הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית

13.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51666

⸱

24 ביוני 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה של הדמיית תאים חיים באמצעות קרדיומיוציטים ראשוניים של חולדות לאחר התמרה לנטיוויראלית ואדנוויראלית באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב קונפוקלי. זה מאפשר תצפיות מפורטות על תהליכים תאיים בקרדיומיוציטים חיים.

תקציר

שריר לב בילוד חולדה העיקרית הם שימושיים בבסיסי במחקר לב וכלי דם במבחנה כי הם יכולים להיות מבודדים בקלות במספרים גדולים בהליך אחד. בשל התקדמות טכנולוגית מיקרוסקופ זה קל יחסית כדי ללכוד תמונות תא חיות לצורך חקירת אירועים הסלולר בזמן אמת בדאגה מינימאלית בנוגע phototoxicity לתאים. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקחת תמונות timelapse התא חיות של שריר לב בילוד חולדה העיקרית באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal הבא התמרה lentiviral וadenoviral לווסת את המאפיינים של התא. היישום של שני סוגים שונים של וירוסים עושה את זה יותר קל להשיג רמות שיעור התמרה והביטוי הולמות לשני גנים שונים. ניתן לקבל תמונות תא חיות גם התמקדו באמצעות מערכת פוקוס אוטומטי של מיקרוסקופ, אשר שומרת על מיקוד יציב לתקופות זמן ארוכות. יישום שיטה זו, תפקידיו של מהנדס אקסוגניחלבוני ed לידי ביטוי בתאים ראשוניים בתרבית ניתן לנתח. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש כדי לבחון את הפונקציות של גנים באמצעות siRNAs כמו גם של מאפננים כימיים.

מבוא

שריר לב בילוד חולדה עיקרי כבר מזמן משמש לחקירת תפקוד cardiomyocyte במבחנה 1. הם קלים לבודד מגורי חולדה על ידי מספר שיטות מבוססות היטב 2-4. השיטה הנפוצה ביותר מעסיקה collagenase או טריפסין לעיכול רקמת חיבור של הלב לפני בידוד תא. גם חוקרים פיתחו שיטות לבידוד שריר לב ממכרסמים בוגרים 5-8, כמו גם עכברי יילודי 9,10.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד שריר לב מגורי חולדה ילודים, העסקת הליך עיכול אנזים שני שלבים. טריפסין משמש ראשון O / N ב 4 ° C, ולאחר מכן collagenase מטוהר ב 37 ° C. דגירה של רקמת הלב עם O טריפסין / N ב 4 ° C מפחיתה את הצעדים הדרושים לתאי קציר בהשוואה לשיטות באמצעות incubations הרציף בפתרון אנזים חם 2. בנוסף, באמצעות שיתוף מטוהרllagenase ולא אנזימים גולמיים, ניתן לבטל את שונות הרבה להרבה, ובכך לספק שחזור משופר.

מחקרים תפקודיים של חלבון מסוים לעתים קרובות להעסיק מערכת ביטוי חלבונים באמצעות adenovirus 11-13 ו / או 14-16 lentivirus. [הערה אזהרה] הייצור והמניפולציה הנגיפי צריכים להתבצע על פי הנחיות NIH.

Adenovirus לא להשתלב בגנום המארח. יש לו יעילות גבוהה מאוד של התמרה ברוב סוגי תאים, כוללים תאים להתחלק ותאים שאינם מתחלקים, כמו גם תאים ראשוניים ושורות תאים הוקמו. זה הופך את adenovirus וקטור אמין על ביטוי גנים. רמות גבוהה של החלבון המקודד על ידי וקטור אדנו להתפתח בתוך 48 שעות הבאות התמרה, והם יכולים להימשך מספר שבועות 17. עם זאת, חסרון אחד לשימוש adenovirus לביטוי חלבון הוא כי הפיתוח של ADE רקומביננטיnovirus הוא גם מסובך וגוזל זמן. חסרון זה מסביר באופן חלקי מדוע חוקרים רבים היו פונים לlentiviruses לביטוי גני רקומביננטי. בניגוד למבני adenoviral, יצירת מבנה lentiviral היא מהירה וקל. למרות שיש לי lentiviruses בדרך כלל יעילות נמוכה יותר של התמרה מ adenoviruses, הן בתאים מתחלקים ולא החלוקה, הם להשתלב בגנום המארח. כתוצאה מכך, הביטוי של גן transduced הוא יציב יותר לlentiviruses מאשר לadenoviruses.

בשל התקדמות טכנולוגית בתחום של מיקרוסקופיה, זה הרבה יותר קל ללכוד תמונות תא חיות של תאים לבטא חלבונים רקומביננטיים. זה נכון גם במהירויות שיעור וידאו של רכישה. זה מאפשר לחוקר כדי לקבוע כיצד שינויים מסוימים בחלבון של עניין מבחינה תפקודית להשפיע על התאים בזמן אמת. יש מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב במספר תכונות שהופכים אותו טכניקה אופטימלית לליבתא דואר ההדמיה 18,19. הדיסק מסתובב Yokogawa מאפשר רכישת תמונה מהירה הרבה יותר, ואילו באותו הזמן ניצול הרבה פחות כוח מאשר לייזר המיקרוסקופים confocal סריקת נקודה. שתי תכונות מיוחדות אלה בשל דיסק ספינינג, המכיל חורי confocal רבים שדרכו הלייזר עובר בו זמנית לדגימות. במהלך רכישה, הדיסק עצמו מסתובב במהירות וברציפות 18-20. על ידי שימוש במערכת פוקוס אוטומטי של המיקרוסקופ, פוקוס יציב נשמר על פני תקופות זמן ארוכות. הדבר מאפשר לחוקרים לקחת תמונות תא חיות ממוקדות היטב. תמונות שנרכשו הם שיחקו בחזרה כקובץ סרט. התמונות נותחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כגון 21,22 ImageJ, פיג'י 23, או תוכנה זמינה באופן מסחרי אחרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בידוד של שריר לב בילוד חולדה

