מאמר שיטה

דוגמנות שבץ בעכברים: קרישה קבועה של עורקי דיסטלי התיכון מוחין

39.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51729

⸱

31 ביולי 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Stroke and Dementia Research, University Hospital Munich, 2Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), 3Department of Neurology, University Heidelberg, 4Imperial College, Charing Cross Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מודלים עכבריים שונים של חסימת עורק המוח אמצעית (MCAO) נמצאים בשימוש נרחב בחקר המוח ניסיוני. הנה, אנחנו מדגימים את המודל של MCAO דיסטלי הקבוע transcranial אשר מייצר אוטם קליפת המוח עקבי של גודל המתאים לנזק שהוטל על ידי הרוב המכריע של מקרי שבץ איסכמי אנושיים.

תקציר

שבץ הוא הגורם השלישי הנפוץ ביותר למוות וגורם עיקרי למוגבלות מבוגרים שנרכשו במדינות מפותחות. אפשרויות טיפוליות מוגבלות בלבד זמינות עבור חלק קטן של חולי שבץ מוחי בשלב האקוטי. מחקר הנוכחי הוא באינטנסיביות בחיפוש אחר אסטרטגיות טיפוליות חדשניות ומתמקד יותר ויותר, כי יותר חולים עשויים להיות זכאים להתערבויות טיפוליות בחלון זמן ממושך בשלב תת אקוטי וכרוני לאחר שבץ. מנגנונים עכבו אלה כוללים מסלולי pathophysiological חשובים כגון דלקת לאחר השבץ, אנגיוגנזה, פלסטיות עצבית והתחדשות. על מנת לנתח את המנגנונים הללו ולהעריך לאחר מכן מטרות תרופה חדשניות, מודלים שבץ ניסיוניים עם הרלוונטיות קלינית, תמותה נמוכה ושחזור גבוה הם חיפשו אחרי. יתר על כן, עכברים הם היונקים הקטנים ביותר שבו יכולה להיגרם פגיעה שבץ מוקד ועבורו קשת רחבה של מודלים מהונדסים הןזמין. לכן, אנו מתארים כאן מודל העכבר של transcranial, קרישה קבועה של עורק המוח האמצעי באמצעות דיסטלי electrocoagulation של עורקי lenticulostriatal, מה שנקרא "מודל הקרישה". האוטם וכתוצאה מהמודל זה נמצא בעיקר בקליפה; ביחס אוטם הנפח ביחס לגודל המוח תואם את רוב משיכות אנושיות. יתר על כן, המודל עומד בקריטריונים הנ"ל של שחזור ותמותה נמוכה. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את השיטות הניתוחיות של אינדוקציה שבץ ב" מודל הקרישה "ולדווח על כלי ניתוח היסטולוגית ופונקציונליים.

מבוא

שבץ הוא הגורם השלישי הנפוץ ביותר למוות ואחד הסיבות העיקריות למוגבלות מבוגרים שנרכשו במדינות מפותחות 1. כ 80% ממחלות נוירולוגיות אקוטיות זה נגרם על ידי איסכמיה המוחית כתוצאה מחסימה של זרימת דם במוח בזמן ש-15% נגרמים על ידי דימום תוך מוחי 2. למרות מחקר מתמשך, עירוי לוריד של activator plasminogen רקמות הוא הטיפול התרופתי המאושר רק לשבץ איסכמי עד כה, וזמין רק למיעוט של חולי שבץ בשל חלון הזמן שאושר הקצר של 4.5 שעות לאחר שבץ תחילת 3,4. מכיוון שאין מודלים חוץ גופית ב, שיכול מודל כראוי את יחסי הגומלין המורכבים שבין המוח, כלי הדם ומנגנוני pathophysiological מערכתיים במהלך שבץ, מודלים של בעלי החיים הם חיוניים למחקר שבץ פרה.

