פרוטוקול זה מתאר הליך לדגימה סדרתית של מח עצם הירך (BM) מבלי לדרוש הקרבה של עכברים. הליך זה מקל על מחקרי אורך של הרכב ה-BM של עכברים לאורך זמן ומספק גישה סדרתית לתאים בתוך ה-BM למחקרי ex vivo והשתלות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
דגימה סדרתית של ההרכב התאי של מח העצם (BM) היא הליך שגרתי קריטי להמטולוגיה קלינית. פרוטוקול זה מתאר נוהל טכני מפורט שלב אחר שלב להליך אנלוגי בעכברים חיים המאפשר אפיון סדרתי של תאים הקיימים ב-BM. הליך זה מקל על מחקרים שמטרתם לזהות נוכחות של תאים הניתנים באופן אקסוגני בתוך ה-BM של עכברים, כפי שנעשה במחקרי קסנוגרפט למשל. יתר על כן, הליך זה מאפשר שליפה ואפיון של תאים מועשרים ב-BM כגון תאי גזע ואב המטופויאטיים (HSPCs) ללא הקרבה של עכברים. בהתחשב בכך שההרכב התאי של הדם ההיקפי אינו משקף בהכרח את הפרופורציות והסוגים של תאי גזע ואב הנמצאים במח, הליכים המספקים גישה לתא זה מבלי לדרוש הפסקת עכברים מועילים מאוד. השימוש בשאיבת מח עצם עצם הירך מודגם כאן לניתוח ציטולוגי של תאי מח עצם, אפיון ציטומטרי זרימה של תא הגזע / האב ההמטופויאטי ותרבית של HSPCs ממוינים המתקבלים על ידי שאיבת BM עצם הירך בהשוואה לקציר מח עצם קונבנציונלי.
מבוא
כל תאי הדם נגזרים מתאי גזע המטופויאטיים (HSCs). נהלים המאפשרים גישה למח העצם (BM), האתר של הרוב המכריע של HSC בעכברים ובני אדם, מבלי לדרוש הקרבה של בעלי חיים, מספקים משאב לניטור מקור ההמטופואיזיס באופן סדרתי. המטרה הכוללת של ההליך המתואר כאן היא לספק פרוטוקול מפורט לדגימת תאי BM מעצם הירך של עכברים חיים, המספק חומר המייצג את התאים אשר יוחזרו על ידי קציר קונבנציונאלי של תאי BM באמצעות הקרבת העכברים. היתרון של הליך זה על פני קציר קונבנציונאלי של תאי BM הוא שהליך זה אינו דורש הקרבה של עכברים ולכן מאפשר מחקר אורך של תא מח העצם של עכברים לאורך זמן.
למרות שהליך שאיבת מח עצם זה של עכברים שימש במספר מחקרים ותואר בעבר (ראה Sundberg et al. לסקירה היסטורית1), נהלים רשמיים צעד-אחר-צעד הממחישים טכניקה זו לא פורסמו בעבר. פרוטוקול זה מאפשר דגימה סדרתית שגרתית של ה-BM למטרות כגון הערכת השתלה ב-BM של תאים שהוחדרו באופן אקסוגני לעכבר (כפי שנעשה במחקרי קסנוגרפט למשל2,3), ניתוח כימריזם ב-BM להשוואה לזה של הדם ההיקפי (כאשר התוצאות אינן בהכרח חופפות), ניטור שפע של סוגי תאים ספציפיים המועשרים בדרך כלל במח העצם כגון גזע המטופויאטי ותאי אב, ואחזור תאי BM לתרבית ex vivo ו/או השתלה. בנוסף, הערכת תכולת מח העצם עשויה להיות שימושית מאוד במודלים עכבריים של מחלה המטולוגית מכיוון ששאיפה מועילה בהערכת נטל המחלה ההמטולוגית בנקודות זמן בהן המחלה עשויה שלא להיות ניכרת בדם ההיקפי3-5. יתר על כן, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להעריך את התגובה של מחלה המטולוגית במח העצם לתרופות הניתנות במחקרים טיפוליים. לפיכך, ההליך המתואר כאן אידיאלי עבור חוקרים המעוניינים לקבל גישה לתאים המטופויאטיים של מח עצם מעכברים לצורך ניתוח ציטולוגי, ניתוח זרימה ציטומטרי, תרבית חוץ גופית ו/או מחקרי השתלה in vivo מבלי לדרוש הקרבה או פגיעה בעכברים.
