הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

13.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51725

⸱

19 ביולי 2014

 ,  ,  , 
1Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, School of Life Sciences, Swiss Institute for Experimental Cancer Research, 2DanStem, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

תקציר

הלבלב הוא איבר חיוני המווסת את הומאוסטזיס הגלוקוז ומפריש אנזימי עיכול. מחקר על אמבריוגנזה של הלבלב הוביל לפיתוח פרוטוקולים לייצור תאי לבלב מתאי גזע 1. ניתן לתרבית את כל האיבר העוברי במספר שלבי התפתחות 2-4. שיטות תרבית אלה היו שימושיות לבדיקת תרופות ולהדמיית תהליכי התפתחות. עם זאת, התרחבות האיבר מוגבלת מאוד והמורפוגנזה אינה מסוכמת בנאמנות מכיוון שהאיבר משתטח.

אנו מציעים תנאי תרבית תלת מימדיים (תלת מימדיים) המאפשרים הרחבה יעילה של אבות לבלב עובריים של עכברים מנותקים. על ידי מניפולציה של הרכב מדיום התרבות ניתן ליצור כדורים חלולים, המורכבים בעיקר מאבות לבלב המתרחבים במצבם ההתחלתי, או אורגנואידים מורכבים המתקדמים לאבות מתרחבים בוגרים יותר ומתמיינים לתאים אנדוקריניים, אצינאריים וצינוריים ואשר מתארגנים באופן ספונטני כדי להידמות ללבלב העוברי.

אנו מראים כאן שתהליך המבחנה מסכם היבטים רבים של התפתחות הלבלב הטבעי. מערכת תרבית זו מתאימה לחקור כיצד תאים משתפים פעולה ליצירת איבר על ידי הפחתת המורכבות הראשונית שלו למעט אבות. זהו מודל המשחזר את הארכיטקטורה התלת מימדית של הלבלב ולכן שימושי לחקר מורפוגנזה, כולל קיטוב של מבני אפיתל והסתעפות. כמו כן, ראוי להעריך את התגובה לרמזים מכניים של הנישה כגון נוקשות וההשפעות על מתיחות התא.

מבוא

תרבות איבר מספקת מודל שימושי שמגשר על הפערים בין מורכב, אך רלוונטי מאוד בחקירות vivo וסימולציה הנוחה אבל משוערת של מודלים קו סלולרי. במקרה של הלבלב, אין שורת תאים שווה ערך לחלוטין לאבות לבלב למרות שיש הופכים שורות תאים לדמות תאים האנדוקרינית ואקסוקרינית. כל הלבלב המבוגר לא יכול להיות מתורבת; איונים האנדוקרינית מבודדים יכולים להישמר במשך מספר שבועות ללא התפשטות תאים ויכולים להישמר פרוסות רקמה במבחנה לכמה שעות 5. תרבות לבלב עוברי כבר בשימוש נרחב לא רק ללמוד הפיתוח שלה, אלא גם כדי לחקור אינטראקציות אפיתל-mesenchymal 4,6,7, לתמונה מעבדת 8 או להתערב באופן כימי עימם 9. שתי שיטות תרבות איבר משמשות בעיקר: הראשון מורכב בculturing ניצני לבלב על צלחות פיברונקטין מצופה 2, שהוא convenient למטרות הדמיה; האפשרות השנייה היא תרבות האיברים במסננים בממשק האוויר הנוזלי 3,4 השומר הכי טוב המורפוגנזה. למרות שמאוד שימושי, שיטות אלה יביאו למידה מסוימת של השטחה; ההתרחבות של אבות היא מוגבלת מאוד בהשוואה להתפתחות התקינה ולאוכלוסייה מתחילה מורכבת הכוללת את כל הסוגים של תאי לבלב ותאי mesenchymal.

