מאמר שיטה

SIVQ-LCM פרוטוקול עבור מכשיר ArcturusXT

DOI:

10.3791/51662

⸱

23 ביולי 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SIVQ-LCM הוא גישה חדשנית שרותמת אלגוריתם מחשב, מרחבית הקבועים וקטור קוונטיזציה (SIVQ), לנהוג microdissection ללכוד לייזר התהליך (LCM). זרימת העבודה SIVQ-LCM משפרת באופן משמעותי את המהירות ודיוק של microdissection, עם יישומים בשני המחקר ומסגרות קליניות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SIVQ-LCM הוא מתודולוגיה חדשה לאוטומציה ומייעלת את התהליך מסורתי יותר, המשתמש תלוי לייזר לנתיחה. מטרתו ליצור טכנולוגיה מתקדמת, במהירות להתאמה אישית פלטפורמה לנתיחה בלייזר. בדו"ח זה, אנו מתארים את השילוב של תוכנת ניתוח התמונה מרחבית הקבועים וקטור קוונטיזציה (SIVQ) על גבי מכשיר ArcturusXT. מערכת ArcturusXT מכילה גם אינפרא אדום (IR) ואולטרה סגול לייזר (UV), המאפשר לתא ספציפי או ניתוחי שטח גדולים. המטרה העיקרית היא לשפר את המהירות, דיוק, ושחזור של נתיחת הלייזר כדי להגדיל את התפוקה לדוגמא. גישה חדשנית זו מאפשרת microdissection של שני רקמות אנושיות במחקר ובזרימות עבודה קלינית בבעלי חיים ו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שפותח במקור באמצע 1990, microdissection ללכוד לייזר (LCM) מאפשר למשתמש ללכוד בדיוק תאים ספציפיים או אזורים סלולריים מקטע רקמה היסטולוגית באמצעות הדמיה מיקרוסקופית 1, 2. מחקרים רבים השוו ניתוח מולקולרי של LCM לעומת שריטות רקמה להמחיש את הערך של 3-12 השיטה. בנוסף, ישנם שלושה פרסומי פרוטוקול וידאו בטכנולוגיה שזמינות לצפייה 13, 14. עם זאת, למרות הערך המוכח שלה, LCM יכול להיות מייגע ומפרך כאשר היעד של עניין הוא אוכלוסיית תאים מפוזרת בסעיף הטרוגנית רקמות, או כאשר מספר גדול של תאים נדרשים ליישומים במורד הזרם ספציפיים כגון פרוטאומיקה. הנטל שהוטל על המפעיל האנושי הוביל אותנו לפתח גישה לנתיחה אוטומטית למחצה לLCM על ידי שילוב של אלגוריתם ניתוח תמונה רב עוצמה כדי להנחות את תהליך LCM 15.

<כיתת p = "jove_content"> בשיתוף עם אוניברסיטת מישיגן, המעבדה שלנו בNIH האריכה את פותח בעבר ודיווח קוונטיזציה וקטור מרחבית בלתי משתנה אלגוריתם (SIVQ) באופן שיאפשר לה למחצה להפוך את תהליך הבחירה לרקמות פנימי ל מודרך microdissection, ובכך זמין כלי עם פתולוג או מדען חיים בראש. קוונטיזציה וקטור במרחב בלתי משתנה (SIVQ) היא אלגוריתם המאפשר למשתמש פשוט "לחץ" על תכונה היסטולוגית של עניין כדי ליצור וקטור טבעת (תכונת תמונה נשוא) שניתן להשתמש בם כדי לחפש את התמונה היסטולוגית כל, התאמה לסף הסטטיסטי צורך כ16-21. מפת החום כתוצאה מציגה את האיכות של משחקים לתכונת תמונת נשוא הראשונית ומומרת לאחר מכן לתוך צבע אחד מפת ביאור (אדום) שיכול להיות מיובאת לתוך מכשיר LCM. תוכנה אוטומטי הבחירה, AutoScanXT, לאחר מכן נעשה שימוש כדי לצייר מפה מבוססתבביאור של SIVQ מנחה את לכידתו של תאי היעד מן מדגם הרקמות. הפרוטוקול מפורט להלן מתאר את היישום של SIVQ לתוך העבודה microdissection.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר הועסק על פי כללי NIH על השימוש בדגימות רקמה אנושיות.