פרוטוקול הדגימה של BM המתואר כאן דומה למדי לטכניקה המשמשת להזרקה תוך-ירכית של חומר ישירות לחלל מח העצם3,6. ההבדל העיקרי הוא שפרוטוקול זה מפרט את הליך הוצאת התאים מהמח בניגוד להחדרת חומר ישירות לחלל חלל מח העצם כפי שנעשה בהזרקה תוך ירך.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נהלי כל החיה שתוארו בפרוטוקול זה נערכו בהתאם להנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית (IACUCs) בשעה ממוריאל סלואן קטרינג במרכז הסרטן.
1. שאיפה של מח העצם (BM) תאים מעצם הירך
- להרדים את העכבר שיעבור שאיבת מוח עצם הירך עם isoflurane (1-4%) מנוהל עם מאדה דיוק. עומק ההרדמה צריך להיות במעקב כל דקות 5-10 לאורך כל ההליך על ידי התבוננות, כי אין שינוי בקצב נשימה הקשורים למניפולציה כירורגית ו / או אוזן, בוהן, וקמצוץ זנב. הרדמה מושרה עם isoflurane וגם נשמרה לאורך כל ההליך עם isoflurane. מנה טרום פרוצדורליים מנע של עצירות במינון של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם תת עורי כל שעות 6-12 יכול לשמש כדי למנוע כאבים הקשורים בהליך כadjunct לCarprofen.
- החל משחה העיניים לעיניים של האינדוקציה הבאה העכבר של הרדמה כדי למנוע התייבשות של קרנית.
- הפרווה נחתכה בקפידה מתוך שטח של עור כ 150% יותר מאשר באזור של אתר האיפה המיועדת. Loose פרווה מוסרת עם כרית גזה לחה. נא לשמור את העכבר על משטח במחזור מים חם או משטח תרמוסטטית נשלט בטוח אחר כדי למנוע היפותרמיה במהלך ההליך.
- לחטא את הרגל כולה המכילה את עצם הירך שתעבור שאיפה עם שלושה סטים של עלובי לסירוגין (לסירוגין עם שני povidone-יוד (פולידין) או כלורהקסידין (לשפשף Nolvasan) ו70% אלכוהול איזופרופיל או 70% ספוגים גזה ספוגות אתנול).
- הרטב 0.5 מיליליטר חפת מזרק (נפח: 0.5 סמ"ק; מד: 27.5 G) עם פוספט בופר סליין סטרילי (PBS) לפני aspirating BM. מלא את המזרק עם 200-500 μl של PBS ולגרש מייד את PBS. חזור על הליך זה לא 2-3עורכי שיטות קלט.
- שמור כפוף שוקה מעצם הירך על ידי לחיצה על עצם השוק עם או הקמיצה או האצבע החמישית. לאשר כי מטוס הרדמה מתאים הושג. המזרק מוחזק באמצעות האגודל והאצבע המורה. זה מאפשר condyles להיחשף ומקל על החדרת המחט.
- לאחר הרטבת המזרק, להכניס את המחט דרך גיד הפיקה, כך שהמחט נתקעה באופן מאובטח בין שני condyles של עצם הירך. על ידי החזקת diaphysis הקרוב לepiphysis של עצם הירך עם האגודל ואצבע המורה, המחט מוחדרת לתוך הפיר של עצם הירך בקלות.