יכולת התרבות ולהרחיב את התאים ראשוניים מפוזרים היא בעל ערך ללמוד יחסי שושלת ולחשוף את התכונות הפנימיות של סוגי תאים מבודדים 10. סוגיאמה ואח' 11. יכול לשמור על אבות לבלב ואת אבות האנדוקרינית שמרה על כמה דמויות פונקציונליות ל3-5 ימים בתרבות בשכבות מזין. Pancreatospheres, בדומה לneurospheres 12 וmammospheres 13, הורחב מאיונים למבוגרים ותאי ductal למרות שטבעו של האבות / תאי גזעשיוצרים תחומים אלה אינו ברור. בנוסף, בניגוד להתפתחות פיזיולוגית, pancreatospheres הכיל כמה נוירונים 14,15. התחומים גם הופקו לאחרונה מאבות עובריים לבלב 16,17 והתחדשות pancreata 18 עם התרחבות אב טובה והבחנה שלאחר מכן, אך לא הצליחו לשחזר המורפוגנזה.

המודלים 3D מהתאים מפוזרים ולעתים קרובות מוגדרים שעצמי לארגן את האיברים מוקטנים פרחו לאחרונה ולדמות את מחזור הפיתוח או מבוגר של איברים מרובים כגון המעי 19,20, הקיבה 21, הכבד 22, הערמונית 23 וקנה הנשימה 24. במקרים מסוימים, המורפוגנזה והתמיינות התפתחותיים כבר סכמו ב3D מתאי גזע עובריים, כמו במקרה של כוסות אופטיות 25, מעי 26 או מוח 27.

כאן, אנו describe שיטה להרחיב אבות לבלב multipotent ניתק בפיגום 3D Matrigel בו הם יכולים לבדל ולארגן את עצמו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה נועד לגדול organoids לבלב שמקורם E10.5 העכברי ניתק תאי לבלב אפיתל.

הפרוטוקול דורש אישור אתי לניסויים בבעלי חיים.

