מאמר שיטה

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P F) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

DOI:

10.3791/51652

⸱

8 באוקטובר 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1The RH Smith Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, The Hebrew University of Jerusalem, 2Earth and Life Institute, Université catholique de Louvain, 3Institut des Sciences de la Vie, Université catholique de Louvain

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידה מקדם האוסמוטי חדירות מים (ו P) של תאים יכול לעזור להבין את מנגנוני הרגולציה של aquaporins (AQPs). נחישות f P בprotoplasts תא צמח הכדורי המוצג כאן כוללת בידוד protoplasts וניתוח מספרי של השיעור הראשון שלהם שינוי נפח כתוצאה מאתגר האוסמוטי במהלך זלוף אמבטיה הקבוע.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקר מנגנוני רגולציה AQP הוא קריטי להבנה של יחסי מים בסלולריים ורמות הצמח כולו שניהם. מוצג כאן היא שיטה פשוטה ויעילה מאוד לקביעת מקדם חדירות מים האוסמוטי (ו P) בprotoplasts צמח, החלים באופן עקרוני גם לתאים כדוריים אחרים כגון ביציות צפרדע. הצעד הראשון של assay הוא הבידוד של protoplasts מרקמות הצמח של ריבית על ידי עיכול אנזימטי לתא עם תמיסה איזוטונית מתאימה. הצעד השני מורכב מassay אתגר האוסמוטי: protoplasts המשותק בחלקו התחתון של החדר מוגשים להתחלת זלוף מתמיד עם תמיסה איזוטונית ואחריו פתרון hypotonic. נפיחות התא היא וידאו מוקלט. בשלב השלישי, התמונות מעובדות מחובר להניב שינויי נפח, וכמובן של שינויי נפח הזמן מתואם עם מהלך השינוי בosmola הזמןטוהרתו של מדיום התא זלוף, באמצעות הליך ראוי עקומה נכתב Matlab ('PfFit'), כדי להניב f P.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספיגת מים וזרימה על פני ממברנות תאים היא דרישה בסיסית לקיום מפעל בסלולרי ורמות הצמח כולו שניהם. ברמה התאית, aquaporins (AQPs) לשחק תפקיד מפתח בוויסות של המקדם האוסמוטי חדירות מים (ו P) של קרום תא 1-3.

נכון להיום, כמה שיטות כבר מועסקות במדידת f P אנדוגני של protoplast מאיברי צמח שונים (כלומר שורשים, mesophyll, endodermis, וכו '., נסקרו על ידי Chaumont et al. 4). אחת הגישות למדידת f P הוא לחשוף את protoplasts לאתגר האוסמוטי ולעקוב אחר שיעוריו הראשוניים של שינוי הנפח שלה (כלומר., השיפוע של השלב ליניארי המוקדם של שינוי הנפח). שתי שיטות שונות שתוארו לעיל מבוססת על גישה זו, שניהם מבוססות על חילופי מיידיים של פתרונות. הראשון מורכב מimmobilizing protoplast עם micropipette יניקה ומיתוג זרימת פתרון 5 ושנייה אחת של העברת protoplast מפתרון אחד למשנהו באמצעות micropipette 6. שיטות אלה יניקת micropipette וmicropipette העברה, המאפשרות רכישת תמונה בתחילת מאוד של חילופי פתרון מהירים (כדי ללכוד את השלב ליניארי המוקדם של שינוי נפח), ככל הנראה כרוכות לחץ פיזי לprotoplasts ודורשות ציוד מיוחד ומיקרומניפולציה מומחה.

השיטה המתוארת כאן ממזערת ההפרעה לתאים, אינו כרוכה במיקרומניפולציה ומאפשר גזירה של f P כאשר זלוף האמבטיה אינו מיידי.