1. הכנת רקמה

  1. לפני ההתחלה, להשיג דגימות רקמה אנושיות על פי מוסדית מועצה לביקורת פרוטוקולים (IRB).
  2. בחר את סוג בלוק רקמה / תא ושיטת עיבוד מקביל [קבוע פורמלין פרפין, מוטבע (FFPE), קפוא, או קבוע אתנול (EFPE) פרפין, מוטבע]. קיבעון פורמלין מספק היסטולוגיה האופטימלית, ואחריו קיבעון אתנול ופלאש קפוא. עם זאת, שיטות עיבוד קיבעון ורקמה יכולות להשפיע על ה-DNA, RNA, וכמות חלבון ואיכות לניתוח מולקולרי במורד הזרם וצריכה להיחשב.
  3. חותכים את חלקי גוש רקמה / תא על סוג השקופית (זכוכית, זכוכית קרום, או קרום מסגרת מתכת) של בחירה. ניתוח SIVQ עובד באותה מידה בכל שלושת סוגי השקופיות. שים לב כי השיטה פסאודו coverslip (שיפורט להלן) עם xylenes ואיתןol לא יכול להתבצע על שקופיות קרום מסגרת מתכת מאז השקופיות חייבת להיות הפוכה על הבמה.
  4. בחר כתם רקמה כימי או מבוסס IHC כדי לזהות תאים של עניין מהרקע. שים לב ששיטות הצביעה יכולות להשפיע גם על DNA, RNA, ואיכות חלבון וכמות של הרקמה. בדוק את הרקמה לאחר הצביעה כדי להעריך את האיכות בסיסית של ביומולקולות לפני שתמשיך עם הפרוטוקול. SIVQ-LCM שבוצע בשקופיות רקמה / ציטולוגיה מוכתמת ב: אימונוהיסטוכימיה (IHC) עם 15 DAB, immunofluorescence, אדום מהיר, דה נובו אדומה, toluidine הכחול, וhematoxylin ו eosin (H & E) (נתונים שלא פורסמו).

2. דגימת הדמיה

  1. העומס מחליק על הבמה הממונעת של מכשיר microdissection ולהפעיל את התוכנה בנושא. בחר בתיבות הסימון כדי לייעד את עמדותיהם של השקופיות עמוסות ולהבטיח את קבצי תמונה שנתפסו הם יישמרו בפורמט jpeg.
  2. לייעל imאיכות גיל ידי כוונון הבהירות והמיקוד של התמונה על המסך, או באמצעות גלגל הפוקוס הידני או באמצעות התוכנה של המכשיר לנתיחה.
    1. שימוש בארגז הכלים של התמונה בתוך התוכנה של המכשיר לנתיחה, קבע את רווח בהירות המנורה ומצלמה כראוי. ערכי דוגמא הם בהירות = 60 ורווח = 220, עם המפזר.
    2. פוקוס באופן ידני או עם תכונת פוקוס אוטומטי בתוכנה.
  3. ללכוד תמונת סקירת תמונה ממוזערת של השקופית לספק מפת דרכים לתהליך הנתיחה.
    1. לקבלת איכות תמונה אופטימלית של שקופיות uncoverslipped, לנצל את המפזר מתחת למעבה על המכשיר, או, להוסיף כמות קטנה (~ 30 μl) של או אתנול או xylenes כדי לשפר את המדד עקשן (פסאודו coverslip). בעת השימוש בxylenes, להיות מודע שהם חייבים לשמש אמצעי בטיחות רעיל ותקין, ובכלל זה השימוש במנדף וחלוק מעבדה מגן, משקפי מגן עיניים, וכפפות.
    2. אין להניח את כובע LCM בשקופית עד פתרון אתנול או xylenes יש פינה או הפולימרים על המכסה יהיו מעוות לחלוטין.
  4. נווט בשקופיות ותמונות לכידתו של האזורים להיות גזורים ב10X, 20X, 40X או הגדלה. במידת צורך, לשפר את התמונה עם תוכנה כגון תיקון שגיאות אוטומטי (בתמונת מנהל Microsoft Office) כמתואר 22 בעבר. תמונות חייבת להיות בשבי בפורמט jpeg כדי לאפשר להם להיות מחדש מיובא לתוך תוכנת בחירה האוטומטית.

