדלו גם על ד פלסטיק תרבית רקמת 2Dishes או במטריצות 3D. שימוש בסוגים אלה של תרבויות, תאי זקיקי הבדיל או יישארו מקוטב ומאורגן כמו זקיקים או לרכוש מחדש ארגון 3D ^8-10. עם זאת, תאים אלו טהורים אפיתל, explanted מהסביבה הפיזיולוגית שלהם, ותרבותיים ב2D, להתעלם מאינטראקציות עם מטריצה ​​תאית, ציטוקינים, גורמי גדילה ועם סוגי תאים אחרים, כמו תאי האנדותל או עצבים שהם בדרך כלל נתקלים בגוף חי. מחקר נחמד מאוד לאחרונה תאר פרוטוקול התמיינות של תאי גזע עובריים לזקיקי בלוטת התריס באמצעות צעד תרבות סופי בmatrigel 3D ^11. עם זאת, תרבויות 3D אלה חוסר מגע עם סוגי תאים אחרים.

בהתבסס על המומחיות קודמת בלבלב ובלוטות רוק תרבות איבר ^12-14, שיטה לנתח anlagen בלוטת התריס העוברי של העכברים וculturing explants על מסנני semiporous או בשקופיות פלסטיק מיקרוסקופית פותחה.

כאשרעבודה עם עוברי E12.5, המקור הכפול של anlagen בלוטת התריס (anlage קו האמצע ושני גופי ultimobranchial לרוחב) שהוטל microdissection של שבר גדול של רקמה. זה הכיל את קנה הנשימה, אבל לא את הוושט, והוארך מעורקי קשת בלוע עד נפיחות arytenoid. כאשר בתרבית על מסננים, anlage קו האמצע משתרע רוחבי בכל צד של קנה הנשימה, שבו הם מתמזגים עם גופי ultimobranchial כדי ליצור את אונות בלוטת התריס שתיים, עדיין מחוברים על ידי מצר צר.

בתרבות, בתאי אפיתל להתרבות, לארגן לזקיקים ולהתמיין לthyrocytes ו-C-תאים, תלוי במוצא שלהם. תאי האנדותל המופיעים ברקמות microdissected גם להתרבות ולפלוש לאונות בלוטת התריס סוף סוף לקשר הדוק עם מבנה זקיקי אפיתל, ללא תלות בזרימת דם או גורמים במחזור. כמו פיתוח של explants בנאמנות משחזר in vivo לפתחment, מערכת זו התרבות היא אופטימלי ללמוד morphogenetic ואירועי בידול המתרחשים במהלך התפתחות בלוטת התריס.

ניתן להשיג רקמות בלוטת התריס מסוג בר, נוקאאוט או עוברים מהונדסים ניאון, ומערכת התרבות ניתנת להורדה ובניסויי רווח של הפונקציה. לבסוף, הזמן לשגות הדמיה של explants בלוטת התריס שכותרתו fluorescently על צלחות פלסטיק מיקרוסקופית ניתן לנצל כדי לחקור טוב יותר קינטיקה והמשכיות של תנועות morphogenetic המתרחשות בגוף חי. זמן לשגות הדמיה כבר נעשתה שימוש כדי ללמוד המורפוגנזה הסתעפות של הלבלב ^15,16 או ניצן ureteric ^17.

פרוטוקול

עכברים הועלו וטופלו על פי העקרונות של טיפול בבעלי חיים במעבדה של ועדת צער בעלי החיים באוניברסיטה. כל הנהלים והפרוטוקולים אושרו על ידי ועדה זו.

1. ציפוי של מיקרוסקופית צ'יימברס תרבות פלסטיק

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים בזרימה למינרית. שני הסוגים של ציפוי הם ביצועים מקבילים.

1. תאי תרבות פלסטיק מעיל עם פיברונקטין יום אחד לפני הבידוד של רקמות בלוטת התריס:
   1. לדלל פיברונקטין סטריליים לריכוז סופי 50 מיקרוגרם / מיליליטר במדיום M199 בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, fungizone 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר ו -2 גלוטמין ¹² מ"מ.
   2. מכסה את הבארות עם 200 μl של פיברונקטין המדולל ודגירת הלילה במקרר 4 ° C.
   3. ביום של הניתוח, לשאוב פיברונקטין, יש לשטוף את הבארות פעם אחת עם M199 ולהוסיף נפח מינימאלי של 200 μl של M199 בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום.
   4. השאר את התאים מצופים בחממה עד מוכן לצלחת explants.
2. תאי תרבות פלסטיק מעיל עם סוג אני קולגן 2 שעות לפני הבידוד של רקמות בלוטת התריס:
   1. לדלל סוג סטרילי אני קולגן לריכוז סופי 50 מיקרוגרם / מיליליטר ב10 מ"מ HCl. הערה: שמור את פתרון מניות קולגן על קרח.
   2. מכסה את הבארות עם 200 μl מסוג מדולל אני קולגן ודגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר (RT).
   3. לשאוב את הסוג קולגן אני פתרון, יש לשטוף את בארות פעם אחת עם M199 ולהוסיף נפח מינימאלי של 200 μl של M199 בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום.
   4. השאר את התאים מצופים בחממה עד מוכן לצלחת explants.