לכן, מספר דגמי שבץ איסכמי פותחו בVariאתי של מינים. אחד דגמי השבץ הנפוצים ביותר הוא "מודל נימה" שבו נימה תפר הוא הציג transiently לתוך עורק התרדמה הפנימי ומועבר עד הקצה חוסם את מקורו של עורק המוח האמצעי (MCA), וכתוצאה מעצירה של זרימת דם והאוטם מוחי הבא של גם אזורים בקליפת המוח קורטיקליים ובמקרה של חסימה ממושכת 5,6. בדגמי photothrombotic של שבץ איסכמי, חסימת פוטו של כלי השיט בקליפת המוח המוקרן מושגת לאחר ההזרקה של פוטוסנסיטייזר וכתוצאה מנגעים קטנים, מוגבלים באופן מקומי 7. חסימה הקבועה של דיסטלי MCA של עורקי lenticulostriatal יכולה להיות מושגת על ידי קשירה של העורק, הדחיסה חולפת שלה או על ידי 8,9 קרישה הקבוע. האוטם וכתוצאה מהמודל זה בעיקר משפיע על קליפת המוח 10 בגלל חסימה של MCA במודל זה היא דיסטלי lenticעורקי ulostriatal, המספקים את הגרעינים הבזליים.

מאחר שרוב נגעי שבץ אדם נמצאים בטריטוריה של עורק המוח האמצעי, כל דגמי השבץ הנפוצים דומה חסימות של MCA או אחד מענפיו 11. MCA הוא אחד העורקים הראשיים המספק את אספקת דם למוח; זה נובע מעורק התרדמה הפנימי, המסלולים לאורך מענית לרוחב שבו לאחר מכן סניפים ופרויקטים לגרעיני בסיס והמשטחים לרוחב של חזיתי, הקודקודית ואונה הטמפורלית, כולל את המנוע העיקרי וחושית קליפת המוח. ימין ושמאל MCA מחובר לעורקי המוח הקדמי והאחורי תקשורת עורקים, אשר מתחברים לעורקי המוח האחוריים, יוצר מעגל של ויליס (איור 1).

כפי שדווח בעבר על ידי קרמייקל ואח'. 11, אוטמים דגם ידי המוח האמצעי Ar דיסטלימודל טרי ספיגה (MCAO) בעכברים להקיף כ 10-15% מחץ הכדור, ובכך מחקה את רוב נגעי שבץ אדם הנמצאים בשטח MCA קליפת המוח 11,12. ב -1981 Tamura et al. תאר מודל קבוע, transcranial MCAO קרישה בחולדות 8. עם זאת, המודל שתואר על ידי Tamura מעורב חסימה הפרוקסימלי של MCA על מנת לעקוף את הסתעפות דיסטלי יותר של העורק. לפיכך, "מודל Tamura" המקורי גורם לנגעים בקליפת המוח, אלא גם של הסטריאטום לא רק, בדומה לנגעים שהושגו על ידי "מודל נימה" 6. כאן, אנו מתארים את מודל MCAO דיסטלי הקבוע על ידי electrocoagulation transcranial בעכברים. בנוסף, אנו מדווחים היסטולוגית קשורים ושיטות פונקציונליות כדי לנתח את תוצאות השבץ המוחי במודל זה. כל השיטות מבוססות על נהלי הפעלה סטנדרטיים שפותחו ושימוש במעבדות שלנו.

פרוטוקול

שמירה על האתיקה

הניסויים שדווחו בסרטון זה נערכו בהתאם להנחיות לאומיים לשימוש בחיות ניסוי והפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדות הממשלתיות הגרמנית (Regierung פון Oberbayern, מינכן, גרמניה). עכברי C57BL/6J 10 שבוע ישן, זכר נמצאים בשימוש במחקר זה. בעלי החיים שוכנו תחת טמפרטורה מבוקרת (22 ± 2 מעלות צלזיוס), עם תקופת 12 שעות אור בחושך מחזור וגישה למזון pelleted וכרצונך מים. שיכוך כאבים והרגעת פרוטוקולים מתוארים כפי שאושרו על ידי הוועדה הממשלתית המקומית, אך עשוי להיות שונה מפרוטוקולים המשמשים במעבדות אחרות.

