מאמר שיטה

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

39.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51682

⸱

6 בספטמבר 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא <30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.

תקציר

שיטות בידוד המיטוכונדריה שתוארו קודם לכן באמצעות צנטריפוגה ההפרש ו / או צנטריפוגה שיפוע Ficoll דורשות 60 עד 100 דקות כדי להשלים. אנו מתארים שיטה לבידוד המהיר של המיטוכונדריה מביופסיות של יונקים באמצעות Dissociator רקמה מסחרי וסינון ההפרש. בפרוטוקול זה, הומוגניזציה ידנית הוחלפה במחזור הומוגניזציה הסטנדרטי של Dissociator הרקמה. זה מאפשר למדים ולתפעול עקבי של רקמה שאינה מושגת בקלות עם הומוגניזציה ידנית. בעקבות ניתוק רקמות, homogenate מסונן דרך מסנני רשת ניילון, אשר מבטלים צעדי צנטריפוגה חוזר על עצמו. כתוצאה מכך, בידוד המיטוכונדריה יכול להתבצע בפחות מ 30 דקות. פרוטוקול בידוד זה תשואה של כ 2 x 10 10 מיטוכונדריה מוסמכת קיימא ונשימה מ0.18 ± 0.04 גרם דגימת רקמה (משקל רטובה).

מבוא

מיטוכונדריה קיימת בכל תא ותא בגוף מלבד תאי דם אדומים ומעורבים במספר רב של תהליכים תאיים וחילוף חומרים חשובים 1-4. בגלל פונקציות רבות אלה, נזק המיטוכונדריה יכול להיות השפעות מזיקות 3. על מנת לחקור מספר שיטות בידוד המיטוכונדריה פונקציה ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה תוארו. החשבונות הראשונים שפורסמו ממועד בידוד המיטוכונדריה ל1940s 5-8. הניסיון המתועד הראשון הפגין בידוד המיטוכונדריה על ידי שחיקה רקמת כבד במכתש ואחריו צנטריפוגה בתמיסת מלח במהירות נמוכה 5,8. מאוחר יותר, קבוצות אחרות הרחיבו בעניין ההליך המקורי והפגינו חלוקה רקמות מבוססת על צנטריפוגה ההפרש 6-8. שיטות המוקדמות אלה היוו את הבסיס לטכניקות הנוכחיות אשר לעתים קרובות לשלב הומוגניזציה, ו / או צנטריפוגה ההפרש 9-15. מספר homogenizatiובצנטריפוגה צעדים משתנה בין פרוטוקולים. צעדים חוזרים ונשנים אלה להגדיל את הזמן לבידוד המיטוכונדריה וסופו של דבר להפחית את הכדאיות. בנוסף, הומוגניזציה ידנית יכולה לגרום לתוצאות נזק ועולה בקנה אחד המיטוכונדריה אם לא מבוקרת 10,16 כראוי.

לאחרונה, השתמשנו צנטריפוגה הומוגניזציה וההפרש לבודד את המיטוכונדריה להשתלה לרקמת שריר לב 17,18. הליך בידוד ממושך זה נדרש כ 90 דקות והיישום הקליני של שיטה זו היה אפוא מוגבל. כדי לאפשר שימוש טיפולי אקוטי בטיפול קליני וכירורגים שפיתחנו הליך בידוד המיטוכונדריה מהיר שניתן לבצע בפחות מ 30 דקות.

היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם כי ניתוק רקמה סטנדרטי מאפשר למדים ולתפעול עקבי של רקמה שאינה מושגת בקלות עם הומוגניזציה ידנית. בadditיון, השימוש בסינון ההפרש במקום של צנטריפוגה ההפרש מבטל זמן רב וצעדי צנטריפוגה חוזר על עצמו ומאפשרים לבידוד מהיר יותר של מיטוכונדריה המוסמכת נקיה במיוחד, בת קיימא ונשימה.

היכולת לבודד מיטוכונדריה המוסמכת קיימא ונשימה בפחות מ 30 דקות מאפשרת ליישום קליני. יש פרוטוקול בידוד זה פוטנציאל לשימוש בניתוח מעקפי השתלה (CABG) ונהלים טיפוליים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הכנה

  1. הכן 1 M K-HEPES מלאי פתרון (כדי להתאים את pH 7.2 עם KOH).
  2. הכן 0.5 M K-EGTA מניות פתרון (כדי להתאים את pH 8.0 עם KOH).
  3. הכן 1 M KH 2 PO 4 פתרון מניות.
  4. הכן 1 M MgCl 2 מניות פתרון.
  5. הכן homogenizing מאגר 300 סוכרוז מ"מ, 10 מ"מ K-HEPES, ו1 מ"מ K-EGTA (pH 7.2). חנות ב 4 ° C..
  6. הכן סוכרוז 250 מ"מ נשימת הצפת, 2 מ"מ KH 2 PO 4, 10 מ"מ MgCl 2, 20 מ"מ K-HEPES חוצץ (pH 7.2) ו0.5 מ"מ K-EGTA (pH 8.0). חנות ב 4 ° C..
  7. הכן 10x PBS מלאי פתרון על ידי המסת 80 גרמו של NaCl, 2 גרם של KCl, 14.4 גרם של Na 2 HPO 4, ו2.4 גרם של KH 2 PO 4 לH 1 ליטר מזוקק פעמיים 2 O (pH 7.4).
  8. הכן PBS 1x ידי pipetting 10x מ"ל 100 PBS לתוך H 1 ליטר מזוקק פעמיים 2 O.
  9. הכן מלאי Subtilisin על ידי שקילת 4 מ"ג של Subtilisin בלצינור 1.5 מ"ל microfuge. אחסן ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  10. הכן מלאי BSA על ידי שקילת 20 מ"ג של BSA לתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge. אחסן ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