1. Dissection של גב הלבלב באד מE10.5 עוברי עכברים

  1. מדיום חיוני להקריב את העכברים בעיתוי בהריון ביום עוברי (E) 10.5, פתח את הבטן עם זוג מספריים, להסיר את שתי קרנות הרחם ומניח אותם בצלחת פטרי 10 סנטימטר מלא מלוח פוספט הקר חיץ (PBS) או שונה Dulbecco (DMEM) שמר על קרח. הניסוי הכולל מההקרבה לזריעת תאים נעשה ב60-90 דקות על מנת למנוע נזק לתאים.
  2. הפרד את הרחם למקטעי עובר בודדים באמצעות מספריים קטנים. העבר את העובר אחד לצלחת 35 מ"מ פטרי עם PBS הקר ולדמיין אותו תחת מיקרוסקופ לנתח עם תאורה מלמעלה. עם מלקחיים נתיחה להסיר את sa שרירים, decidua וחלמון מסביבג ולחשוף את העובר. מניחים את העובר חזרה למדיום DMEM קר. בקלות ניתן להעביר עוברים באמצעות פיפטה / טפטפת העברת פלסטיק 3 מיליליטר. לבודד את כל עובר בודד בצורה דומה לפני שתמשיך.
  3. הנח לעובר 35 מ"מ צלחת פטרי נקי ב-PBS.
    1. שימוש במלקחיים דקים (0.05 רוחב מ"מ) כדי להסיר את forelimb. הכניסו בעדינות את המלקחיים בפתיחה לנתק את מערכת עיכול מאזור חוט השדרה (איור 1). אופציונלי: כדי לראות בצורה נוחה יותר בבטן, להסיר את החלק העליון של גופו של העובר, עד ללב ובאזור הזנב מתחת לגבעול החלמון.
    2. אתר את הקיבה, הכבד ומעי. באמצעות המלקחיים, לבודד את מערכת העיכול מהקיבה למעי ולמקם אותו בDMEM הקר על קרח (איור 1). ניצן הלבלב הגבי מצורף dorsally, אחורי אל הקיבה (איור 1).
    3. לבודד כל אדם מערכת עיכול בסימיאופן lar לפני שתמשיך. אם העוברים צריכים להיות genotyped, לאסוף את הזנב בעת הנתיחה ולשמור על כל מערכת עיכול בודדת בבאר שונה בצלחת 24 גם עם DMEM הקר על קרח.
  4. הנח בדרכי עיכול באחד 35 מ"מ צלחת פטרי נקייה בקור PBS. עכשיו להשתמש בתאורה מלמטה בשדה בהיר כדי לחזות ולנתח את ניצן הלבלב הגבי תחת מיקרוסקופ לנתיחה. תנאים אלה יהיו לייעל את ההדמיה של כרכים. באמצעות מחטי טונגסטן חדדו אלקטרוליטים או 20 מחטי מזרק G, לבודד את ניצן הלבלב עם mesenchyme מעט ככל האפשר סביב אפיתל (איור 1).
    1. העבר את הניצן המבודד לתוך צלחת פטרי שמכילה תמיסה קרה dispase (1.25 מ"ג / מיליליטר) ל2-3 דקות. מנקודה זו, העברה יכולה ביותר נוחות להיעשות עם 50 נימי זכוכית μl-משך להבה מחוברת לצינור גמיש שבשליטת פה. לחלופין, אבל עם יותר ריsk לאבד הניצן, השתמש פיפטה אוטומטית 10 μl (Pipetman) עם טיפים פלסטיק מתאימים.
    2. בצע שאיפת ניצן לבלב ופליטה תחת שליטה מיקרוסקופית. שים ניצן הלבלב בחזרה ב-PBS. בהמשך לנקות את ניצן הלבלב המבודד מmesenchyme עם המחטים ושאיפה עדינה באמצעות נימי הזכוכית (איור 1).
    3. כאשר כל mesenchyme מוסר, יש לשטוף את ניצן הלבלב בקור PBS; להעביר את כל ניצן לDMEM הקר בבארות בודדות (60 היטב מיני מגשים מלא ב10 μl של DMEM הקר). חשוב שלא להסיר את mesenchyme בdispase, מה שהופך את הרקמה דביקה מאוד.

2. ציפוי ותרבות של תאים מפוזרים

  1. העבר האפיטל גזור מכל העוברים עם נימי זכוכית משכה להבה לתוך בארות חרוטי של 60 היטב מיני מגשים מלא ב10 μl PBS לשטיפה.
    1. העבר את הניצן ל10 μl של 0.05% טריפסיןnd לתת לו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. להשבית טריפסין על ידי העברת הניצן להיטב עם 10 DMEM μl 10% עוברי עגל בסרום + (FCS).
    2. לנתק את ההשעיה התא על ידי שאיפה דרך נימים דקות משכו עם חולץ פיפטה. זה חשוב כדי למנוע בועות בשלב זה תוך pipetting למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. organoids הלבלב להתחיל בצורה אופטימלית מקבוצות קטנות של 5-15 תאים ולכן ניתוק חלקי מומלץ (איור 1).
  2. בריכת תאים מכמה עוברים לתוך צינור Eppendorf על מנת למזער את ההבדלים בשל עיבוד פרט. לדלל את ההשעיה התא בMatrigel המצונן ביחס 1:3. Aliquot את התערובת לצלחת 96 היטב, 8 μl / טוב או בצלחת מותאמת להדמיה (ראה להלן).
  3. דגירה את הצלחת ב-C ° 37 למשך 5 דקות, ומאפשרת Matrigel להתעבות. למלא את הבארות עם 70 μl של מדיום של בחירה (organoid או כדור, ראה לשוניתles 1 ו -2) ולהשאיר בסביבת humidified המכילה 5% CO 2 ו95% אוויר ב37 ° C.
  4. החלף את המדיום בכל יום 4 ה. לפקח על מושבות לבלב גדלה מדי יום ולתעד את התהליך על ידי הדמיה.
  5. ניתן להוסיף מולקולות או חלבונים קטנים של עניין למדיום בשלב זה לניסויי הפרעה, כפי שדווחו בעבר 28.