  1. השתמש במדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) ובינוני מינימום הכרחי (MEM) בתוספת סרום שור העובר (FBS) ופניצילין / סטרפטומיצין (P / S) כמדיום לתרבות. הוספת bromodeoxyuridine (BrdU) למדיום כדי למנוע צמיחה של fibroblasts עבור 2 הימים הראשונים שלאחר הבידוד.
בינוני בסיס FBS BrdU (מ"מ) P / S (U / ml)
בחירה DMEM 10% 0 20
היום הראשון DMEM 10% 0.1 10
למחרת DMEM / MEM 5% 0.1 10
תרבות נוספת DMEM / MEM 5% 0 10

טבלת 1:. בינוני לשריר לב בילוד חולדה השתמש את המדיה הזו לculturing שריר לב בילוד חולדה. DMEM / MEM הוא 1:1 תמהיל של DMEM ובינוני MEM.

  1. בידוד Cardiomyocyte, 1 יום (הערכת זמן הנדרש, על 1 שעות)
    הערה: לעבודה עם מכרסמים בילוד, עיין בהנחיות מקומיות אוניברסיטה וכללים שנקבעו על ידי תוכניות טיפול בבעלי חיים, ולדבוק בפרוטוקולים בבעלי חיים אישרו מוסדי. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי החיים במרכז המשאבים באוניברסיטת ייל.
    1. הכן את חומרים כימיים וכלים: הפתרון של האנק בסידן ומגנזיום ללא מאוזן מלח (CMF HBSS), 30 מיליליטר x 2, 10 מיליליטר X 2, על קרח; טריפסין 1 מ"ג, מחדש עם 2 מיליליטר של CMF HBSS, על קרח; autoclaved כלים; 70% אתנול (EtOH) ב250 כוס מיליליטר; ארבעה מעוקרים 10 צלחות פלסטיק סנטימטר, שלושה לבידוד של לב ואחד לtrypsinization.
    2. ליט 1 סדראה של גורי 1-to-2-בן יומו חולדה (כ -10 גורים) עם הסכר שלהם ממפיצי בעלי חיים ניסיוניים.
    3. Day1, העבר את הגורים לכלוב קטן ולהרדים סכר עם קוקטייל קטמין / xylazine (קטמין, 200ml/10g ו20ml/10g xylazine) ממנת יתר.
    4. קח את הגור אחד ולעקר את כל הגוף שלה עם EtOH 70%. לערוף גור עם מספריים כירורגיות חדים מתוחזק היטב על צלחת פלסטיק 10 סנטימטר מעוקר במיקום מבודד מגורים אחרים.
      הערה: על מנת לאסוף הדגימות מהר ככל האפשר, עדיף להשתמש בשיטה המהירה והיעילה ביותר להפסקת חייו של המכרסם. עריפת ראש, כאשר משתמשים בו כראוי על ידי אנשי מקצוע מיומנים עם ציוד מתוחזק היטב עלולה לגרום פחות פחד וחרדה לבעלי החיים ולהיות מהיר יותר ומעשי יותר מאשר צורות אחרות של המתת חסד. זה עולה בקנה אחד עם ההמלצות של הנחיות האיגוד האמריקנית לרפואת הווטרינרית להמתת החסד של בעלי חיים.
    5. הסר את מכותיואמנות עם כלים מעוקרים, ולשים לב ב30 מיליליטר קרח צונן CMF HBSS ב50 מיליליטר צינור חרוטי. הערה: הסר את הלבבות במהירות אפשרית ולשים אותם על קרח באופן מיידי. לאחר הסרת הלב מהגוף, צריכים להיעשות כל ההליכים על קרח.
    6. לאסוף 5 לבבות ב30 מיליליטר של קרח צונן CMF HBSS ו5 לבבות שנותרו ב30 מיליליטר נוסף של קרח צונן CMF HBSS. לערבל את הצינור כדי לשטוף את הלבבות. הערה: לאחר שלב זה, לבצע את כל ההליכים בזרימה למינרית.
    7. בטל supernatant ולהעביר את לבם לצלחת חדשה מעוקרת 10 סנטימטר פלסטיק על קרח. הערה: היזהר שלא לשאוב לבבות עם aspirator.
    8. הסר את כלי גדול ו / או רקמות לא רצויות. הוסף 10 מיליליטר של קרח צונן CMF HBSS לצלחת לשטוף את הלבבות.
    9. העבר את כל הלב לצלחת חדשה מעוקרת 10 סנטימטר פלסטיק על קרח. לרכך את לבם במספריים כדי פחות מ 1 מ"מ 3 על קרח.
    10. הוסף 9 מיליליטר של מצונן CMF HBSS. הוסף 1 מיליליטר של טריפסין reconsti המצונןtuted עם CMF HBSS (50 מיקרוגרם / מיליליטר סופי).
    11. חותם את הצלחת עם parafilm ולכסות אותו בנייר אלומיניום, ולאחר מכן למקם אותו בחדר קר (4 ˚ C) למשך לילה.
  2. בידוד Cardiomyocyte, יום 2 (הערכת זמן הנדרש, כ -4 שעות)
    1. ריאגנטים וכלים להכין: 50 מיליליטר חרוטי הצינור x 2; 2 מעכבי טריפסין מ"ג, מחדש עם 1 מיליליטר של CMF HBSS, על קרח; collagenase 1500 יחידות, מחדש עם 5 מיליליטר של ליבוביץ L-15, בטמפרטורת חדר (RT); ליבוביץ L-15, מחדש עם 1 ליטר מים מעוקרים ולסנן דרך פילטר 0.22 מיקרון, 8 מיליליטר ב RT; 10 מ"ג / מיליליטר BrdU (32.6 מ"מ) במים; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; שתי מנות תרבית תאי 10 סנטימטר פלסטיק; מנות תחתית כוס 3.5 סנטימטר.