2. Dissection של רקמות Anlagen המכילות בלוטת התריס (E12.5) או בלוטת התריס אונות (E13.5-E14.5)

הערה: השתמש בכלים לנתח נקיים וצלחות פטרי / תרבות. הצעדים הכלליים והחתכים מפורטים להלן זהים עבור E12.5 וE14.5 עובר.

1. להקריב מתוזמן בהריון נקבות עכברים בעובריים הרצוי היום (ה) (מE12.5 לE14.5) ולהסיר את הרחם באמצעות מכשירים לנתח.
2. הנח את הרחם גזור בצלחת 10 סנטימטר המכילה HBSS.
3. החזק את הגפיים אחת של הרחם עם מלקחיים ולפתוח את הרחם עם מספריים קטנים כדי לשחרר בהדרגה את כל העוברים.
4. הפרד את העוברים מהשליה במספריים ולהעביר את העוברים עם ממברנות extraembryonic בצלחת 10 סנטימטר חדש המכילה HBSS.
5. הסר את שק החלמון וamnion. הערה: מנקודה זו, לעבוד תחת סטראו עם שקוף מלמטה; הגדלת הגדלה בצעדים לנתיחה. משתמש במחטי טונגסטן בנימי זכוכית כמו לנתח כלים.
6. שימוש במחטים כמוסכין ומזלג, להסיר את החלק העליון של הראש, כוללים הלסת העליונה והאוזניים (איור 1 א, לחתוך לאורך).
7. החזק את העובר על הגב שלה ולהסיר ראשון חתיכה נוספת של הצינור העצבי (איור 1 א, לחתוך לאורך ב), ולאחר מכן את החלק התחתון של העובר, ממש מתחת לגפיים הקדמי ומעל ללב (איור 1).
8. להעביר את פרוסת העובר המכילה את הלשון (כדי לכוון את הרקמה) ואזור צוואר בצלחת 10 סנטימטר חדש המכילה HBSS.
9. הסר את הצינור העצבי ורקמות אחוריות לושט / קנה הנשימה (איור 1 ג, לחתוך לאורך).
10. בעדינות סעיף פרוסת הרקמה לאורך שני הצדדים של הלשון (איור 1 ג, לחתוך לאורך B ו-B ').
11. אתר את הוושט ואת קנה הנשימה, בהארכה של הלשון, ולנתח משם את הלשון, שעזב את arytenoid נפיחות (1D איור, לחתוך לאורך), והרקמות בבוטצדדים שעות של הוושט / קנה הנשימה (איור 1D, לחתוך לאורך B ו-B ').
12. הסר את הוושט, ולמקם את קנה הנשימה עם צד הגחון שלה פונה כלפי מעלה.
13. שם לנתח רקמות לא רצויות כמו התימוס (איור 1E) וכל הרקמות ממוקמות רוחבי לעורקי קשת בלוע. לE13.5 או E14.5 עובר, לדמיין את אונות בלוטת התריס בכל צד של קנה הנשימה (איור 1F; קווים מקווקווים אדומים) ולנתח עוד יותר את האונות מקנה הנשימה.
14. העבר את האזור המבודד קנה הנשימה E12.5, או אונות בלוטת התריס E13.5-E14.5 לתוך צלחת תרבות 35 מ"מ המכילה בינוני M199 מחומם מראש בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום. העבר את explants באמצעות קצה מסנן prewetted על micropipette P-200. לexplants E12.5, לחתוך את הקצה של הקצה כדי להרחיב את הפתח. הערה: באופן שגרתי, ואם יש עוברים גנוטיפ זהה, לבצע שלבים 6 ו -7 על כל העוברים,n 9-11, ולבסוף 12 & 13.