לאחר עיכול אנזימטי, protoplasts, שקוע בתמיסה איזוטונית, הם משותקים בחלקו התחתון coverslip הזכוכית של פרספקס (aka Lucite או פרספקס) תא על ידי אינטראקציה תשלום. לאחר מכן, במהלך זלוף אמבטיה קבוע,התמיסה איזוטונית הוא הסמיק משם על ידי פתרון hypotonic יצירת אתגר hypoosmotic לprotoplasts. הנפיחות של protoplast היא וידאו מוקלט ולאחר מכן, על ידי שילוב של המידע על מהלך הזמן של זלוף האמבטיה וכמובן של נפיחות תא הזמן, f P נקבעה על ידי עיבוד תמונה ונהלים מתאימים עקום.

היתרונות של שיטה זו הם שהניסוי הוא יעיל מאוד, כלומר אפשר לעקוב אחר כמה תאים בו זמנית בassay יחיד, ושהיא אינה דורשת ציוד מיוחד או כישורי מיקרומניפולציה מסוימים. מספר יישומים עבור שיטה זו הם אפשריים. לדוגמא, קביעת f P יליד מגוון של תאים מרקמות שונות וצמחים, כגון mesophyll וצרור תאי נדן מעלה ארבידופסיס 7, mesophyll עלה תירס או תאי שורש קליפת 8-10 או תאים בתרבית השעיה 11,12. בadditiב, ניתן לקבוע f P של תאי בעלי חיים כדוריים כגון תאי ביצית 11. דוגמא נוספת כרוכה בדיקה של פעילות AQP ידי ביטוי החולף של הגן שלהם בprotoplasts (או כל גנים אחרים אשר עשוי להשפיע עליהם, לדוגמה, הגנים של קינאז) ונחישות של תרומתם לf P; קשור 2-P f 13, למשל, ביטוי של עגבניות AQP SlTIP2; 2 בprotoplasts mesophyll ארבידופסיס על ידי שינוי PEG ונחישות SlTIP2. לבסוף, בחינה של ההשפעה על f P של מולקולות / חומרים שונים (תרופות, הורמונים, וכו ') הוסיפה לפתרונות יכול גם להיבחן, למשל של חוסם AQP HgCl 2 7.

הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד של protoplasts של התאים והנחישות של f P mesophyll ארבידופסיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 הכנת פתרונות

  1. הכן איזוטוני (600 mOsm) וhypotonic (500 mOsm) פתרונות המכילים 10 מ"מ KCl, 1 מ"מ CaCl 2, ו -8 M 2 (N-morpholine) חומצת -ethanesulphonic (MES), pH 5.7 ולהתאים osmolarity עם הכמויות המתאימות של D-סורביטול: 540 מ"מ לאיזוטוני ו440 מ"מ לפתרון hypotonic. ודא osmolarity של הפתרון (במרחק של 3% מערך היעד) באמצעות osmometer.
  2. הכן מלאי יבש של "תערובת האנזימטית 'המכילה האנזימים הבאים: cellulase 0.55 גרם, pectolyase 0.1 גרם, 0.33 גרם polyvinylpyrrolidone 30 K, 0.33 BSA g (ראה לוח 1 להלן), לערבב את האבקה היבשה על ידי מערבולת, להפוך 5.7 aliquots מ"ג ו לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

.2 בידוד של Protoplasts mesophyll ארבידופסיס

  1. הכן צלחת פטרי (10 סנטימטר) עם כ 6 טיפות (כ. 30 μl כל אחת) של תמיסה איזוטונית.
  2. מקלפים את האפידרמיס abaxial עלה ארבידופסיס (נמוך יותר), גut העלה קלוף לריבועים של כ 4 x 4 מ"מ 2, ואז למקם את הריבועים בתמיסה איזוטונית טיפות עם צד abaxial החשוף למטה, נוגעים בפתרון.
  3. לפזר 5.7 מ"ג של תערובת האנזים ב165 μl תמיסה איזוטונית (.3.3% w / w) בצינור 1.5 מ"ל, מערבב בעדינות על ידי pipetting לדקה בערך עד שהיא נמסה, ומניח כמה טיפות דומות של הפתרון האנזימטית באותו פטרי מנה.
  4. העבר את חתיכות עלים על הפתרון האנזימטית טיפות, לסגור את צלחת איטום המכסה עם סיבוב של parafilm אחד והדגירה של 20 דקות, צף הצלחת באמבט מים מוגדר 28 ° C.
  5. להוסיף עוד כמה טיפות של התמיסה איזוטונית למנה (2 טיפות לכל טיפת פתרון אנזים). העבר כל פיסת עלה לירידת תמיסה איזוטונית חדשה, ולאחר מכן, ברצף, לירידה שנייה (כדי לשטוף את הפתרון האנזימטית משם). הרם את החתיכה על ידי הקצה שלה באמצעות מלקחיים, לנער אותו בירידה השנייה (כמו שקית תה) כדי לשחרר את protoplasts.לאסוף את הטיפות עם protoplasts (באמצעות קצה פיפטה 100 μl מקוטע כבוי) לתוך צינור 1.5 מ"ל.