    2. Day2, הכנת מאכלי ג'לטין מצופה. הוסף 1 מיליליטר של .0.1% פתרון ג'לטין למעייל צלחת תחתית זכוכית 3.5 סנטימטר לניסוי הדמיה. דגירה צלחות ב 37 ˚ C למשך מספר שעות, ולאחר מכן לשאוב וזורקים פתרון ג'לטין לפני השימוש.
      איןTE: צלחת זכוכית תחתונה 3.5 סנטימטר מתאים לניסוי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להפקת חלבונים משריר לב ראשוני כדי לזהות ביטוי חלבון על ידי מערבי סופג (WB), ניתן להשתמש בו מנות תרבית תאי 0.1% ג'לטין מצופים פלסטיק.
    3. להעביר את כל רקמת הלב מתעכל על ידי טריפסין הלילה עם חיץ לצינור חרוטי 50 מיליליטר על קרח בשכונה המעוקרת. הוסף 1 מיליליטר של מעכבי טריפסין בCMF HBSS (182 מיקרוגרם / מיליליטר סופי). סגור את המכסה של 50 צינור חרוטי מיליליטר בחוזקה על מנת למנוע זיהום.
    4. דגירה הצינור במשך כ30 דקות בחממה 37 ˚ C כדי לחמם את הרקמות וחיץ ל30-37 ˚ C. הוסף 5 מיליליטר של collagenase בליבוביץ L-15 (יחידה / מיליליטר 94 ​​סופי). לדגור על 37 ˚ C למשך דקות 45 עם עדינים רועד (שייקר סל"ד 170-200 ב37 C חממת ˚).
      הערה: שלב זה יכול להיעשות מחוץ לזרימה למינרית. צריכים לעשות את כל השלבים שלאחר מכן ב RT.
    5. לחטא את החלק החיצוני של צינור חרוטי 50 מיליליטר עם EtOH 70% ולשיםזה בשכונה המעוקרת.
    6. רקמות Triturate באמצעות פיפטה האוטומטית עם pipetting ב3 מיליליטר / השני של מהירות ל20 פעמים. לאפשר שאריות רקמה להתפשר על 3 דקות ולסנן את supernatant עם אממ מסננת תא 70.
      הערה: פיפטה מיליליטר רגילה גודל 10 יכולה לשמש לטחינה הדקה.
    7. הוסף 5 מיליליטר של ליבוביץ L-15 לגושי רקמה שנותרו וtriturate ולסנן את supernatant שוב. שטוף מסננת תא עם 2 מיליליטר של ליבוביץ L-15.
    8. הנח פתרון תא מסונן במכסת מנוע ל20-60 דקות, כדי לאפשר collagenase לעכל קולגן המושפל באופן חלקי.
    9. תאי משקעים בx גרם 100 למשך 5 דקות. Re-להשעות תאים ב20 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS ו-P ריכוז גבוה / S (20 U / ml).
    10. תאים טרום צלחת על שני מנות תרבית תאי פלסטיק 10 סנטימטר לשעה 1 בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C לבחירת cardiomyocyte. הערה: Fibroblasts לצרף בקלות רבה יותר לחלק התחתון של המנה מאשר שריר לב.
    11. מה עלי לעשותאיל ההמתנה, להכין DMEM המכיל 10% FBS, P / S (10 U / ml) ו0.1 מ"מ BrdU. הוסף 1 מיליליטר של 10 מ"ג / מיליליטר BrdU ל325 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS ו-P / S.
    12. מערבולת בעדינות מנות ולאסוף את supernatant cardiomyocyte המכיל משתי 10 מנות סנטימטר.
      הערה: רוב שריר הלב עדיין מרחף בsupernatant לאחר 1 שעות של דגירה. כדי להימנע מזיהום עם fibroblasts הקלילות מצורף למנה, לא אוסף את supernatant ידי pipetting.
    13. אופציונאלי> ספירת תאים בsupernatant עם ובלי 0.2% trypan הכחול כדי לבדוק את כדאיות תא.
    14. תאי משקעים בx גרם 100 למשך 5 דקות. Re-להשעות תאי DMEM המכילים 10% FBS, P / S (10 U / ml) ו0.1 מ"מ BrdU. פלייט תאים ב2 x 10 5 תאים / צלחת במאכלי ג'לטין מצופה זכוכית סנטימטר 3.5 תחתון להסתכלות באמצעות מיקרוסקופ. הערה: נא לא להפריע תאים לאחר ציפוי לפחות 24 שעות בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C.
    15. יום 3, צ'הnge 24 שעות בינוניות לאחר ציפוי לDMEM / ממ המכיל 5% FBS, P / S ו0.1 מ"מ BrdU.
    16. יום 4, שינוי 48 שעות בינוניות לאחר ציפוי לDMEM / ממ המכיל 5% FBS ו-P / S.
      הערה: שנה בינונית כל 2-3 ימים עם DMEM / ממ המכיל 5% FBS ו-P / S.