1. הכנת החומר ומכשירים

  1. חבר את שמיכת החום על מנת לשמור על אזור הפעולה החם ולשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר במהלך ההרדמה (37 מעלות צלזיוס).
  2. מספריים להכין autoclaved, מלקחיים וכותנה, dexpanthמשחה enol העין וחומר תפר. הכן את מזרק עם תמיסת מלח (בלי מחט) כדי לשמור על אזור פעולת התייבשות. הכן את גז ההרדמה (N 70% 2 O + 30% O 2 + isoflurane).
  3. להזריק משככי כאבים intraperitoneally: Metamizol 200 מ"ג / קילוגרם, Carprofen 4 מ"ג / קילוגרם ו0.1 מ"ג / קילוגרם Buprenorphin.
  4. מניחים את העכבר בתא האינדוקציה עם קצב זרימת isoflurane של 4% כדי להרדים אותו עד שתנועה ספונטנית של גוף וvibrissae מפסיק.
  5. העבר את העכבר בעמדה לרוחב עם האף שלה לתוך מסכת ההרדמה ולשמור על ריכוז isoflurane ב 4% לכ עוד דקה, ולאחר מכן להפחית וזה ב% approx.1.5 כדי לשמור על הרדמה מתאימה.
  6. החל המשחה העין dexpanthenol בשני העיניים.

2. דגם MCAO דיסטלי

  1. לעשות חתך בעור 1 סנטימטר בין העין לאוזן באמצעות מספריים פעולה מעט לאחר הכנת aseptical של מנצלים אתר כירורגיתחיטוי עור גרם.
  2. הפרד את העור ומתאים את השרירים זמניים.
  3. בחר במחולל התדר הגבוה תפקוד הקרישה, מצב דו קוטבי, בחר W 12 ולחבר את המלקחיים electrocoagulation עם הכבלים.
  4. הוסף טיפה של תמיסת מלח ולהשתמש במלקחיים כדי לנתק את השרירים זמניים מהגולגולת בחלק apical ועל גב שלה, ובכך, מה שהופך את דש שרירים ללא לחלוטין הסרת השריר.
  5. זהה את MCA מתחת לגולגולת השקופה, בחלקו מקורי של האזור הזמני, הגבה לסינוס רטרו מסלולית (איור 2 א). אם הסתעפות MCA אינה גלויה (עקב וריאציה נורמלית אנטומיים) לזהות את הכלי מקורי ביותר.
  6. להוסיף קצת מלח על הגולגולת ולדלל את העצם עם המקדחה ממש מעל סניף MCA עד יש לו מרקם דק ושקוף (איור 2).
  7. לסגת בזהירות את העצם מעל העורק עם דקים מאוד מלקחיים.
  8. בחר במצב דו קוטבי in גנרטור בתדירות הגבוה ב7 וו להקריש את העורק עם electrocoagulation מלקחיים הפרוקסימלית ומ דיסטלי להסתעפות (איור 2 ג). כאשר הסתעפות אינה גלויה בשל גרסה אנטומיים, להקריש הסניף זיהה בצורה הנכונה MCA (ראה לעיל) בשני אתרים של כ. מרחק 1 מ"מ. אין צורך לתפוס את העורק עם המלקחיים לקרישה, נוגע בעורק בזהירות עם המלקחיים משני הצדדים מלמעלה מספיק וגורם פחות נזק מכאני.
  9. חכה 30 שניות ולגעת בעדינות בעורק עם מלקחיים קהים כדי לבדוק את כל זרימת דם עקב recanalization הספונטנית. במקרה של recanalization לחזור electrocoagulation פעם אחת.
  10. מיקום מחדש של השרירים זמניים לעמדתה, המכסה את החור בר.
  11. תפר את הפצע והמקום חי בתיבת סיעוד ב32 ° C להתאושש מהרדמה ולהחזיר אותו לכלוב. באופן כללי זה לוקח 5-10 דק 'לבעלי החיים להתאושש מanesthesia.
  12. הזרק שיכוך כאבים לאחר ניתוח (IP) לאחר 24 שעות ולאחר מכן מדי יום עד ליום שלאחר הניתוח החמישי: Carprofen 4 מ"ג / קילוגרם.

3. שאם מבצע

לבצע את כל הנהלים באופן זהה לפעולה שתוארה לעיל - כוללים דילול של הגולגולת וההסרה שלה - למעט לא נקרש העורק החשוף.