טבלה 1: בינוני Organoid.

שמו של חומר ריכוז מניות ריכוז במדיום סופי נפח של המניה
פניצילין, סטרפטומיצין 100% 1% 50 μl
החלפת סרום נוקאאוט (תוסף) 100% 10% 500 μl
2-mercaptoethanol 14.3 M 0.1 מ"מ 1 μl
Phorbol Myristate אצטט (PMA) 16 מיקרומטר 16 ננומטר 5 μl
Y-27632 (מעכב ROCK) 50 מ"מ 10 מיקרומטר 1 μl
EGF 50 מיקרוגרם / מיליליטר 25 ng / ml 2.5 μl
האנושי רקומביננטי R-spondin 1 250 מיקרוגרם / מיליליטר 500 ng / ml 10 μl
- או -
רקומביננטי עכבר 1 R-spondin 250 מיקרוגרם / מיליליטר 500 ng / ml 10 μl
FGF1 האנושי רקומביננטי (aFGF) 100 מיקרוגרם / מיליליטר 25 מיקרוגרם / מיליליטר 1.25 μl
הפרין (Liquemin) 2500 U / ml 2.5 U / ml 2 μl
מלFGF10 אדם binant 100 מיקרוגרם / מיליליטר 100 ng / ml 5 μl
DMEM/F-12 4,412.25 μl
סך הכל 5,000 μl

טבלה 2: בינוני כדור.

שמו של חומר ריכוז מניות ריכוז במדיום סופי נפח של המניה
פניצילין, סטרפטומיצין 100% 1% 50 μl
x50 B27 (תוסף) 100% 10% 100 μl
FGF2 האנושי רקומביננטי (bFGF) 100 מיקרוגרם / מיליליטר 64 ng / ml 3.2 μl
Y-27632 (מעכב ROCK) 50 מ"מ 10 מיקרומטר 1 μl
DMEM/F-12 4845.8 μl
סך הכל 5000 μl

3. הדמיה של ההתקדמות של פיתוח Organoid

  1. organoids תמונה אחת ביום, או על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופ הזמן לשגות ניאון. עבור זמן לשגות הדמיה, השתמש XY מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההפוך אוטומטי (Z).
  2. טיפות קטנות פיקדון של 3 μl בצלחות 4 היטב או צלחות זכוכית תחתונה מלאות ב2-5 בינוני מיליליטר. תמונה עם מטרה למרחקים ארוכים 10x. הערה: ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים מבטא קליעים נותבים ניאון. סרט 1 מופעים למשל ההתרחבות הראשונית של organoids מPdx1-Ngn3-ER עכברי TM-ires-nGFP + 4. GFP הגרעיני מאפשר למשתמש לעקוב אחר תאים כיכולים להיות מיושמים אובייקטים בודדים אבל עקרונות דומים כדי לעקוב אחר תאים עם הקרינה קרום כזהכמו עכברי MT / מיליגאוס 29.
  3. להתחיל זמן לשגות הדמיה שעה 3 לאחר זריעת התאים, כדי למנוע סחף להתמקד ולהגדיר האוטומציה שליטה בתוכנה כדי לצלם את 1 / שעה למשך 3 ימים או יותר בעמדות שהוגדרו באופן ידני. לכל תפקיד, לרכוש התערבות ההפרש לעומת זאת תמונה (DIC), כמו גם את אות ה-GFP, דיווח ביטוי סמן פלואורסצנטי.