3. ציפוי ותרבות של Explants בלוטת התריס

1. שטוף את explants ידי העברה רצופה בשלוש בארות של צלחת 24 גם מכילה 1 מיליליטר של מדיום התרבות מחומם מראש (= M199 בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום).
2. ציפוי של אונות בלוטת התריס על תאי תרבות מצופים פלסטיק מיקרוסקופית:
   1. מדיום התרבות לשאוב M199 מהתאים המצופה.
   2. בזהירות, להעביר את explants בלוטת התריס לתאי התרבות באמצעות טיפים micropipette ומסנן. הנח explant אחד במרכזו של כל תא.
   3. הסר בינוני עודף ולמקם את חדר התרבות בתרבית רקמת חממה (37 C °; CO ₂ של 5%) עבור שעה 2 לתת explants לצרף למטריצה.
   4. בעדינות להוסיף 200-300 μl של מדיום התרבות מחומם מראש היטב כל אחד.
   5. דגירה לתרבות לטווח ארוך בחממה בתרבית הרקמה.
3. ציפוי oאונות אזור קנה הנשימה ו או בלוטת התריס על מסנני semiporous:
   1. מלא את מספר הבארות של צלחת 24 גם נדרשה עם 330 μl של מדיום התרבות מחומם מראש.
   2. מסנני מקום (למשל 0.4 מיקרומטר סינון Millipore) על המדיום, לטפל כדי למנוע לכידה של בועות אוויר מתחת למסנן התרבות.
   3. בזהירות, תוך שימוש בטיפי micropipette ולסנן, להעביר את explants בלוטת התריס עם נפח מינימאלי של מדיום על גבי במרכז המסננים (4/filter המרבי).
   4. להסיר את העודפים של מדיום ומתוך חלל explants עם מחט טונגסטן.
   5. דגירה לתרבות לטווח ארוך בחממה בתרבית הרקמה. הערה: מדיום תרבות שינוי בכל יום אחר תחת הזרימה למינרית. תרבות explants עד 7 ימים.

4. כל הר Immunofluorescence מכתימים פרוטוקול Explants בלוטת התריס

לעקור explants גדל על מסננים (אחרי שלב 2 להלן) באמצעות מחטים או טונגסטןמלקחיים בסדר והעברה בצלחת 24 גם לכל השלבים, פרט לincubations ראשוני (שלב 5) והמשני (שלב 7) נוגדן (צלחת 96 היטב). לexplants חסיד תרבית על תאי פלסטיק מיקרוסקופית, לבצע את כל השלבים בתאי התרבות.

1. לשאוב בינוני M199 התרבות ולתקן את explant עם paraformaldehyde 4% קרים כקרח (PFA) עבור 20 דקות (500 μl בצלחת 24 גם ו300 μl בשקופיות מיקרוסקופ).
2. לשטוף 2x 10 דקות בטריס שנאגרו מלוח עם טריטון (TBST; 50 מ"מ טריס HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,1% טריטון X-100) ב RT.
3. לעבד את explants מייד או לאחסן ב -20 ° C. הערה: לאחסון לטווח ארוך ב -20 ° C, מייבשים את explants במתנול על ידי הגדלת בהדרגה ריכוז מתנול ב TBST להגיע מתנול 100%. כאשר מוכן להמשיך עם immunostaining (שלב 4), רעננות explants ידי הוספת TBST הדרגה למתנול.
4. החלף TBST עם פתרון החסימה (10% עיזים סרום נורמלי בTBST) ו לדגור על כיסא נדנדה ים ראה ל30-60 דקות ב RT.
5. לדלל נוגדן ראשוני בחסימת פתרון (100-200 μl לכל מצב). העבר את explants "לסנן" מצלחת 24 גם לצלחת 96 היטב. דגירה explants עם הנוגדנים הראשוניים על כיסא נדנדה ים ראה לילה בשעה 4 ° C.
6. למחרת, לבטל את פתרון הנוגדן הראשוני, להעביר את explants "המסנן" חזרה בצלחת 24 גם, ולשטוף לפחות חמש פעמים עם TBST על כיסא נדנדה ים ראה ל45-60 דקות כל אחד ב RT.
7. מדולל נוגדנים משני (למשל אנטי-X-Alexa פלואוריד עיזים ב1:2,000 דילול) ב TBST המכיל 1% מעזים בסרום נורמלי ודגירת explants עם דילול זה לילה על כיסא נדנדה ים נדנדה על 4 מעלות צלזיוס ובחושך. לcounterstaining הגרעיני, כולל 1 מיקרוגרם / מיליליטר של bis-Benzimide (Hoechst) יחד עם פתרון נוגדנים משני.
8. למחרת, לבטל את פתרון נוגדנים משני ולשטוף 5x עם TBST על ים ראהנדנדה ל45-60 דקות כל אחד ב RT. במהלך שוטף, לשמור explants בחושך.
9. לבצע שטיפה נוספת בTBST עדינות מתערבל הלילה ב 4 ° C בחושך.
10. Postfix explants immunostained PFA 4% ב 4 ° C למשך 10 דקות.
11. לשטוף 2x 10 דקות עם TBST.
12. העבר את explants או במתנול בהדרגה 100% עבור אחסון לטווח ארוך ב -20 מעלות צלזיוס, או לנתח באופן מיידי. לexplants תרבית על מסננים, וimmunostained בצלחת 24 גם, העברה בתא מיקרוסקופית (למשל LabTek או Ibidi) עם TBST או בינוני הרכבה ניאון טוב יותר לפני ניתוח עם multiphoton או מיקרוסקופ confocal.