4. מבחן צילינדר 13

  1. מניחים את החיה בגליל שקוף אקריליק זכוכית (קוטר: 8 סנטימטר, גובה: 25 סנטימטר) מול שתי מראות וקלטת וידאו במשך 5 דקות. כוון את המצלמה באופן מרכזי מול שתי המראות והגליל להשיג (איור 3 א) וידאו אופטימלי.
  2. להערכה של שימוש forelimb עצמאי, ציון (1) קשר של קיר הגליל עם forelimb אחת במהלך אחורי מלא ו (2) נחיתה רק עם אחד forelimb על רצפה אחרי אחורי מלא. לספור לפחות 20 קשר לforelimb אחד באמצעות הילוך איטי או מסגרת לפי frפונקצית ame של לקוח הווידאו Lan (VLC) תוכנה חופשית (http://www.videolan.org/vlc).
  3. לניתוח בסיסי לפני ניתוח: לבצע את הבדיקה פעמיים בעכבר, עם הפסקת 1 שעות בין ניסויים. שימוש forelimb מבוטא כיחס שימוש forelimb ימין / שמאל צדדי, בלתי תלוי.
  4. לאחר קרישת MCA: לבצע את הבדיקה שוב פעמיים בעכבר, עם הפסקת 1 שעות בין ניסויים כפי שצוין לעיל.

5. זלוף

  1. לטשטש את בעלי החיים (למשל, על ידי קטמין ו xylazine 120/16 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, בהתאמה).
  2. תקן את החיה במצב שכיבה ולפתוח את חלל הבטן עם חתך החציוני. הסר את הקרעים ועצם החזה. לעשות חתך קטן בעלייה הימנית. הכנס צינורית זלוף בחדר השמאלי ותנקב באיטיות עם 20 מיליליטר של תמיסת מלח.
  3. לערוף את החיה, לפתוח את מכסה הגולגולת ובעדינות לנתק את המוח מבסיס הגולגולת.
  4. להקפיא את המוח בisopentane הקר C ° -40 10 דקות. לאחר מכן להסיר את המוח מisopentane ולאחסן עד לניתוח נוסף ב -80 ° C.

6. האוטם volumetry

  1. Cryosectioning: חותכים את המוח באופן סדרתי בcryostat 20 מיקרומטר חלקים עבים מדי 400 מיקרומטר בשקופיות ולאחסן את השקופיות ב -20 ° C.
  2. סגול cresyl מכתים (CV):
    1. הכן את הפתרון מכתים: מערבבים 0.5 גרם של אצטט את קורות חיים ב500 מיליליטר H 2 O. מערבבים וחום (C ° 60) עד גבישים מומסים. תן הפתרון מגניב ולאחסן בבקבוק כהה. לחמם 60 מעלות צלזיוס ומסנן לפני כל שימוש.
    2. ייבש את השקופיות ב RT למשך 30 דקות. הנח אותם ב95% אתנול ל15 דקות ולאחר מכן ב70% אתנול דקות 1 ולאחר מכן ב50% אתנול דקות 1.
    3. מניחים את השקופיות במים מזוקקים למשך 2 דקות, לרענן מים מזוקקים ולמקם אותם בדקות 1. לאחר מכן מניח את השקופיות בפתרון מכתים f (60 ° C)או 10 דקות ולשטוף אותם פעמיים במים מזוקקים דקות 1.
    4. מניחים את השקופיות ב95% אתנול למשך 2 דקות. ואז למקם אותם לתוך אתנול 100% למשך 5 דקות, לרענן את 100% אתנול ולמקם אותם בדקות 2. לאחר מכן לכסות את השקופיות עם הרכבה בינונית.
    5. ניתוח:
      סרוק את השקופיות ולנתח עקיף אוטם הנפח בשיטת סוונסון 14 לתקן לבצקת:
      (אזור איסכמי) = (אזור Cortex של צד נגדי) - (אזור קליפת המוח ללא איסכמי של צד ipsilateral) (איור 4 א).

תוצאות

בשל הנזק המוחי הקצר ההרדמה זמן ומתון, כ 10 דקות לאחר העברה לכלובים שלהם את כל החיות היו ערה, נעו באופן חופשי בכלוב ואינטראקציה עם המלטה. התמותה במהלך ניתוח MCAO הייתה פחות מ -5%, בעיקר כתוצאה מדימום תת עכבישי בשוגג או הרדמה שגויה. תמותה בזמן תצפית 7 יום אחרי גיוס השבץ מתרחשת רק לעתים נדירות מאוד בכ 1-2% מבעלי החיים. בסדרת הפעולה של 10 חיות לדו"ח זה את כל החיות ששרדו את הניתוח ותקופת המעקב של 7 ימים, אף אחד מהם הייתי צריך להיות שלילי בשל קריטריוני הדרה.