2. התמרה lentiviral

  1. אריזה של פלסמידים lentiviral
    הערה: אנא עיין במקורות אחרים לעוד מידע מעמיק בנושא זה 24-26. זה ייקח בערך 3 ימים כדי להכין את פתרון lentiviral. עדיף להשתמש בפתרון lentiviral טרי כדי להשיג יעילות התמרה גבוהה יותר. התחל האריזה של פלסמידים ובידוד של שריר לב בילוד חולדה במקביל lentiviral. במקום להשתמש polyethyleneimine (PEI) 27 לאריזה של פלסמידים lentiviral, ניתן להשתמש בם מגיב transfection זמין מסחרי. עקוב אחר ההוראות של היצרן.
    1. הכן את חומרים כימיים וכלים; HEKתאי 293T, 10 מנות סנטימטר פלסטיק תרבית תאים, פתרונות פלסמיד lentiviral (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, וקטור העברת lentiviral, 1.0 מ"ג / מיליליטר כל אחד), 1 גרם / ליטר PEI, בינוני סרום ללא, 20 מ"מ chloroquine במים, אקונומיקה 10%, SDS 1% בEtOH 70%
    2. יום 0, צלחת 2-2.5 תאי x 10 6 293T HEK לכל 10 סנטימטר צלחת היום לפני transfection.
      הערה: מפגש 30-60% בtransfection הוא אופטימלי.
    3. יום 1, הכנת פתרון transfection PEI. הוסף 30 ul של 1 גרם / ליטר PEI ל960 בינוני סרום ללא ul בצינור 1.5 מיליליטר. הוסף 4 פלסמידים לפתרון transfection PEI בצינור 1.5 מיליליטר, ולערבב עם הקשה.
    שמו של פלסמיד פתק גודל (KBP) נפח מוסף (מיליליטר) סכום סופי ב10 צלחת סנטימטר (מ"ג) ריכוז סופי בצלחת סנטימטר 10 (PM)
    וקטור העברת lentiviral מקודד גנטי כדי להיות ארוז 9-13 3.6-5.2 3.6-5.2 60
    pMDLg / pRRE מבטא GAG-HIV-1 / POL 8.8 1.76 1.76 30
    pRSV-Rev מבטא REV-HIV-1 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G מבטא VSV G 5.8 1.16 1.16 30

    טבלה 2:. הסכום של פלסמידים לאריזת lentiviral השתמש כמויות פלסמיד אלה transfect תאי HEK293 ב10 מנות סנטימטר. סכום סופי של וקטור העברת lentiviral לכל צלחת עשוי להיות שונה בהתאם לגודלה, לשמור על ריכוז סופי לכל צלחת ב60 PM. משקל מולקולרי הממוצע של זוג בסיס אחד מגדילי הדנ"א הכפול הוא 660 daltons.