4. שחזור של Organoids להיסטולוגיה

  1. מניחים את צלחת 96 היטב על קרח ולהסיר את המדיום, והחלפתו עם PBS הקר כקרח. זה depolymerizes חלקית Matrigel.
  2. לשאוב בעדינות כל organoid פרטני, הסרת Matrigel מקיף באמצעות קצה 1,000 μl על מנת שלא לשבש את הארכיטקטורה הכוללת. העבר כל organoid להיטב עם קרח הקר PBS. שמור את הצלחת על קרח. קיבעון ישיר בMatrigel הוא גם אפשרי.
  3. תקן organoid במשך 15 דקות paraformaldehyde 4% (PFA), cryopreserve זה בסוכרוז ולשבץ אותה בג'לטין. לעבד כלorganoid לcryosectioning והיסטולוגיה כמתואר (ג'והנסון et al. 2007) 4 בעבר.

5. שחזור של Organoids לPCR וביוכימיה

  1. מניחים את צלחת 96 היטב על קרח ולהסיר את המדיום. הוסף 60 μl של RNAlater בכל טוב על מנת לייצב ולהגן על RNA התאי.
  2. לשבש את הג'ל בכל אחד גם באופן מכאני על ידי באופן חלקי depolymerizing אותו על קרח. כך או לשחזר organoids הבודד באמצעות טיפ 1,000 μl על מנת שלא לשבש את הארכיטקטורה הכוללת או לשחזר גם כולו (עם Matrigel) ע"י שיבוש ג'ל מכאני עם טיפ μl 200. השתמש קצה 1,000 μl להעביר את התוכן גם לתוך צינור Eppendorf חופשי לא דביק RNAse שמר על קרח.
  3. לשטוף את הבארות עם 60 RNAlater μl ולהוסיף תוכן שנותר לאותו הצינור Eppendorf.
  4. ספין הצינורות במשך 5 דקות ב500-1,000 XG ב 4 ° C.
  5. הסר את supernatant, רק עוזב 20-30 μlשל RNAlater בצינור יחד עם גלולה. לביוכימיה, לאחסן דגימות יבשות ככל האפשר.
  6. אין להקפיא דגימות בRNAlater באופן מיידי; חנות ב 4 ° CO / N (כדי לאפשר RNAlater לחדור את הרקמה ביסודיות). הרקמה יכולה להיות מאוחסנת ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך ובהמשך יכולה להיות מעובד לשיבוש והפקה של כמויות קטנות של RNA ברקמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אבות לבלב הגבי E10.5 ניתקו וזורעים ב3D Matrigel לסכם פיתוח לבלב. יכולים בקלות להיות בעקבות אבות עם כתבי ניאון. במקרה שלנו השתמשתי בעכבר מהונדס המבטא את חלבון ה-GFP הגרעינית הנשלט על ידי אמרגן Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (סרט 1) בהעדר טמוקסיפן ובכך ללא הפעלת Neurog3 4 (איור 2).

