שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא <30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
שיטות בידוד המיטוכונדריה שתוארו קודם לכן באמצעות צנטריפוגה ההפרש ו / או צנטריפוגה שיפוע Ficoll דורשות 60 עד 100 דקות כדי להשלים. אנו מתארים שיטה לבידוד המהיר של המיטוכונדריה מביופסיות של יונקים באמצעות Dissociator רקמה מסחרי וסינון ההפרש. בפרוטוקול זה, הומוגניזציה ידנית הוחלפה במחזור הומוגניזציה הסטנדרטי של Dissociator הרקמה. זה מאפשר למדים ולתפעול עקבי של רקמה שאינה מושגת בקלות עם הומוגניזציה ידנית. בעקבות ניתוק רקמות, homogenate מסונן דרך מסנני רשת ניילון, אשר מבטלים צעדי צנטריפוגה חוזר על עצמו. כתוצאה מכך, בידוד המיטוכונדריה יכול להתבצע בפחות מ 30 דקות. פרוטוקול בידוד זה תשואה של כ 2 x 10 10 מיטוכונדריה מוסמכת קיימא ונשימה מ0.18 ± 0.04 גרם דגימת רקמה (משקל רטובה).
מבוא
מיטוכונדריה קיימת בכל תא ותא בגוף מלבד תאי דם אדומים ומעורבים במספר רב של תהליכים תאיים וחילוף חומרים חשובים 1-4. בגלל פונקציות רבות אלה, נזק המיטוכונדריה יכול להיות השפעות מזיקות 3. על מנת לחקור מספר שיטות בידוד המיטוכונדריה פונקציה ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה תוארו. החשבונות הראשונים שפורסמו ממועד בידוד המיטוכונדריה ל1940s 5-8. הניסיון המתועד הראשון הפגין בידוד המיטוכונדריה על ידי שחיקה רקמת כבד במכתש ואחריו צנטריפוגה בתמיסת מלח במהירות נמוכה 5,8. מאוחר יותר, קבוצות אחרות הרחיבו בעניין ההליך המקורי והפגינו חלוקה רקמות מבוססת על צנטריפוגה ההפרש 6-8. שיטות המוקדמות אלה היו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הכנה
- הכן 1 M K-HEPES מלאי פתרון (כדי להתאים את pH 7.2 עם KOH).
- הכן 0.5 M K-EGTA מניות פתרון (כדי להתאים את pH 8.0 עם KOH).
- הכן 1 M KH 2 PO 4 פתרון מניות.
- הכן 1 M MgCl 2 מניות פתרון.
- הכן homogenizing מאגר 300 סוכרוז מ"מ, 10 מ"מ K-HEPES, ו1 מ"מ K-EGTA (pH 7.2). חנות ב 4 ° C..
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דמות מתארת את הצעדים פרוצדורליים בבידוד של המיטוכונדריה באמצעות ניתוק רקמות וסינון ההפרש מוצגת באיור 1. זמן פרוצדורליים סה"כ הוא פחות מ 30 דקות.
דגימות רקמה התקבלו באמצעות ביופסית 6 מ"מ. משקל רקמה היה 0.18 ± 0.04 g (משקל רטוב). מספר המיטוכונדריה מבודדת כפי שנקבע על ידי ספירת חלקיקים בגודל היה 2.4 x 10 10 ± 0.1 x 10 10 מיטוכונדריה לשרירי שלד ו2.75 x 10 10
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי לבודד בהצלחה מיטוכונדריה תוך שימוש בפרוטוקול זה הוא חיוני כדי לשמור על כל הפתרונות ודגימות רקמה על קרח כדי לשמור על יכולת קיום של המיטוכונדריה. גם כאשר שמר על קרח, מיטוכונדריה המבודדת תפגין ירידה בפעילות תפקודית לאורך זמן 19. אנו ממליצים שכל הפתרונות והתוספות להיות מוכנים מראש. אנחנו טרום לשקול ולאחסן Subtilisin ב4 aliquots מ"ג ב1.5 מ"ל צינורות microfuge ולאחסן אותם ב-20 מעלות צלזיוס. באופן דומה BSA נשקל מראש ולאחסן ב20 aliquots מ"ג ב1.5 מ"ל צינו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
טופלו כל בעלי החיים בהתאם להנחיות מוסדיות הנוכחיות. אין לנו אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי לאומי ללב, ריאות ודם מכון גרנט HL- 103,542, וTrailblazer פרס נכבד BCH הרדמת המחקר של הקרן לCAP.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סוכרוז | סיגמא אולדריץ' | 84100 | |
| HEPES | סיגמא אולדריץ' | H4034 | |
| EGTA | סיגמא אולדריץ' | E4378 | |
| סוסטילסין A | סיגמא אולדריץ' | P5380 | |
| BSA | סיגמא אולדריץ' | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1,000 ערכת בדיקה | Perkin Elmer | ||
| 50 מ"ל צינורות חרוטיים | BD | 352098 | |
| 40 μ m מסנני ניילון | BD | 352340 | |
| GentleMACS C שפופרת | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 מ"ל שפופרת Eppendorf | פישר סיינטיפיק | 05-408-129 | |
| 6 מ"מ ביופסיה אגרוף | Miltex | 33-36 | |
| 10 μ m Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| צנטריפוגה אפנדורף 5415C | מרשל סיינטיפיק | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| צלחות 96 בארות, תרבית רקמות מטופלות | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 שייקר אורביטלי | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 היברידי Multi-Mode קורא מיקרופלייט | BioTek | ||
| Multisizer 4 קולטר מונה | בקמן קולטר | A63076 | |
| מערכת Oxytherm | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
מקורות
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.