    1. בטל מדיום ישןמ10 צלחת סנטימטר של תאי 293T HEK, ועדינות להוסיף 9 מיליליטר של מדיום חדש (DMEM + 10 FBS%, ללא P / S).
    2. הוסף תערובת PEI-DNA בעדינות טיפה חכם לצלחת ועדינות מערבולת לערבב עם מדיום. הוסף 10 ul של 20 chloroquine מ"מ (20 אום סופי) ל10 בינוני מיליליטר. הוא חשב chloroquine להפחית השפלה של מתחמי transfection המכיל פלסמיד באמצעות נטרול חלקי של ה-pH בתוך תאי lysosomal 28: הערה.
    3. דגירה בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ צלזיוס במשך 6 שעות. לאחר מכן, להסיר בינוני המכיל תערובת PEI-DNA ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום חדש (FBS +10% DMEM + 20 4 מ"מ - חומצה (2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), pH7.4 + P / S) . הערה: לאחר דגירה, וירוס יופק במדיום. טפטפות ו / או עצות aspirating פסטר יש לחטא באקונומיקת 10%. תמיד לטהר את שטח ארון בטיחות הביולוגי וציוד שעלול להיות מזוהם בEtOH 70% ללא קשר אם supernatant שנשפךאו לא. אם השפיכה התרחשה, טיהור יסודית עם 1% SDS בEtOH 70% היא הכרחית.
    4. יום 2-3, מדגיר CO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C ל48-72 שעות. יום 4, לאסוף פתרון lentiviral (המשך לסעיף 2.2).
      הערה: בינוני ניתן לשנות ב48 שעות לאחר transfection. איסוף supernatant וירוס 48 שעות ו72 שעות פעמיים יכול להשיג כדי להשיג פתרונות וירוס כייל גבוהים יותר.
  2. אוסף של פתרון lentiviral ותמרה
    1. הכן מגיב וכלים: צינורות מיליליטר חרוטי 15, 1 M HEPES, pH7.4 (0.22 אממ מסונן)
    2. יום 4, איסוף supernatant המכיל חלקיקי lentivirus (פתרון lentiviral) עם 10 מיליליטר מעוקר מזרק Luer-לוק, ואז לסנן את supernatant דרך 0.45 אממ לסנן לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. הוספה של 1 M HEPES pH7.4 1/100 נפח לפתרון מסונן lentiviral (סופי 10 מ"מ).
      הערה: לסינון, השתמש רק באס תאיתטייט או polyethersulfone (PES) (חלבון נמוך מחייב) מסננים. אין להשתמש במסנני ניטרוצלולוזה. ניטרוצלולוזה נקשר משטח חלבונים על מעטפת lentiviral והורסת את הנגיף.
    3. הסר בינוני מ3.5 מנות סנטימטר של שריר לב בילוד חולדה, המתקבלות בשלב האחרון של סעיף 1.2, להוסיף 1 מיליליטר של תמיסת lentiviral המסוננת למנת 3.5 סנטימטר.
    4. הוספת רומיד hexadimethrine (ריכוז סופי 4-6 מיקרוגרם / מיליליטר).
      הערה: ברומיד Hexadimethrine עשוי לשפר את יעילות התמרה lentiviral. הריכוז במתיל hexadimethrine צריך להיות מותאם.
    5. דגירה צלחת למשך 6 שעות בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C עבור התמרה lentiviral, ואז לשנות בינוני עד DMEM / MEM החדש המכיל 5% FBS ו-P / S. דגירה הצלחת בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C במשך 3 ימים.
      הערה: שילוב של גן אקסוגני לתוך הגנום המארח ידי lentivirus נחשב להסתיים עד 72 שעות.
    7. יום 7, השתמש בתאים מהצעד 2.2.5 לשלב הבא. הערה: ביטוי חלבון מפלסמיד lentiviral יכול להיות מאושר על ידי WB או immunocytochemistry (ICH) לאחר 48-72 שעות של התמרה על מנת לקבוע את הרמה היחסית הביטוי (איור 1 א ו ב 1).
  3. ריכוז של פתרון lentiviral
    הערה: עדיף להשתמש בפתרון lentiviral טרי על מנת להשיג יעילות התמרה הגבוהה ביותר, במקרה כייל פתרון lentiviral אינו גבוה מספיק, פתרון lentiviral יכול להיות מרוכזת על ידי פוליאתילן גליקול ממטרים (PEG) 29.
    1. הכנת פתרון 4x PEG (32% PEG6000, כלוריד 400 מ"מ נתרן (NaCl), 40 HEPES מ"מ pH7.4)
      1. ל125 פתרון מיליליטר 4x PEG, לשקול 40 גרם של PEG6000, ולאחר מכן לפזר אותו ב60 מיליליטר מים.
        הערה: הערה: (. כלומר משקל מולקולרי הממוצע של PEG6000 הוא 6,000) המספר לאחר PEG הוא המשקל המולקולרי הממוצע
        הערה: 2.3.1.2) לאט לאט להוסיף 10 מיליליטר5 M NaCl. לאט לאט להוסיף 5 מיליליטר של 1 M HEPES pH7.4. התאם ל-pH 7.4 באמצעות נתרן הידרוקסידי 2 M.
        הערה: 2.3.1.3) מוסיף מים עד ל125 מיליליטר. לעקר פתרון PEG 4x על ידי סינון קרום עם מסנן 0.22 אממ ולאחסן אותו בשעה 4 ˚ C.
    2. ריכוז Lentivirus
      1. lentiviral הסינון transduced supernatant לתוך צינור 50 מיליליטר חדש באמצעות מסנן 0.45 אממ.
        הערה: 2.3.2.2) פתרון 4x PEG הוספה 01:03 יחס (פתרון PEG: supernatant = 1:3). חנות ב 4 ˚ C ל16-48 שעות.
        הערה:) צנטריפוגה 2.3.2.3 ב2,600 x גרם ב 4 ˚ C למשך 30 דקות. בטל supernatant ו צנטריפוגות ב 2,600 x גרם ב 4 ˚ צלזיוס למשך 5 דקות.
        הערה: 2.3.2.4) בטל supernatant בזהירות כדי להימנע מלהפריע גלולה. גלולה מחדש להשעות במדיום סרום ללא שימוש 1/2 עד 1/25 נפח של supernatant המקורי הנפח.
        הערה: 2.3.2.5) השתמש במישרין או להקפיא באמצעות חנקן נוזלי לאחר מכן לאחסן ב -80 ˚ C

3. התמרה adenoviral

הערה: אנא עיין במקורות אחרים לשיטות לבנייה וההפצה של מבני adenoviral 13. טפטפות ו / או עצות aspirating פסטר יש לחטא באקונומיקת 10%. תמיד לטהר את שטח ארון בטיחות הביולוגי ושעשויים להיות נגוע ציוד עם EtOH 70% ללא קשר אם supernatant כבר נשפך. אם השפיכה התרחשה, טיהור יסודית עם 1% SDS בEtOH 70% היא הכרחית.