עם מדיום organoid, דחיסה ראשונית של אשכולות קטנים של תאים מתרחשת בשעות הראשונות. התרחבות א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ייצור בקנה מידה גדולה של תאי הבטא תפקודיים במבחנה הוא עדיין לא יעיל 1. בהקשר זה מאתגר, לימודי ביולוגיה התפתחותית עשויים לעזור בפענוח האותות המדויקים הנדרשים להתמיינות של תאי הבטא תפקודיים. פרוטוקול זה מאפשר לתחזוקה, ההתרחבות וההתמיינות של תאי אב עובריים בלבלב במבחנה. זה כולל את היווצרותם של תאי הביתא המייצר אינסולין שאינו שיתוף להביע הורמונים אנדוקריניות אחרים, יש רמות גבוהות של Pdx1, להביע הפרו convertases שיבשיל לאינסולין ויש לי אינסולין מעובד 2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה ברצף על ידי גבולות NCCR בפרס טייס גנטיקה, Juvenile Diabetes Research Foundation גרנט 41-2009-775 וגרנט 12-126875 מDet Frie Forskningsråd / עוג Sundhed Sygdom. המחברים מודים המעבדה Spagnoli לאירוח וידאו הירי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15070-063מלאי נשמר ב-20 מעלות;
תחליף סרום C KnockOut (תוסף)Gibco10828-028המלאי נשמר ב-20 מעלות; C
2-mercaptoethanolSigma Aldrich3148-25MLמלאי נשמר ב-4 מעלות; C
Phorbol Myristate אצטט (PMA)Calbiotech524400-1MGמלאי נשמר ב-20 מעלות; C
Y-27632 (מעכב ROCK)Sigma Aldrichab120129המלאי נשמר ב-20 מעלות צלזיוס. יציבות/מקור הוא מקור תכוף לבעיות.
מלאי EGFSigma AldrichE9644-2MGנשמר ב-80 מעלות; C
R-ספונדין אנושי רקומביננטי 1R& D4645-RS-025/CFמלאי נשמר ב-80 מעלות; C
עכבר רקומביננטי R-spondin 1R& D3474-RS-050מלאי נשמר ב-80 מעלות; C
FGF1 אנושי רקומביננטי (aFGF)R& D232-FA-025מלאי נשמר ב-80 מעלות; C - אין לכלול כדי להגביר את ייצור תאי הבטא
הפרין (ליקמין)מלאי Drossapharmנשמר בטמפרטורה של 4 מעלות; C
רקומביננטי אנושי FGF10מו"פ D345-FG-025מלאי נשמר ב-80 מעלות; C
DMEM/F-12Gibco21331-020
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15070-063המלאי נשמר ב-20 מעלות; C
B27 x50 (תוספת)Gibco17504-044מלאי נשמר ב-20 מעלות; C
FGF2 אנושי רקומביננטי (bFGF)R& D233-FB-025מלאי נשמר ב-80 מעלות; C
MatrigelCorning356231מלאי נשמר ב-20 מעלות; C
טריפסין 0.05%Gibco25300-054המלאי נשמר ב-4 מעלות; C
RNAlater - ריאגנט מייצב RNAQiagen76104חנות ב- RT
Dispase סיגמא אולדריץ'D4818-2MGריכוז עבודה: 1.25 מ"ג/מ"ל. המלאי נשמר ב-20 מעלות; C
BSA לבנייה מחדשMilipore81-068לבנייה מחדש של ציטוקינים  - מלאי נשמר ב-20 מעלות;
C סרום עגל עוברי (FCS)מלאי Gibco16141079נשמר ב-20 מעלות; C
60 בארות מגשי MicroWellSigma AldrichM0815-100EA
צלחות 4 בארותThermo Scientific176740
צלחות 95 בארות F תחתוןGreiner Bio6555180
Glas לוחות תחתוניםIbidi81158
סילוק מיקרופיפטות זכוכיתBlaubrand708745
מיקרוסקופCell® עמדת הדמיה (מעמד אולימפוס IX81 הפוך ממונע) מצוידת במצלמת Hamamatsu ORCA ER B7W ובקוביית לודין וקופסה.
מעמד Leica DMI6000 B מוקף בקוביית Ludin ו-Box, מצויד במצלמת Leica DFC365 FX ובממשק הפקודה של תוכנת AF6000 Expert/Matrix.
מטרהאולימפוס UPLAN FL NA 0.30 אוויר 9.50 מ"מ 10X למרחקים ארוכים;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 אוויר 11.0 מ"מ 10X למרחקים ארוכים
של

מקורות

  1. Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
  2. Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
  3. Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
  4. Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
  5. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
  6. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
  7. Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , 3979(2012).
  9. Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
  10. Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
  11. Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  13. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  14. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
  15. Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
  16. Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
  17. Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
  18. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. , (2013).
  19. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. , (2009).
  20. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  21. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  22. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
  23. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
  24. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
  25. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  26. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  27. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
  28. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית תלת-ממדיתפיגום Matrigelדיסוציאציית תאיםבידוד נבט הלבלביצירת אורגנואידיםמיקרוסקופיה של צילום רצף (Time-lapse)ניתוח היסטולוגיהתמיינות תאים
במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.