.3 Hypotonic האתגר Assay: נפיחות סלולארי ארבידופסיס mesophyll

  1. הכן את מערכת זלוף (איור 1 א) על ידי מילוי עמודה אחת עם התמיסה איזוטונית ועמודה נוספת עם פתרון hypotonic. פתח את השסתום, לתת קצת זרימת פתרון (ראשון hypotonic אז איזוטוני,) כדי למלא את צינורות כל הדרך למטה לסעפת היניקה (איור 1). וודא כי אין בועות אוויר שנלכדו, ולאחר מכן לסגור את הברז.
  2. לאטום coverslip, באמצעות גריז סיליקון (טבלת 1), כדי להפוך את תחתית לתא בשקף פרספקס (איור 1 ב, וראה גם השרטוטים של החדר באיור 1 ג). כדי להפוך את תחתית התא (פני השטח של coverslip פונים כלפי מעלה נחשפו בתוך טבעת הגריז) "דביק" לprotoplasts, מעיילועם סולפט תשלום נושאות חיוביות protamine (1% במים; טבלת 1) או פולי-L-ליזין (0.1% במים; טבלת 1). מורחים "דבק" זה מעל coverslip באמצעות קצה פיפטה, לחכות 1 - 2 דקות, לשטוף 3 - 4 פעמים עם התמיסה איזוטונית ולנער ממנו את הפתרון שנותר.
  3. למלא את התא עם התמיסה איזוטונית. לאחר מכן, להוסיף טיפה של protoplasts המכיל פתרון לתא, באמצעות קצה פיפטה קצץ את ולחכות 3 - 4 דקות לprotoplasts להתיישב. כסה את החדר עם כיסוי שקוף (1D דמויות, 1E) נגיעה במשטח הפתרון (להימנע מהשמנת בועות אוויר מתחת).
  4. מניחים את השקף (בעדינות!) על שולחן מיקרוסקופ הפוך, לחבר אותו למערכת זלוף והמשאבה (שמירה מפני בועות אוויר בצינור!) והפעל את זרימת התמיסה איזוטונית לזלוף קבוע ב1 מ"ל / דקה (שיעורים מהר יותר ניתן להשתמש בו, עד 4 מ"ל / דקה).
  5. להקלטהשינויי נפח, משמש מיקרוסקופ הפוכה, עם מטרת 20X ועם מצלמת וידאו CCD מחוברת למחשב PC. השתמש בתוסף 'CMU 1,394 Driver המצלמה' של תוכנת ImageJ (ראה הטבלה של חומרים ספציפיים לכתובות ההורדה של שני חלקים אלה של תוכנה) כדי להקליט וידאו סרט 60 שניות של protoplasts הנייח הנבחר (ככל הנראה, אלה נדבקו לתחתית) בשיעור של תמונה / 1 שניות (1 הרץ). התחל הקלטה עם לשטוף 15 שניות של התמיסה איזוטונית (זה מהווה נקודת ההתחלה), לעבור לפתרון hypotonic ל45 שניות (כדי להשלים 60 שניות בסך הכל מההתחלה של זלוף). שמור את הסרט בפורמט TIF. הערה: בחר שדה תצוגה עם תאים רבים ככל האפשר, עמידה בקריטריונים הבאים: צורה כדורית ועם קווי המתאר תא ממוקדים היטב במתחם (איור 2 א) הגדול ביותר שלהם.