- לסובב את המחט החוצה וכלפי מעלה, כך שהוא מקביל לפיר של עצם הירך. פעולה זו מאפשרת שליפה של תכני מח עצם מן פיר עצם הירך.
- הפעל את השעון ונגד כיוון שעון בזמן שהמחט דוחף אותו לאט לתוך חלל מח עצם הירך. לאשר את המיקום הנכון של המחט בעדינות על ידי נע סאיringe רוחבי.
- משוך בעדינות את בוכנת המחט לאחור, יוצר לחץ שלילי, ואילו הזזת המחט קדימה ואחורה בתוך חלל BM. הערה: הנפח של BM aspirated יהיה כ 5 μl אשר בדרך כלל מתאים ל0.4-0.8 x 10 6 תאים חד גרעיניים. שאיפה מוצלחת תאושר מבחינה ויזואלית על ידי הופעתו של דם בחלק העליון של המחט בבסיס של המזרק. אם אין דם נראה במזרק סביר להניח כי שבר עצם או רקמה קטן תקוע במחט. זו ניתן להסיר את המחט על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה ב-PBS (זו אחת סיבות למה המזרק צריך להיות prefilled עם PBS לפני aspirating BM). אם הרקמה לא ניתן וחילצה מן המזרק, להשתמש במחט ומזרק (שוב להרטיב את המזרק עם 200-500 μl של PBS) חדשות.
- ברגע שBM הוא להישאף בהצלחה מעצם הירך, להוציא את המחט והמזרק מעצם הירך והעכבר.
- הזז aspirated BM ליחסי ציבור צינור microfugeefilled עם 500 μl של PBS. עבור רוב היישומים, תאי BM אז צריכים להיות כל הזמן על קרח עד עיבוד נוסף במידת האפשר.
- לאחר השלמת ההליך, לנהל משכך כאבים עם carprofen 5 מ"ג / קילוגרם תת עורי. לאחר מכן להסיר את העכבר מההרדמה ומניח על משטח לוהט עד התאושש באופן מלא. הערה: לא צריך להיות שום סיבוך או מצוקה חווה בעקבות הליך השאיפה אם נעשה כראוי.
- לפני החזרת עכברים לאזור המגורים, לוודא שהם מסוגלים ambulate ולהגיע למזון ומים. שימו לב לעכברים סימנים של מצוקה או לאחר זיהום הליך בשעה 24 הבאה. סימנים כוללים: דימום בלתי פוסק, אנמיה, עייפות. אם כל אחד מהסימנים הללו נראים שלאחר הליך, בעלי החיים (ים) צריכים להיות מורדמים. הערה: שאיפת BM / דגימה ניתן לחזור אך ההליך חוזר צריכה להתבצע על הירך הנגדית כדי למנוע טראומה חוזרת ונשנית באותה הרגל. אין מידע זמין קטן לגבי frequency ניתן לבצע שאיפת BM. שאיבת מוח עצם הירך היא בדרך כלל חוזרת ונשנית לא בתדירות גבוהה יותר מאשר כל 2 שבועות.
2. הערכה של תוכן סלולארי בתאים להישאף BM
- גלולה תאים נאספו מאיפה בע"מ ומקום בצינור microfuge על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות בC o 4 או RT.
- לשאוב supernatant ואז resuspend את הכדור ב500 μl של חיץ תמוגה תא דם אדום ACK (מאגר תמוגה "אמוניום כלוריד, אשלגן").