בידוד מיטוכונדריאלי (איור 1)

  1. מייד לפני הבידוד, לפזר Subtilisin ב 1 מ"ל של homogenizing הצפת.
  2. מייד לפני הבידוד, לפזר BSA ב 1 מ"ל של homogenizing הצפת.
  3. לאסוף שתי דגימות רקמה טריות באמצעות אגרוף 6 מ"מ דגימת ביופסיה וחנות ב1x PBS בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
  4. העבר את שני 6 האגרופים מ"מ של רקמה לצינור C ניתוק המכיל 5 מ"ל של קר כקרח homogenizing הצפת.
  5. Homogenize הרקמות על ידי התאמת צינור C ניתוק על Dissociator הרקמה ובחר את המחזור שנקבע מראש המיטוכונדריה הבידוד (60 הומוגניזציה שניות).
  6. הסר את צינור C הניתוק לדלי קרח.
  7. הוסף 250 μl של Subtilisin מלאי פתרון לhomogenate, מערבב על ידי היפוך ודגירת homogenate על קרח עבור 10 דקות.
  8. מניחים מסנן רשת 40 מיקרומטר על צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ומראש רטוב המסנן עם homogenizing הצפת ולסנן homogenate לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
  9. הוסף 250 μl של מוכן טרי BSA מלאי פתרון לתסנין ומערבבים על ידי היפוך.
    הערה: השמט שלב זה אם נדרש נחישות חלבון המיטוכונדריה.
  10. מניחים מסנן 40 מיקרומטר על צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ומראש רטוב המסנן עם homogenizing הצפת ולסנן homogenate לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
  11. מניחים מסנן 10 מיקרומטר על צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ומראש רטוב המסנן עם homogenizing הצפת ולסנן homogenate לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
  12. העבר את התסנין לשני 1.5 מ"ל צינורות microfuge מראש צונן צנטריפוגות ב 9,000 XG 10 דקות ב4 ºC.
  13. הסר supernatant מחדש להשעות ולשלב כדורים ב 1 מ"ל של קרח נשימת מאגר קר.

ATP Assay

הערה: כדי לקבוע את הפעילות המטבולית של מיטוכונדריה המבודדת assay הארה ATP יכול להתבצע באמצעות ערכת assay ATP. הפרוטוקול, חומרים כימיים ותקנים סופקו בערכת assay. סיכום של ההליך מתואר להלן.

  1. לאזן ריאגנטים ערכה לRT.
  2. הכן 10 מ"מ ATP מלאי פתרון על ידי המסת גלולה ATP lyophilized ב1,170 μl מים מזוקקים פעמיים. לאחסן ATP פתרון סטנדרטי צילומים ודגימות של המיטוכונדריה מוכנות על קרח.
  3. הוסף 5 מ"ל של תמיסת מצע הצפת לבקבוקון של פתרון מצע lyophilized. מערבבים בעדינות ומניח בחושך.
  4. הוספה של נשימת הצפת 100 μl לכל הבארות של חלק תחתון שחור, אטום, 96 צלחת גם.
  5. הוסף 10 μl של המיטוכונדריה מהדגימות מוכנות היטב כל oשחור fa, תחתון אטום, 96 צלחת גם. הערה: דוגמאות הם מצופים בשלושה עותקים. כולל שורה לסטנדרטים ושלוש בארות לביקורת השלילית (נשימת הצפת).
  6. הוסף 50 μl של פתרון תמוגה תא של יונקים לכל הבארות, לרבות תקנים ובקרות.
  7. דגירה את הצלחת על 37 ºC למשך 5 דקות על שייקר מסלולית ב125 סל"ד.
  8. במהלך הדגירה להכין סטנדרטים ATP בריכוזים של 0.1 מ"מ, 0.05 מ"מ, 0.01 מ"מ, 0.005 מ"מ, 0.001 מ"מ, ו0.0001 מ"מ ATP מ10 מ"מ ATP מלאי הפתרון. סטנדרטים חנות על קרח.
  9. לאחר הדגירה, להוסיף 10 μl של תקני ATP למתאימים בארות כמצוין במפת הצלחת. הערה: תקנים מבוצעים בשני עותקים.
  10. הוסף 50 μl של פתרון המצע מחדש היטב כל אחד.
  11. דגירה את הצלחת על 37 ºC בייקר מסלולית במשך 5 דקות ב125 סל"ד.
  12. תוכנה פתוחה Gen5 1.11 במחשב מקושר עם ספקטרופוטומטר.
  13. תחת "צור פריט חדש ", לחץ על" ניסוי ".
  14. לחץ על "פרוטוקול ברירת מחדל". לחץ על "אישור".
  15. בעמודה השמאלית, בחר באפשרות "פרוטוקול", ואז "סדר דין".
  16. בחר "עיכוב". הגדר ל0:10:00. לחץ על "אישור".
  17. בחר "קראו". בחר "הארה" מתפריט הנפתח. התאם את הגדרות אחרות לפעולות הבאות: קראו סוג Endpoint, אינטגרציה שעת 0: 01.00 MM: SS.ss, סינון סטי 1, פליטת חור, אופטיקה מיקום עליון, רגישות 100, למעלה Probe אנכי אופסט 1.00 מ"מ.
  18. כאשר הצלחת מוכנה להיות מנותח, לחץ על הסמל "קרא פלייט" בשורה העליונה. לחץ על "קרא". כאשר ספקטרופוטומטר נפתח, למקם את הצלחת למגש עם גם A1 בפינה השמאלית העליונה. תיבה עם הטמפרטורה תיפתח. לחץ על "קרא". הערה: ערכים גבוהים יותר לתאם עם רמות ATP מוגברות ופעילות המטבולית גבוהה יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דמות מתארת ​​את הצעדים פרוצדורליים בבידוד של המיטוכונדריה באמצעות ניתוק רקמות וסינון ההפרש מוצגת באיור 1. זמן פרוצדורליים סה"כ הוא פחות מ 30 דקות.