.4 ניתוח שינוי הנפח הנייד באמצעות ImageJ

הערה: כדי לנתחסדרה של תמונות של תא נפיחות, להשתמש ב'Explorer התמונה "והתוספים 'Protoplast Analyzer' בתוכנת ImageJ (שנכתבה על ידי חאווייר Draye) 14. החל protoplasts בחר בנקודת הזמן הראשונה שלהם, התוסף 'Protoplast Analyzer' יזהה באופן אוטומטי את קצות protoplasts (קווי המתאר) ולחשב את המסלול של האזורים שלהם הזמן במהלך הניסוי (plugins זמין עם תכנית ניתוח PfFit, להלן) .

  1. התחל ImageJ. כדי לפתוח את הסרט, לחץ על "קובץ" בלוח ImageJ, אז, ברציפות בתפריטים הנפתח כפי שהם נפרשים: 'יבוא' ולאחר מכן 'Explorer תמונה'. סמן את הסרט שנבחר, לחץ לחיצה ימנית ולאחר מכן עליו, לחץ על השמאל ולאחר מכן על 'Protoplast Analyzer'. חפש בסרט (באמצעות מחוון בתחתית תמונת protoplast) לזהות protoplasts שנותר במידה רבה ללא תנועה במהלך הניסוי - אלה ינותחו. חזור על ima הראשוןge, באמצעות העכבר, לצייר עיגולים (שנקטפו מכלי ציור ImageJ) סביב protoplasts נבחר (איור 2), לאחר מכן לחץ על 'אישור' בטבלה של 'פרמטרים איתור' שהופיעו.
  2. כדי להפעיל את אלגוריתם זיהוי protoplast, לחץ על 'מקומי' בפנל העליון תמונת protoplast, לאחר מכן 'תהליך' בתפריט הנפתח. לבחון את העיגולים הירוקים סביב protoplasts נבחר (איור 2 ג) לאורך כל הסרט. שמור את 'התוצאה' בקובץ Excel. צא ImageJ. הערה: במקרה נקודה אדומה מופיעה (כדי לציין רע בכושר גובה - בדרך כלל עקב ניגוד תמונה ירוד), הפעל מחדש עם פרמטרים שונים.
  3. כדי להפריד את הקווים השייכים לכל תא (אשר - אם שני תאים או יותר נותחו בו זמנית - יהיה כרוכים זה בזה, משום שהניתוח נעשה על ידי מסגרת מסגרת), באקסל, למיין את הנתונים שנשמרו על ידי העמודה מספר תאים ('אובייקט' ).
  4. לDetermine גורם המרת פיקסל למיקרומטר לקבלת הערך האמיתי של f P, לצלם תמונה של שליט מיקרומטר באמצעות אותה מטרת 20X מיקרוסקופ. גרור קו (שנקטף מכלי ציור ImageJ) לאורך תמונת השליט ולקרוא את המקבילה מספר הפיקסלים כדי אורך הסרגל בחלק התחתון של הפנל הראשי ImageJ. להמיר את ערכי אזור פיקסל השרירותיים בקובץ Excel למיקרומטר 2. שמור את מהלך זמן אזורים (לכל תא בנפרד) כקובץ טקסט (שתי עמודות של מספרים בלבד). הערה: זה יהיה קלט לתכנית 'PfFit' המתאים בנפח.