3. ניתוח האלגוריתם של התמונה

  1. העברת תמונות שנתפסו ממכשיר microdissection לתיקיית SIVQ. להתקין ולפתוח את חבילות תוכנת ArcturusXT, AutoScan וSIVQ במחשב המחובר למכשיר לנתיחה. לקבלת גישה לתוכנת SIVQ, אנא צור קשר עם ד"ר יוליסס Balis (ulysses@med.umich.edu).
  2. SIVQ להרחיב ולטעון את התמונה שצולמה (JPEG) של עניין.
  3. נווט לאזור של ריבית ו / או להתאים את גודל חלונות הראווה (Viewport 5 ו -6). בתוכנת SIVQ, Viewport 5 מראה את התמונה מראש העיבוד וViewport 6 מציג את התמונה לאחר עיבוד 16.
  4. בחר את הגודל של וקטור הטבעת ומספר הצלצולים לשמש.
  5. בחר בתכונת התמונה הנשוא להיות בשבי על ידי לחיצה ימנית על זה בViewport 6.
  6. לחץ על "סריקה" כדי לנתח את התמונה.
  7. התאם את ההסתברות הסטטיסטית של התאמת תמונה באמצעות שני ברים זזים. בר העליון מתאים את הספציפיות וקטור הכלליים, והוא משמש להוציא שטח מהסריקה הראשונית (עם רגישות כפי שהוגדר על ידי משתנה "Stat" נבחר) שעשוי לייצג שטח כלול מוגזם. לעומת זאת, את המחוון הנמוך מנוצל כדי להגביר את הרגישות, לאחר סריקה מתבצעת, מתוך הכוונה להגדיל את השטח שיסווג כמשחק. שני פקדי מחוון אלה UTIליזה משתנה "Stat" כסף רגישות בסיסית הראשוני.
  8. כדי לשמור את התמונה, לחץ על "שמירה בשם JPEG" (תמונה נשמרה כעת בתיקיית C :/ vq_test / תמונות).
  9. נתח את התמונה עם האלגוריתם. הפלט של ניתוח האלגוריתם צריך לגרום לתמונה מבוארת שזה יהיה בשימוש בSIVQ-LCM. נכון לעכשיו, הגרסה הנוכחית של מנוע ליבת SIVQ היא בבדיקת גרסת הבטא עם הציפייה כי הגרסה המלאה הייצור (Q1 זמין 2014) תשלב ערכת פיתוח תוכנה מלאה (SDK) וממשק תכנות יישומים (API) לשילוב פשוטים של מסננים המרחבי נוצר על ידי משתמש וצעדי עיבוד נתוני זרימת עבודה במורד הזרם עם מנוע התאמת טבעת הליבה. SDK זה יחולק עם סט של תיעוד מלא.
    1. ודא שHeatmap SIVQ משתנה לצבע אדום אחיד.
  10. לייצא את התמונה. זה חיוני כדי להטביע מחדש את קואורדינטות positional בעמ 'תמונת JPEG OST-ניתוח באמצעות עורך HEX כדי להדביק בכותרת הקובץ מתמונת מכשיר נתיחה המקורית. הנתונים המתאימים, ניתן למצוא בין "התחלה של תמונה" סמן (0xFF, 0xD8) ואת הסמן הראשון "הגדרת קוונטיזציה טבלה" (0xFF, 0xDB).