  1. טיטרציה adenoviral ידי 50% מינון זיהומיות תרבית רקמה (TCID 50)
    הערה: לפני התמרה, יש צורך לכיל את פתרון מניות adenoviral. 50 TCID הוא אחת השיטות הטובות ביותר כדי לכיל את הפתרון הנגיפי. בגלל השיטה מעריכה כייל ידי קיבולת זיהומיות לתאי HEK 293T, מחושבת 50 TCID משקף infectability בפועל של מניית adenovirus. PFU (חד יוצרי פלאקts) הוא פרופורציונאלי ל50 TCID עם מקדם של כ 0.56 30.
    1. הכן את התאים וכלים: תאי HEK 293T, צלחות תרבית תאי 10 סנטימטר, 96 היטב צלחת תרבית תאים שטוחה תחתונה, פיפטה רבת 8 ערוצים
    2. הכן את תאי 293T HEK מחוברות 70-90% במנת 10 סנטימטר אחד.
    3. בצע מראש דילול של 1/10 4 של מניית הווירוס. הוסף 50 ul של FBS +10% DMEM היטב בכל 96 היטב צלחת תרבית תאים שטוחה תחתונה. הוסף 25 ul של מניית הווירוס מראש מדוללת לשורה הראשונה, מ-A עד H.
    4. מערבבים היטב ולהעביר 25 ul מהשורה הראשונה של בארות לשורה השנייה עם פיפטה רבת 8 ערוצים. חזור על 1/3 הדילול של פתרון ויראלי לכל שורה של בארות עד וכולל שורת 11th וזורקים 25 ul האחרון.
    5. תאי 293T Triturate HEK ל10 מיליליטר של FBS +10% DMEM. הוסף 50 ul של פתרון תא לתוך באר כל אחד משורות 1 עד 12.
    6. דגירה תאים ב 37 ˚ C בחממת CO2 ל11-13 ימים. הוסף 50 ul של DMEM + 1FBS 0% אחרי 4-5 ימים ו7-8 ימים של ציפוי.
    7. למדוד את השפעות cytopathic בכל הטוב ב11-13 ימים שלאחר זיהום.
    נתיב 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    שורה ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    שורה ב ' ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    השורה C ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    השורה D ד ד ד ד ד ד ד
    שורת E ד ד ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    השורה F ד ד ד ד ד ד ד
    השורה G ד ד ד ד ד ד ד ד
    השורה H ד ד ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    מספר הבארות חיוביות בכל שורה 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    היחס של בארות חיוביות בכל שורה 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    ד מציג מעל השפעות cytopathic 50%
    מציג תחת 50% או ללא תופעות cytopathic

    ליין 1, דילול 3 1 x10 4; מסלול 2, דילול 3 2 x10 4; ...; מסלול 11, דילול 3 2 x10 11; נתיב 12, שליטה.
    S = הסכום של היחסים של בארות חיוביות בכל שורה
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0.75 +0.63 +0.25 +0.25 +0 = 8.875
    TCID 50 = 3 x 10 4 x 3 x (8.875-.5) = 2.97 x 10 8
    TCID 50 / מיליליטר = 5.94 x 10 9

    טבלה 3: דוגמא ל96 נגועים היטב צלחת לאחר דגירה 10 ימים למדוד את השפעות cytopathic היטב כל אחד ולסכם את היחסים של בארות חיוביות בכל שורה..

    1. חשב את כייל פי הנוסחה של Kaerber ביום 31.
    2. TCID 50 x = (דילול של הנתיב הראשון) (דילול) (S-0.5)
    3. S = הסכום של היחסים של בארות חיוביות בכל שורה
      הערה: לקבלת פרוטוקול זה, TCID 50 x = (30,000) (3) (S-0.5). בגלל 50 ul של פתרון ויראלי שימוש בפרוטוקול זה, יש לחלק 50 TCID ידי 0.05 לחשב TCID 50 / מיליליטר.
  2. התמרה adenoviral
    1. חישוב כמות הנדרשת של פתרון adenoviral מכייל (PFU / מיליליטר, חלקיקים נגיפיים / מיליליטר או TCID 50 / מיליליטר) שלה. השתמש בנוסחא לחישוב משרד הפנים (ריבוי של זיהום).
    2. em> [טבלת מקום 4 כאן]
    3. הוסף את הכמות מחושבת של פתרון וירוס למדיום סרום ללא (ראה לוח 5). מערבבים היטב דגירה עבור 20 דקות ב RT.
    4. em> [טבלת מקום 5 כאן]
    5. Day7, קח את המנה המתקבלת בשלב האחרון של סעיף 2.2, ולהחליף בינוני עם 750 ul של DMEM / MEM החדש המכיל 5% FBS ו-P / S.
      הערה: הפחתה של נפח בינוניבתמרה לכ -50% מהנפח המקורי הוא קריטי ליעילות התמרה גבוהה.
    6. הוספת פתרון וירוס מדולל לצלחת. דגירה הצלחת ל4-8 שעות בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C. לאחר מכן, להחליף עם מדיום חדש.
    7. דגירה צלחת ל24-48 שעות בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C. ביום 8-9, השתמשו בתאים לניסוי ההדמיה לחיות התאים. הערה: ביטוי חלבון מפלסמיד adenoviral יכול להיות מאושר על ידי WB או ICH לאחר 24-48 שעות של התמרה כדי לקבוע את רמת ביטוי חלבון יחסית (איור 1 ג'ו1D).