.5 דוגמנות ערי osmolarity השינוי בתא הניסוי באמצעות ImageJ וFit ו Matlab תכנית P

  1. הוסף 2 cyanol מ"ג קסילן (טבלת 1, להלן), כדי של התמיסה איזוטונית (כדי לייצר את 'מחוון דיי') 100 מ"ל.
  2. הכן את מערכת זלוף (כמו ב3.1) עם צבע המחוון וh הצבוע שאינופתרון ypotonic.
  3. לאטום להחליק את המכסה באמצעות גריז סיליקון לחלק התחתון של חדר פרספקס, אז בעדינות למלא את התא עם צבע המחוון, לכסות אותו עם תלוש לכסות (כמו עם protoplasts לפני) ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ.
  4. חבר את התא למערכת זלוף והמשאבה, והפעל את זרימת המחוון דיי לזלוף קבוע במ"ל / דקת l.
  5. להקליט סרט 60 שניות בשיעור של 1 הרץ. התחל ההקלטה עם 15 שניות של המחוון דיי, לעבור לפתרון hypotonic ל45 שניות. להפסיק לצלם. סומק עם המחוון דיי (לפחות למשך 30 שניות), ולאחר מכן להתחיל בסרט חדש. חזור על 5 - 6 פעמים ולשמור את כל הסרטים
  6. השתמש בתוכנת ImageJ לנתח את תמונות וידאו של העברת המחוון Dye להשיג כמובן זמן ממוצע של העברת השינוי.
    1. התחל ImageJ, לחץ על 'קובץ', ולאחר מכן, 'Open', ולגלוש לסרט. עבור כל סרט, לצייר רחב 10 פיקסל אנכימלבן בכל מקום על תמונת -1 בסרט. לחץ על 'תמונה' בלוח הראשי ImageJ, לאחר מכן לחץ על 'יבול' בתפריט הנפתח.
    2. כדי ליישר את 60 המסגרות (הסרט 60 שניות) בשורה אחת, לחץ שוב 'תמונה', לאחר מכן לחץ על רציפות בתפריטים הנפתח כפי שהם נפרשים: "סטאקס 'ו' הפוך Montage '(עמודות 60, שורות 1). לצייר מלבן אופקי גבוה פיקסל 1 בכל מקום לאורך כל השורה של תמונות ולחץ על 'ניתוח' בלוח הראשי ImageJ, לאחר מכן לחץ על 'פרופיל עלילה "בתפריט הנפתח. הערה: 'מגרש של Montage' יופיע חלון (לא מוצג), ורשימה של נתונים העברה ניתן לפתוח מהתפריט שלה. כל תמונה של הסרט מיוצגת ברשימה זו על ידי 10 ערכי העברה שמקורם בהמלבן 10 פיקסל הרחב וכתוצאה מכך "בסיס הזמן" (המספר סידורי תמונה) הוא 10 פעמים יותר.
    3. העתק את הרשימות של dat העברה(רשימה אחת לכל סרט) לקובץ Excel. ממוצע קורסי זמן העברה המתקבלים מכמה סרטים של חום המחוון דיי. צור בסיס בזמן אמת על ידי הכפלת מספר רציף תמונה על ידי 0.1. שמור את הקורס בממוצע זמן (שתי עמודות) לקובץ טקסט. הערה: לפני המיצוע, אם תרצה בכך, עלילה קורסי זמן הבודד, לדחות כל אי סדרים. ודא שהסרט כולל לפחות 5 שניות האחרונות של העברת מצב היציב של צבע המחוון.
  7. התחל Fit Matlab ההולם f P התכנית (הפנל 'מחוון Fit', איור 3) כדי לחשב את הפרמטרים השונים של קורס זמן osmolarity. הערה: על סמך הריכוזים ראשוניים וסופיים הידועים של הפתרון באמבטיה, במהלך הריכוז האוסמוטי המשתנה של הפתרון הזמן מחושבת מכמובן זמן ריכוז (מחושב, בתורו, מהעברת המחוון דיי), בהנחה שזה אחרי אותו דינמיקה כריכוז צבע. P f Fit הוא תכנית זמינה לשימוש ללא תשלום. ניתן להוריד 'PfFit_Installer_web.exe' מ: מדריך למשתמש Fit ו P 'עם הסברים והגדרות מפורטים נגיש דרך יופיטר כקובץ נוסף, אשר מסייע לקרא את המשתמש עם תכנית Fit ו P.
  8. בלוח המחוונים Fit ", לייבא את הנתונים של קורס הזמן הממוצע של העברת המחוון דיי (" קובץ מחוון נתונים ', איור 3 א) ולהכניס באופן ידני את הפרמטרים של הניסוי הנוכחיים וניחושים הראשוניים של' הרוחב 'הפרמטרים ו' t_half 'המתאר את מהלך ריכוז המחוון דיי (איור 3B הזמן. לחץ על' הפעלה 'כדי להציג את החלקות של הקורסים של ריכוז המחוון Dye הזמן (נתוני אמת ובכושר, איור 4 א), ושל האמבטיה הדגם (מחושבת) osmolarity (איור 4) הערה:. agכושר ood לנתונים הוא חיוני (המלצה: להתחיל עם הערכים שמוצגים באיור 3).