גירעונות התנהגות לאחר קרישת MCA הוערכו על ידי בדיקת צילינדר הסימטריה שימוש בכפו 13 ניתוח. בבדיקה זו, היחס בין השימוש בכפו ימני ושמאלי עצמאי נמדד בנקודות זמן המצוינות אחרי גיוס שבץ בהשוואה לערכי בסיס שהושגו 24שעה לפני MCAO (איור 3 ב). בעלי החיים הציגו שינוי משמעותי באסימטריה שימוש איבר לקיר חיפושים בשילוב בשעתי צילינדר מבחן 24 (1.72 ± 0.326; p <0.05) ו -3 ימים (1.36 ± 0.17; p <0.05) לאחר MCAO. למרות שהיחס השתפר במהלך זמן תצפית 1 שבוע, הסימטריה מוטורית עדיין הייתה משמעותית 7 ימים לאחר MCAO (1.35 ± 0.29; p <0.05) בהשוואה לערכי בסיס.

ביצענו volumetry אוטם באמצעות סגול cresyl מוכתם חלקים במוח העטרה סידוריים 7 ימים לאחר האינדוקציה שבץ (איור 4). אומר אוטם נפח היה 15.4 מ"מ 3, ובכך מייצג 12% מאונת מוח אחד (איור 4C). ההשתנות של מודל שבץ זה היא נמוך במיוחד עם סטיית תקן של כ 10%. אזור הנגע מקיף החושית והקורטקס מוטורי בחיבה קלה בלבד של מבנים קורטיקליים. יתר על כן, לוקליזציה של האוטםהאזור הוא צפוי מאוד רק עם השתנות מינימאלית כפי שמוצג בתרשים ההפצה סכמטית (איור 4D).

figure-results-1
איור 1. ייצוג סכמטי של המעגל של ויליס. מעגל העורקים של וויליס נוצר על ידי עורקי המוח האמצעיים (MCA) ועורקי המוח הקדמי (ACA) שענף מעורק התרדמה הפנימי (הרשפ"ת), כמו גם על ידי עורקי מוח אחורי (PCA) ואחורי תקשורת עורקים (PComA). MCA רץ לתוך מענית לרוחב שבו סניפים לקליפת המוח. הסניף הדומיננטי MCA אספקת החלק העיקרי של הקורטקס המוטורי וחלק מהקליפה החושית הוא האפיל באופן קבוע על ידי המודל הפגין (עורק תקשורת Acoma = קדמי; תואר ראשון = עורק basilar; סוכה = cerebel Superior עורק LAR).

figure-results-2
איור 2. תצוגת Transcranial לאחר הסרת השריר הזמני והתצוגה סכמטית של חסימת MCA. (א) לאחר הסרת השריר הזמני ניתן לראות את העורקים בקליפת המוח דרך הגולגולת השקופה באופן חלקי בעכבר (בעכברי 8-12 בן שבוע). סניף MCA הדומיננטי ניתן לזהות בחלק מקורי של התצוגה הזמנית, כמו גם עורקי קליפת המוח נוספים מסתעפים מן MCA וPCA בחלק הזנב. תצוגה (B) סכמטי על ענף MCA הדומיננטי בווריאציה הבולטת שלה עם הסתעפות בקליפת המוח הטמפורלית לרוחב לאחר קידוח חור בר והסרת הגולגולת. (C) ריבועים שחורים מייצגים את אתרי קרישת MCA בצדדים הפרוקסימלית ומ דיסטלי של הסתעפות.