4. הדמיה תא חי

  1. רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב עם חדר בטמפרטורה מבוקרת ומערכת CO 2 סביבתית (אופציונלית)
    1. הפעל את מערכת בקרת הטמפרטורה בשעה לפחות 1 לפני הרכישה, כך שכל המכשירים לאזן ל37 ˚ C לפני תחילת רכישה. הפעל confocאל ספינינג מערכת מיקרוסקופ הדיסק (מחשב לתפעול, מיקרוסקופ, יחידת דיסק ספינינג, מצלמת CCD, לייזרים, מקור אור פלורסנט, מקור אור רגיל, שלב ממונע, ותריסים אוטומטיים).
      הערה: שעות יותר מ 1 היא הכרחיות כדי להשיג איזון טמפרטורה המלא של כל ההתקנים.
    2. השנה בינונית ב3.5 מנות תחתית כוס סנטימטר עד בינוני רצויים לרכישה, במידת צורך. מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב בחדר בטמפרטורה מבוקרת.
      הערה: בשל סטייה כדורית לתצפית אופטימלית על ידי שימוש במיקרוסקופ של צלחת זכוכית 3.5 סנטימטר תחתון עם מכסה זכוכית מס 1.5 (כ .16-0.19 מ"מ עובי) הוא אידיאלית. אם יש המטרה בשימוש צווארון תיקון, ניתן לתקן תמונות שהושגו עם משקפיים כיסוי עבים יותר 0.17 מ"מ. כמו כן, יש פנול אדום הקרינה קלה. לפעמים עדיף להשתמש במדיום פנול אדום חופשי, כגון DMEM ללא פנול אדום. אם אין מכשיר לשלוט CO 2 ריכוז על הבמה מיקרוסקופ, עדיף להשתמש CO 2 עצמאי בינוני או בינוני שנאגרו על ידי HEPES לזמן לשגות הדמיה לטווח ארוך.
    3. בחר את נתיב האור לעיניות.
    4. הפעל את התריס של מקור האור הבהיר השדה ב. התאם את המיקוד לתאים תחת המיקרוסקופ דרך העיני. הפעל את התריס ממקור האור הבהיר השדה.
    5. הפעל את התריס למקור אור הניאון על. מצא את התאים לבטא חלבוני ניאון מתחת למיקרוסקופ דרך העיני. הפעל את התריס ממקור אור הניאון.
    6. אופציונאלי> לחץ על לחצן הפעלה עבור מערכת הפוקוס המושלמת מול מיקרוסקופ כדי להפוך את מערכת הפוקוס המושלמת על מנת לשמור על מיקוד יציב במהלך רכישת הזמן לשגות.
    7. לשנות את נתיב האור למיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב. התאם את הגדרות לרכישה כראוי באמצעות תוכנת ההפעלה, בדיקת displa תמונותyed על המסך. (למשל פוקוס, כוח הלייזר, זמן חשיפה, עלייה במצלמת CCD ומחוץ לסט)
    8. הגדרות שנקבעו לרכישת תמונת הניאון באמצעות תוכנת הפעלה. לדוגמא: בחר באפשרות "שינוי ערוצים באמצעות נתיבי אור" ו "בערוץ 1: EGFP" לרכוש אות ניאון מEGFP לערוץ אחד.
    9. הגדר את התדירות בין נקודות זמן ידי קביעת הגדרות תצורת הזמן לשגות כדי לקחת זמן לשגות תמונות באמצעות תוכנת ההפעלה. לדוגמא: כדי לרכוש זמן נקודה אחת כל 5 דקות, בחר "דקות לכל נקודת זמן" מהתפריט הנפתח והזן 5 בשדה הטקסט.
      הערה: בחר באפשרות "מהירות מקסימלית" לעשות סרט במהירות בפועל. אם הביטוי של החלבון פלואורסצנטי הוא נמוך, הקרינה יכולה להלבין במהירות במהלך רכישת הזמן לשגות. במקרה כזה, עדיף להפחית את מספר נקודות זמן רכישה.
    10. הפעל את רכישת הזמן לשגות ידי לחיצה על "staכפתור RT "לרכוש תמונה ברצף.
      הערה: עדיף לא להשתמש בפונקצית רכישת מספר רב של נקודות. זה עלול לגרום לאובדן מיקוד או תנועה של שדה ההדמיה במהלך הדמיה הזמן לשגות.
  2. ניתוח של תמונות שנרכשו
    ניתן לשחק תמונות שנרכשה בחזרה כקובץ סרט ונותחו באמצעות תוכנת ניתוח: הערה.
    1. בחר את התמונות שנרכשו להיכלל בסרט. במידת צורך, אזורי יבול של ריבית מתמונות ובחר נקודות זמן מעניינות כדי להקטין את גודל קובץ של הסרט באמצעות תוכנת ההפעלה.
    2. יצוא תמונות כקובץ סרט בפורמט AVI או בפורמט MOV. בחר בפורמט סרט מתפריט הנפתח "פורמט" והעיתוי נדרש לסרט המוגמר, ולאחר מכן לחץ על "יצוא". הערה: זמן לשגות תמונות שנרכשו באחת בזמן נקודה יכולה להיות משחק חזרה כל 5 דקות כסרט ב10 פריימים לשניה, שהוא 3,000 פעמים מהר יותר מאשר מהירותה בפועל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להדגים את הטכניקה, EGFP lentivirus קידוד (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר) מתויג Cx43 (connexin43) או Cx43 מוטציה 32 שימש לבטא חלבונים מתויג EGFP בתאים, וקידוד adenovirus FGFR1DN (קולטן לגורם גדילה פיברובלסטים 1 שלילי דומיננטי ) שימש כדי לכבות את איתות FGF בתא 33-35. שלושה ימים לאחר הבידוד של שריר לב, שריר הלב המבודד היו transduced עם lentivirus כדי לבטא חלבונים מתויג EGFP בתאים. ואז אחרי 3 ימים של התמרה lentiviral, שריר הלב המבודד היו transduced נוסף עם קיד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

cardiomyocytes העיקרי מבודדת מחולדות בילוד כבר מזמן משמש ללמוד פונקציות cardiomyocyte במבחנה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד של שריר לב בילוד מגורי חולדה בשיטת עיכול אנזים שני שלבים, לעכל ראשון עם O טריפסין / N ב 4 ° C ולאחר מכן collagenase מטוהר. אחד יתרונות של העסקת צעד collagenase מטוהר הוא שאותה הכיתה של אנזים משמשת עבור כל הבידודים. לכן, את האיכות והכמות של תאים מבודדים היא עקבי מניסוי לניסוי.