.6 קביעת f P באמצעות Fit f P תכנית התאמת Matlab

הערה: בנוסף להנחות הבסיסיות בכל קשור להתנהגות של protoplast כosmometer אמיתי ומושלם 11, הנחישות של f P נשענת על ההנחה כי f P עשויה להשתנות עם זמן, שזה דינמיקה של f P עומדת בבסיס הזמן במהלך שינוי נפח תא וכי שלושה פרמטרים יספיקו כדי לתאר את זה: fi P (הערך הראשוני של f P), סלופ Pf (שיעור השינוי ליניארי של f P) ועיכוב (בתקופה מההתחלה של האמבטיה שינוי osmolarity עד תחילת שינוי נפח התא). ניתן לבדוק מודלים שונים, כוללים שילובים שונים של פרמטרים אלה והערכים שלהם, ובכלל זה ערכי null 11. P f Fit מחפש את השילוב הטוב ביותר של פרמטרים אלה כדי להניב - ידי חישוב - השעתוק נאמן ביותר של קורס הזמן ניסיוני של שינוי נפח תא 11, מחושב, בתורו, מהסדרה המיובאות של אזורי תא קווי המתאר (ראה גם 'מדריך למשתמש Fit ו P' נוסף).

  1. לעבור לפנל 'נפח Fit' (איור 5). בחר ליבוא קובץ נתוני אזורים (קובץ הטקסט עם הקורס של 'האזורים' של protoplasts ניתח, איור 5 א זמן). בחר "מחוון האחרון התאמה 'כמקור הפרמטר (איור 5; לראות את' המדריך למשתמש Fit ו P 'לחלופות). הערה: פרמטרים אלו (איור 5D) משמשים לאחר מכן לחדש את שינוי osmoticum באמבטיה לכרכים הולם הליך.
  2. בלוח הנפח Fit '(איור 5 ג), לאתחל (למלא את הניחושים הראשוניים ל) הפרמטרים P f: f P, סלופ Pf ועיכוב (המלצה: להתחיל עם 1, 1, ו30, בהתאמה), בחר את המודל "כיתה" (המלצה: להתחיל עם II וסימן "המחאות עבור כל שלושת הפרמטרים כדי להיות מצוידות). לחץ על 'הפעלה', ואז גלגל עין דמות ביניים (איור 5E) ולהתאים את פרמטר העיכוב ואת אורכו של התקליט, במידת הצורך.
  3. לבחון את גרף תוצאות (איור 6) כדי להעריך את האיכות מתאימה ולרשום את השגיאה בכושר. לשנות את הפרמטרים האתחול כמה לקפל כל אחד, ומחדש'Run '. הערה: אל תתייאש כאשר התכנית נתקעה - רק להפעיל מחדש את התכנית!
  4. חזור על תהליך זה מספר פעמים, החל בשילובים שונים של פרמטרים אתחול, במטרה לערך הנמוך ביותר של השגיאה בכושר.
  5. העתק את הרשימה של התוצאות בכושר ישירות מהמסך, או למצוא אותם בtהוא PfFit שנוצר קובץ '_FIT_Vol_Results.txt'.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לקבוע את f P ולהשוות את הפעילות של AQPs שונה, protoplasts mesophyll מעלה ארבידופסיס משמש. protoplasts אלה נמצאו כבעלי רמות נמוכות בסיסי (רקע) f P 7 ויכול לשמש כמערכת תפקודית ביטוי כדי לאפשר מדידות f P לשחזור.