4. Microdissection

  1. מניחים את כובע LCM במרכזו של האזור של עניין, שבו התמונות שנתפסו לניתוח SIVQ.
  2. כיול ובקרת איכות (QC) לייזרי UV / IR ולייעל את הפרמטרים, ובם חשמל, משך זמן, מקומות לייזר, ומהירות חיתוך UV (כפי שהומלץ על ידי היצרן). לבצע כיולים אלה לפני מחדש יבוא התמונה מנותחת.
  3. AutoScanXT הפתוח (תוכנת בחירה אוטומטית) ולייבא את התמונה ניתחה מג :/ vq_test תיקייה / תמונות.
  4. לאמן את תוכנת בחירה האוטומטית להכיר בביאור SIVQ וליצור את המפה לנתיחה.
    1. כדי ליצור traiקובץ נינג, בחר ארבעה אזורים של עניין (בסימן "עיגולים כחולים") על "צבע אדום" של התמונה ניתחה SIVQ.
    2. בחר את אזורי הרקע (מסומנים על ידי "ריבועים אדומים") שלא להיות גזור.
    3. לחץ על הכפתור "נתח" כדי ליצור את קובץ אימון, אותו ניתן לשמור לשימושים שלאחר מכן.
  5. בצע microdissection באמצעות אינפרא אדום המתאים (IR) ו / או אולטרה סגול לייזרים (UV).
    1. העתק את האזורים שנבחרו על התמונה "בשידור חי".
    2. בארגז הכלים "microdissect", בחר בלכידת IR המתאימה או כפתורי חיתוך UV.
  6. לאחר הנתיחה הושלמה, להעביר את כובע LCM לתחנת QC וללכוד תמונה של רקמות / תאים גזורים. גישה נוספת היא למקם את הכובע על אזור ריק בשקופית לפני שתעביר אותו לתחנת QC, זה מאפשר למשתמש לצלם תמונות בהגדלות שונות.
  7. ללכוד תמונה של אזור הרקמה של עניין לאחר microdissection כדי להעריך עוד יותר מרים את יעילות.
  8. אם התאים הרצויים כבר ניתחו בהצלחה, לחץ על הכפתור "השלב הנוכחי" בתוכנת ArcturusXT ולהסיר את כובע LCM ליזום הליך המיצוי המולקולרי לניתוח במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קטע רקמת שד האנושי FFPE היה immunostained לcytokeratin AE1/AE3 באמצעות פרוטוקול IHC סטנדרטי 23. לאחר צביעה, שקופית הרקמה הוצבה על הבמה ArcturusXT ופרוטוקול SIVQ-LCM יזם כפי שתואר לעיל. מאז הרקמה לא ניתן coverslipped לmicrodissection, התאים + המוכתמים IHC יכולים להיות קשים להבחין באופן חזותי (איור 1 א). לכן, כדי לספק יותר טובה התאמת מדד ותמונה משופרת, xylenes נוספו לקטע הרקמה כדי ליצור פסאודו coverslip 15 (איור 1). תמונת JPEG ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול ליישום SIVQ-LCM לmicrodissect תאי האפיתל immunostained מרקמת שד אנושי FFPE. השימוש באלגוריתם ניתוח תמונה, כגון SIVQ, מפחית את הכמות של ידיים על הזמן הנדרש לתהליך microdissection. זוהי התקדמות חשובה פוטנציאלי עבור השדה מאז ומפעיל ומאמץ הוא בדרך כלל צעד שער הגבלה לנתיחה המדויקת של תאים של עניין. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מותאמים ספציפית ההליך שלנו למכשיר ArcturusXT, למרות שסביר להניח שניתן יהיה להתאים SIVQ ואלגוריתמים אחרים למכשירי microdissection זמינים מסחרי אחרים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיכאל ר Emmert-באק הוא ממציא על פטנטים שנערכו-NIH מכסים microdissection ללכוד לייזר ומקבל תשלומים מבוססי תמלוגים באמצעות תכנית העברת NIH הטכנולוגיה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נתמך בחלקו על ידי תכנית המחקר העירונית של המכונים הלאומיים לבריאות, המכון לאומי לסרטן, מרכז לחקר הסרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שקופיות זכוכית טעונות חיוביתThermo Scientific4951Plus-001
Xylenes, מגיב ACS, ≥ 98.5% קסילנים + בסיס אתילבנזן סיגמא אולדריץ'247642זהירות: אנא השתמש בנהלי בטיחות נאותים.
אלכוהול אתילי, הוכחת USP 200, נטול מיםחברת וורנר-גרהם6.505E+12זהירות: אנא השתמש בנהלי בטיחות נאותים.
Arcturus CapSure Macro LCM CapsLife TechnologiesLCM0211
ArcturusXT Laser Microdissection Instrument LifeTechnologiesARCTURUSXT
AutoScanXT SoftwareLife Technologiesתוכנית ניתוח תמונה אופציונלית עבור מכשיר המיקרו-דיסקציה בלייזר ArcturusXT. תוכנה זו נדרשת עבור SIVQ-LCM.
קוונטיזציה וקטורית קבועה מרחבית (SIVQ)אוניברסיטת מישיגןחבילת כלים זו זמינה לציבור לשיתופי פעולה אקדמיים. לקבלת גישה לאלגוריתם SIVQ, אנא צרו קשר עם ד"ר יוליסס באליס [Ulysses@med.umich.edu]

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  3. Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
  4. El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
  5. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
  6. Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
  7. Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
  8. Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
  9. Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
  10. Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48(2011).
  11. Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13(2009).
  12. Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711(2013).
  13. Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
  14. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
  15. Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19(2011).
  16. Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13(2011).
  17. Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
  18. Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
  19. Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
  20. Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37(2011).
  21. Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
  22. Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
  23. Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

JPEG

מאמרים קשורים