- דגירה התאים במאגר תמוגה התא אדום עבור 10 דקות ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של PBS ומסובב את התערובת שוב XG 300 5 דקות בC o 4 או RT. הערה: גלולה lysed תאי דם האדומים עם החברה מורכבת מתאים מונונוקלארים BM. אלה יכולים להיות מושעים עבור מכתים FACS, ספירת תאים, השתלה, ניתוח cytospin ו / או כל שימוש אחר (בדיוק כמו תאי BM שנקטפו מעכברים הקריבו יהיו בשימוש).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שאיפת הירך BM של עכבר C57/B6 חי נוצלה להשיג תאים מונונוקלארים BM אחרי קציר BM הקונבנציונלי של אותו העכבר לאחר הקרבה. תאים מונונוקלארים BM מתקבלים על ידי שתי השיטות נותחו לאחר מכן על ידי (1) ניתוח ציטולוגית של תאי BM, (2) קביעת השכיחות היחסית של תאי גזע / אבות היווצרות הדם (HSPCs), ו (3) לשעבר vivo תרבות של HSPCs הממוין. בניסוי, Sca1 השושלת שלילית האחרון + c-KIT + תאים (LSK) מוינו מהתאים חד גרעיניים שהושגו על ידי שאיפה BM כמו גם מקציר BM קונבנציונלי. 150 תאי LSK מתקבלים על...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שאיפת BM סידורי היא הליך שגרתי קריטי לחקירה קלינית של הפרעות המטולוגיות בבני אדם. היכולת לבצע דגימה סידורי מקבילה של BM בעכברים לאפיון של ההרכב התאי ומרכיבים של BM לאורך כל ניסויים ממושכים היא גם יקר מאוד. הליך זה שימושי לאפיון של HSPC של מבלי להקריב את העכבר, אלא גם לגילוי הנוכחות של סוגים נוספים של תאים בBM במקרים שבם התוכן של הדם ההיקפי לא יכול להיות שיקוף של התאים המתגוררים בBM. שאיפת BM סידורי נעשתה שימוש יעיל מאוד למטרה מאוחר יותר בניטור נוכחותם של תאים אנושיים xenografted ל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
O.A.-W. נתמך על ידי פרס החוקר הקליני של NIH K08 (1K08CA160647-01), פרס עמית פוסט-דוקטורט של משרד ההגנה האמריקני בחקר אי ספיקת מח עצם (W81XWH-12-1-0041), תוכנית החוקרים של ג'וזי רוברסטון, ופרס החוקר הקליני של דיימון ראניון בתמיכת קרן אוון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| אלבומין סרום בקר | PAA | K41-001 | |
| ACK מאגר ליזה | תוצרת בית | ב-1 ליטר. התאם את ה-pH 7.2 ~ 7.4 ומסנן סטרילי עם 0.22 μ מסנן ואקום מ '. | |
| 8.3 גרם אמוניום כלוריד | פישר סיינטיפיק | A661-500 | |
| 1 גרם אשלגן ביקרבונט | פישר סיינטיפיק | P184-500 | |
| 200 μ l 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 מ"ל מזרק טוברקולין 27.5 גרם | Becton Dickinson | 305620 | |
| מסננת תאים סטרילית 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC: 66794-014-25 | |
| מחט קהה | Stemcell Technologies | 28110 | |
| מחט PrecisionGlide 23 גרם | בקטון דיקינסון | 305193 | |
| 3 מ"ל מזרק Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| צלחת מטופלת בתרבית רקמות, 6 באר | בקטון דיקינסון | 351146 | |
| שפופרות 12 x 75 מ"מ 5 מ"ל | Becton Dickinson | 352054 | FACS מכתים |
| 12 x 75 מ"מ צינורות 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים | Becton Dickinson | 352235 | FACS מכתים |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G ו-Ly-6C (Gr-1) APC-CY7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-CY7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-CY7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | לתרבית מתוצלולוזה |
| קרפרופן | סהר כימי חברה | C11045850 | מנה אחת (5 מ"ג/ק"ג) |
| ציטומטר זרימה, LSRמשחה וטרינרית | Dickinson Dickinson | ||
| (משחת עיניים סטרילית של פטרולאטום) | Dechra-US | 17033-211-38 |
מקורות
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