Protoplasts מעלה בוגר מצמח ארבידופסיס הישן 6 בשבוע שהיה מבודד ושלושה גן בונה עם גני AQP מארבידופסיס (AtPIP2; 1) ותירס (ZmPIP1; 2 וZmPI...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתואר כאן הוא תהליך פשוט ויעיל מאוד למדידת f P של protoplasts מפעל המבודד, החלים באופן עקרוני גם לתאים כדוריים אחרים, למשל., ביציות צפרדע 11. שיטה זו מבוססת על מדידת f P בתגובה לאתגר האוסמוטי לתא. בניגוד לשיטות האחרות המבוססות על גישה זו, עם זאת, השינוי של פתרונות, כלומר, של osmolarity, אינו מיידי, אלא הדרגתי, במהלך זלוף אמבטיה קבוע, החל מהתמיסה איזוטונית, שבו תא בסיס הנפח הוקם. בנוסף, שיטה זו אינה כרוכה בפיפטה יניקה ולכן ממזערת א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית הבלגית לfi המדעי ג המחקר (FNRS), האטרקציה הבינאוניברסיטאי הפולנים תכנית הבלגית המדע ומדיניות "Communauté Française דה Belgique-Actions דה Recherches Concertées" לFC, מהקרן הלאומית למדע בירושלים ( ISF) לMM (גרנט # 1311-1312), ולNM (גרנט # 1312-1312).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
KClChem-Impex International01247-1http://www.chemimpex.com
כל מקור, אנאלי. דרגה
CaCl2Merck11718006http://www.merck.com
כל מקור, אנאלי. דרגה
2-(N-מורפולין)-חומצה אתנולפונית (MESסיגמא15152002http://www.sigmaaldrich.com
כל מקור, אנאלי. דרגה
D-סורביטולסיגמא18032003http://www.sigmaaldrich.com
כל מקור, אנאלי. דרגה
צלולאזוורת'ינגטון, לייקווד, ניו ג'רזי, ארה"בLS002603http://www.worthingtonbiochem.com
פקטוליאזקרלן,                            Phonix, AZ, ארה"ב8006http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)Sigma81420http://www.sigmaaldrich.com
בקר סרום אלבומין (BSA)SigmaA9418-5Ghttp:// www.sigmaaldrich.com
פרוטאמין סולפטSigmaP4380http://www.sigmaaldrich.com
פולי-L-ליזיןSigmaP8920
http://www.sigmaaldrich.com קסילן ציאנולSigmaX4126http://www.sigmaaldrich.com
סיליקון שומן ואקום כבדMerck107921https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.? SecurePage=true& SEO_ErrorPageOccurred=נכון& קבצים מצורפים=CoA
מיקרוסקופ הפוך NikonEclipse TS100/TS100Fhttp://www.nikoninstruments.com
משאבת פריסטלטיתBIO-RADEP-1 Econo  Pumphttp://www.bio-rad.com
מצלמה דיגיטלית בגווני אפורScion CorporationCFW-1308Mhttp://www.scioncorp.com
>CMU 1394 תוסף מנהל התקן מצלמה עבור ImageJCarnegie Mellonhttp://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html
תוכנה חופשית
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
תוכנה חינמית
ערכת אביזרי משאבת שיפוע EconoBIO-RAD731-9006http://www.bio-rad.com
Connectors, סעפתDirectMedhttp://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html? ACTION=S
ערכות עירוי בורט (עמודות)צינורות http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 וולפורדIF-BR-001
TYGONR-3603http://www.usplastic.com
3M אריזה סקוטש טייפ 1'', שקוףViking Industrial, בריטניהVKMONO25http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8
כל סרט דבק שקוף (סלוטייפ וכו') סביר להניח שיהיה בסדר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
  2. Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227(2007).
  3. Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595(2008).
  4. Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
  5. Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
  6. Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
  7. Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
  8. Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
  9. Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
  10. Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
  11. Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
  12. Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
  13. Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
  14. Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377(2007).
  15. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
  16. Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
  17. Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ImageJMATLAB

מאמרים קשורים