= "תמיד"> בעמודים figure-results-3
איור 3. ניתוח של גירעונות התנהגותיים. (א) בדיקת צילינדר ההגדרה: העכבר ממוקמת לגליל אנכי ומראות ממוקמות מאחורי כדי לרשום את כל התנועות באמצעות מצלמת וידאו (ב) סימטריה שימוש Forelimb נותחה באמצעות מבחן הצילינדר.. יחסי שמאל / ימין שימוש forelimb העצמאי חושבו 24 שעות לפני MCAO ובנקודתי זמן המצוין אחרי גיוס שבץ. N = 10, * p <0.05 בין נקודת זמן המצוינת ובסיס ערך (שליטה).

figure-results-4
איור 4. נפחית ניתוח אוטם ותוצאת אוטם לאחר MCAO דיסטלי. (א) תמונה מייצגת של חזיית העטרה מוכתמת סגולה cresylבסעיף 7 ימים לאחר MCAO. הקו הצהוב הוא מעיד על בחירה של קליפת המוח הנגדי (מימין) והקו האדום הוא בחירת הקליפה הלא infarcted (מוכתם) של מוח ipsilateral. האזור החיוור באונה השמאלית מתאר את אזור רקמת infarcted. (ב ') ניתוח אוטם נפח 10 המוח (כל נקודה מייצגת מוח אחד בודד) 24 שעות, 3 ימים ו -7 ימים לאחר קרישת MCA דיסטלי. הקו האדום האופקי מייצג את הממוצע, ברים שגיאה מציינים סטיית תקן. (C) סגול cresyl נציג סעיפים מוכתמים העטרה מוח כל 400 מיקרומטר ב7 ימים לאחר קרישת MCA. הפצה סכמטי של רקמת מוח infarcted 7 ימים לאחר MCAO (ד '). כל שקופית מתארת ​​את המידע שנצבר מהפצה אוטם (צבע מקודד כפי שצוין) בסעיף ניתנו ביחס לגבחת (תמונה שונה מ:. Liesz ואח', מוח, 2011; על ידי רשות של הוצאת אוניברסיטת אוקספורד). לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המודל הניסיוני של שבץ דיסטלי MCAO, הקבוע על ידי electrocoagulation transcranial - מה שנקרא "מודל הקרישה". מודל זה בינתיים הפך לאחד המודלים של בעלי החיים הנפוצים ביותר בשימוש במחקר שבץ ניסיוני 12. לעומת דגמי איסכמיה המוחית המוקדים אחרים, מודל הקרישה כפי שהוצג בסרטון הזה יש את היתרון של זמן פעולה קצר מאוד של כ 10 דקות כאשר היא מבוצעת על ידי מדען מאומן. לפיכך, יכולות להיות מושגת פעמים הרדמה קצרות במודל זה, אשר הוא תכונה חיובית של מודל שבץ ניסיוני בגלל ההשפעה של חומרי הרדמה על תוצאת neuroprotection ושבץ ידועה 15. יתר על כן, כפי שתואר בעבר על ידי קרמייקל ואח'. 11, אנו מאשרים כי כתוצאה אוטם הנפח והלוקליזציה לאחר קרישת MCA הקבועה דיסטלי מתאים לנגעים במוח איסכמי ברוב המכריע של בני אדםמשיכות באופן יחסי לגודל מוח. השבץ המוחי אנושי הוא בעיקר בגודל קטן עם נגעים של כ 5-15% מהאונה, המבוסס על מחקרי אוכלוסייה קודמים וניסויים הדמיה קליניים 16-18, בניגוד לנגעי שבץ נרחבים עם בצקת במוח דחיסה אשר מתרחשים בפחות מ 10% קליני מלטף 19. ובכך, נגעי שבץ בשטח MCA של כ 12% מאונת מושגת על ידי המודל שהוצג יכולים להיחשב רלוונטי translationally נפח פעימה. עם זאת, יש לו שיש לקחת בחשבון שזנים שונים עכבר או פרוטוקולי הרדמה בשימוש עשויים להשפיע על תוצאת נגע 20 הנפח.

תמותה במהלך תקופת המעקב אחרי גיוס שבץ במודל זה היא נעדר כמעט. התמותה הכוללת של פחות מ 5% כוללת בעיקר מקרי מוות במהלך המבצע בגלל סיבוכים או הקרבה anesthesiological כי לכת של קריטריוני הכללה. על מנת להצדיק את v הנמוךariability של מודל זה ואת שחזור שלה מעולה, אנו מציעים קריטריוני ההדרה הבאים: 1) כל דימום תת עכבישי במהלך המבצע. 2) בזמן מבצע זמן רב יותר מאשר 15 דקות. 3) recanalization של MCA לאחר שני ניסיונות לelectrocoagulation עם MCAO החולף בלבד. יתר על כן, בעלי חיים, יש לבחון מדי יום לאחר MCAO (התנהגות פיזיולוגית בסיסית, מראה פרווה ומשקל גוף) כדי לשלוט בכאב, אי נוחות או מחלה התנהגות.