5. הפקת RNA מבלוטת התריס

לעבוד בסביבה נטול RNase. לכן, שימוש בחומצות גרעין וטיפים פיפטה nuclease חופשי ולנקות גם ספסל וציוד מהמזהמים וRNases. פרוטוקול זה שמבוסס על פנול / כלורופורם, לבצע את הצעד הראשוןים (1 עד 7) מתחת למכסת מנוע כימי.

1. Homogenize explant בלוטת התריס אחד או שתי אונות של בלוטת התריס עם 300 μl של פתרון מיצוי RNA באמצעות העלי חד פעמי עבור 1.5 צינור מיליליטר. בין דגימות, לשטוף את העלי ב2% SDS, ולאחר מכן במים, ולאחר מכן אתנול.
2. הוספה של פתרון מיצוי RNA עוד 100 μl, מערבולת 10 שניות ולדגור על RT עבור 10 דקות.
3. ורטקס למשך 30 שניות ולהוסיף 20 ng של tRNA לכל דגימה.
4. מערבולת דקות 1 ולהוסיף 80 μl של כלורופורם.
5. וורטקס במרץ ל30 שניות והדגירה 15 דקות ב RT.
6. ספין ל15 דקות ב 19,000 XG בצנטריפוגה בקירור (4 ° C).
7. העבר בזהירות את השלב המימית העליון חסר הצבע בצינור טרי המכיל 20 מיקרוגרם של גליקוגן כcoprecipitant.
8. ורטקס ולהוסיף 200 μl של 100% אלכוהול isopropanol.
9. וורטקס במרץ ל15-30 שניות ולתת משקע RNA ב-20 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שעות או ב-C ° -80 במשך שעה 1.
10. ספין ל30 דקות ב 19,000XG ב 4 ° C, ולחסל את supernatant.
11. שטוף את הכדור עם 450 μl אתנול 75% קרים ומערבולת כדי לסלק את הכדור.
12. ספין 10 דקות ב 19,000 XG ב 4 ° C, ולחסל את supernatant.
13. ייבש את הכדור מתחת למכסת המנוע למשך 5 דקות.
14. Resuspend את הכדור עם 10 μl מים RNase ללא דגירה 10 דקות ב RT.
15. ריכוז assay RNA, חנות ב -80 מעלות צלזיוס או להפוך לתמלל עבור ניתוח ביטוי גנים.

תוצאות

anlages בלוטת התריס (קו האמצע וUB, יחד עם רקמות הסובבות), ואונות של בלוטת התריס הם גזורים מעוברי עכברים בE12.5 וe13.5/e14.5, בהתאמה (איור 1). לאחר יום אחד בתרבות במסנן, anlage קו האמצע הוא גלוי (איור 2 א) כרקמה מוארכת המשתרעת על גבי קנה הנשימה. זה בהדרגה יוצר שתי אונות בכל צד של קנה הנשימה. אם אונות מבודדות בלוטת התריס (E13.5 או E14.5) בתרבית, הם ירחיבו, לעבור המורפוגנזה ותאי האפיתל יארגנו לתוך מבני macroscopically גלויים פוליקולרית (איור ...

דיון

מאמר זה מתאר שיטה לניתוח, culturing explants בלוטת התריס (E12.5) או אונות (E14.5) על מנת ללמוד ולהבין טוב יותר את האירועים המורכבים שמוביל להיווצרות של בלוטת התריס. בשל המוצא הכפול של anlagen בלוטת התריס (anlage קו האמצע ושני הגופים ultimobranchial לרוחב), והגודל הקטן שלהם, שבר של מקורי מקומי רקמת E12.5 לעורקי קשת בלוע, ומכיל את קנה הנשימה, אבל לא את הוושט הוא microdissected. כפי שמודגם, בתוך פרק זמן של ארבעה ימים, מערכת זו תרבות בנאמנות משחזרת בהתפתחות בלוטת התריס vi...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
µ-slide 8 well, ibiTreat, תרבית רקמות מטופלת,	פרוקסילאב	80826
קולגן סוג I, זנב עכברוש	Millipore	08-115
פיברונקטין מפלזמה אנושית	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
חוט טונגסטן	Goodfellow	LS237450
תוספת צלחת תרבית (קוטר 12 מ"מ)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1,000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
הוכסט	סיגמא	B2261