בהתחשב ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לד"ר אלנגו ניאמאיאנטו ולד"ר אילזה טימרמן על עצותיהם לגבי אריזות לנטי-ויראליות. עבודה זו נתמכת על ידי מענק פיתוח מדענים של איגוד הלב האמריקאי 10SDG4170137.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מספריים לעריפת ראשWPI501749חיטוי לפני השימוש
1 מספריים עדינים לבידוד לב וקיצוץWPI14393חיטוי לפני השימוש
2 מלקחיים עדינים (דומונט מס' 5)סיגמאF6521חיטוי לפני השימוש
3 כלי פלסטיק מעוקרים 10 ס"מסיגמאCLS430165לבידוד לב
3.5 ס"מ תחתית זכוכית כלי תרבותMatTekP35G-1.5-20-Cלציפוי סופי של קרדיומיוציטים להדמיית תאים חיים עתידית. מיקרו-מנות מבית ibidi הן אלטרנטיבה מקובלת.
3.5 ס"מ כלי תרבות תחתית זכוכיתMatTekP35G-0.17-14-Cלתמונה TIRF או
תמיסת אתנול ברזולוציה גבוהה, 70% (v/v) במיםSigmaE7148
2% ג'לטיןSigmaG1393
1 צלחת פלסטיק מעוקרת 10 ס"מSigmaCLS430165לטריפסיניזציה
רדיד אלומיניוםכל מותג
ParafilmSigmaP7543
שני כלי תרבית תאי פלסטיק 10 ס"מSigmaCLS430165לבחירה
AutopipetteDrummond Scientific4-000-300לטריטורציה
מונה
צלומטר, מונה תאים אוטומטיnexcelomלבדיקה וספירת תאים
מיקרוסקופ והמטוציטומטרכל מותגלבדוק ולספור תאים
תמיסה כחולה טריפאן, 0.4%invitrogen15250-061
CO2 אינקובטורSanyoMCO-19AIC
דגירה שייקר אורביטליסיגמאZ673129לנער רקמת לב עם קולגנאז ב-37 מעלות; C ב-170-200 סל"ד
10 מ"ג/מ"ל תמיסת BrdUBD Pharmingen550891
DMEM, גלוקוז גבוהinvitrogen41965039ערבוב בינוני כפי שמצוין בפרוטוקול ולחמם לפני השימוש
MEMinvitrogen31095029לערבב בינוני כפי שמצוין בפרוטוקול ולחמם לפני השימוש
סרום בקר עובריinvitrogen26140079
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל) invitrogen15140-122
סעיף 2 התמרה
3 אריזת פלסמידים
pMDLg/pRREAddgene12251
pRSV-RevAddgene12253
pMD2.GAddgene12259
וקטור ההעברה הלנטי-ויראלי, pLVX-IRES-PuroClontech632183
Opti-MEM (מדיום נטול סרום)invitrogen31985070
מגיב
פוליאתינימין" Max", (40,000 MW) - PEI ליניארי בעוצמה גבוהה (שווה ערך ל-25,000 MW בצורת בסיס חופשי) Polysciences24765-2ניתן להחליף אותו ב-X-tremeGENE 9 מבית Roche
X-tremeGENE 9Roche6365779001תחליף ל-PEI כמגיב טרנספקציה
כלורוקוויןסיגמאC6628להתמוסס במים וליצור תמיסת מלאי של 100 מ"מ. ניתן להשיג עיכוב של החמצה אנדוזומלית עם 10-100 μ מ כלורוקווין.
HEPESSigmaH3375
10 מ"ל מזרק Luer-Lok, BD מעוקר309604
0.45 μ m מסנניםSigmaF8677השתמש רק במסנני אצטט תאית או פוליאתרסולפון (PES) (קשירת חלבון נמוכה). אל תשתמש במסנני ניטרוצלולוזה. ניטרוצלולוז קושר חלבונים על פני השטח על המעטפת הלנטי-ויראלית והורס את הנגיף.
Hexadimethrine bromideSigmaH9268ממיסים במים ויוצרים תמיסת מלאי של 8 מ"ג/מ"ל, ולאחר מכן מסננים אותה לעיקור.
פוליאתילן גליקול 6,000סיגמא81260
נתרן כלוריסיגמאS9888
נתרן הידרוקסידסיגמאS5881
סעיף 3 טרנסדוקציה
תאי HEK 293T ATCCCRL-11268
כ-10 ס"מ כלי תרבית תאיםסיגמאCLS430165
96-באר מיקרופלייט עם מכסה, תחתית שטוחה, תרבית רקמות,בז BDסטרילי 353072לטיטרציה
פיפטה רב ערוצית, 10-100 μ l, 8 ערוציםeppendorf3122 000.035
סעיף 4 הדמיית
מסתובב מיקרוספופי קונפוקליPerkinElmerL7267000
תא מבוקר טמפרטורהכל מותגכדי לשמור על טמפרטורה של 37 מעלות; C
A CO2 מערכת סביבתיתכל מותגאופציונלי לשמירה על ריכוז CO2 אופטימלי
CO2 מדיום עצמאי, ללא גלוטמיןinvitrogen18045-054   להדמיה דולג זמן ארוך
DMEM, גלוקוז גבוה, HEPES, ללא פנול אדוםinvitrogen21063-029להדמיה ארוכת טווח
תאיםלנטיוויראליתטרנספקציהאדנו-ויראליתתאים חיים דיסק

מקורות

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

טרנסדוקציה אדנו-ויראליתדימוי במרווחי זמן (Time-Lapse)פרוטוקול בידוד תאיםחלבון מתויג ב-EGFPFGFR דומיננטי-שליליצלחות עם תחתית זכוכיתמערכת מיקוד אוטומטי (Autofocus)
ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.