דגימות רקמה התקבלו באמצעות ביופסית 6 מ"מ. משקל רקמה היה 0.18 ± 0.04 g (משקל רטוב). מספר המיטוכונדריה מבודדת כפי שנקבע על ידי ספירת חלקיקים בגודל היה 2.4 x 10 10 ± 0.1 x 10 10 מיטוכונדריה לשרירי שלד ו2.75 x 10 10

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי לבודד בהצלחה מיטוכונדריה תוך שימוש בפרוטוקול זה הוא חיוני כדי לשמור על כל הפתרונות ודגימות רקמה על קרח כדי לשמור על יכולת קיום של המיטוכונדריה. גם כאשר שמר על קרח, מיטוכונדריה המבודדת תפגין ירידה בפעילות תפקודית לאורך זמן 19. אנו ממליצים שכל הפתרונות והתוספות להיות מוכנים מראש. אנחנו טרום לשקול ולאחסן Subtilisin ב4 aliquots מ"ג ב1.5 מ"ל צינורות microfuge ולאחסן אותם ב-20 מעלות צלזיוס. באופן דומה BSA נשקל מראש ולאחסן ב20 aliquots מ"ג ב1.5 מ"ל צינו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

טופלו כל בעלי החיים בהתאם להנחיות מוסדיות הנוכחיות. אין לנו אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי לאומי ללב, ריאות ודם מכון גרנט HL- 103,542, וTrailblazer פרס נכבד BCH הרדמת המחקר של הקרן לCAP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סוכרוזסיגמא אולדריץ'84100
HEPESסיגמא אולדריץ'H4034
EGTAסיגמא אולדריץ'E4378
סוסטילסין Aסיגמא אולדריץ'P5380
BSAסיגמא אולדריץ'A7906
KH2PO4Sigma AldrichP5379
MgCl2Sigma AldrichM8266
NaClSigma AldrichS6191
KClFisher ScientificP2173
Na2HPO4Fisher ScientificS374
ATPlite Luminescence Assay System,
1,000 ערכת בדיקה		Perkin Elmer
50 מ"ל צינורות חרוטייםBD352098
40 μ m מסנני ניילוןBD 352340
GentleMACS C שפופרתMiltenyl Biotech120-005-331
1.5 מ"ל שפופרת Eppendorfפישר סיינטיפיק05-408-129
6 מ"מ ביופסיה אגרוףMiltex33-36
10 μ m PluristrainerPluriselect43-500-10-03
צנטריפוגה אפנדורף 5415Cמרשל סיינטיפיקEP-5415C 
GentleMACS Dissociator Miltenyl Biotech130-093-235
צלחות 96 בארות, תרבית רקמות מטופלותVWR82050-732
Rotomax 120 שייקר אורביטליHeidolph544-41200-00
Synergy H4 היברידי Multi-Mode
  קורא מיקרופלייט		BioTek
Multisizer 4 קולטר מונהבקמן קולטרA63076
מערכת OxythermHansatech Instruments
HemacytometerFisher Scientific267110
6016941

מקורות

  1. van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
  2. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
  3. Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317(2011).
  5. Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
  6. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  7. Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  8. Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  9. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  10. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
  11. Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  12. Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  13. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
  16. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
  17. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
  18. McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
  19. Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
  20. Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
  21. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון


Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

תגיות

ATP

מאמרים קשורים