מספר צעדים יכולים להיות מיושמים לצורך הניתוח של תוצאות שבץ כמו מדידת רבב לייזר, דימות תהודה מגנטית, בדיקות התנהגותיות או ניתוח היסטולוגית. בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטות למופת לניתוח התנהגות וניתוח אוטם נפח. כמה מבחן לניתוח התנהגותי לאחר איסכמיה מוחית מוקד פותחו ומשמש במחקר שבץ ניסיוני. בדיקות מתאימות לתפקוד חושי השתמש בעבר על ידי הקבוצה שלנו באנו 21,22 מודל שבץ זהמחדש את מבחן Rotarod 23, בדיקת תווית דביקה 24, מבחן הפינה 25 ובדיקת הצילינדר 13, אשר באה לידי ביטוי בסרט הזה. בדיקת הצילינדר מתארת ​​באופן עקבי סימטריה מוטורית בשלב האקוטי לאחר MCAO קבע דיסטלי וגם מזהה להחזיר רצוף של תפקוד מוטורי.

למרות היתרונות ברורים, כמה מגבלות של מודל שבץ זה צריכה להילקח בחשבון. ראשית, בקידוח של הגולגולת נדרש כדי להקריש את העורק, ובכך לייצר גישת פוטנציאל לפרי מבצעי זיהומים של המוח, אם כי זיהומים חיידקיים של פצע הניתוח, שרירים זמניים או המוח עצמו מעולם לא אותרו על ידי עצמנו או שתועד על ידי אחרים באמצעות מודל זה. יתר על כן, נזק מכאני לקליפת המוח במהלך הכנה וקרישה לא ניתן לשלול, אבל יכול להיות מוגבל על ידי קידוח זהיר וההסרה של הגולגולת, humidification המתמיד של האתר כירורגית וne המינימלי electrocoagulation cessary (ראה קריטריוני הדרה). אמנם במהלך MCA כמתואר באיור 2 נמצא ברוב המכריע של C57Bl / 6 עכברים, אנו מתארים בפרוטוקול כיצד להמשיך בוריאציות נורמליות של קורס הכלי כדי למזער את השתנות מודל. יתר על כן, אנו ממליצים על השימוש במספר רב (3 במקרה של הסתעפות; 2 ללא הסתעפות של MCA) אתרי חסימה כדי למזער את הסיכון של recanalization החלקית של MCA, אשר בניסיון שלנו הוא גורם חשוב להשתנות של מודל זה.

במונחים של בדיקות התנהגותיות, יכולים להתגלות רק גירעונות התנהגותיים קלים בבדיקות התנהגותיות הנ"ל והתחדשות תפקודית ניתן לצפות בתוך השבוע לאחר אירוע מוחי הראשון. לכן, מערכות בדיקה מתקדמות יותר ברגישות ובפרמטרי בדיקה איכותיות כמו מבחן לכת המיומן 27 גבוהים יותר עשויות להיות מתאימות יותר כדי לזהות תוצאה תפקודית לטווח ארוך במודל זה.

ontent "> לבסוף, בשל הקרישה הקבועה של MCA ניתן להשיג שום reperfusion, אשר הוא תכונה שנצפתה באחוז ניכר של חולי שבץ בשל תמוגה קריש הספונטנית או טיפול 28. עם זאת, מודל שבץ תרומבואמבוליים שתואר קודם לכן 26 מספק האפשרות למודל שבץ חינם עם reperfusion של איסכמיה המוחית בקליפת המוח. יחדיו, שחזור הגבוה, התצפית ארוך הטווח האפשרי בשל מינימאלית תמותה ולהשוות אוטם ביחס הנפח והלוקליזציה בגין ללטף אדם להבחין "מודל הקרישה" כמודל יקר ערך למחקר שבץ בסיסי וtranslational.

גילויים

יש המחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי המקבץ המצוינות של קרן המחקר הגרמנית "אשכול מינכן למערכות נוירולוגיה (סינרגיה)" ועל ידי קרן דיימלר בנץ לAL

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מצלמה Canon Eos 500Dשל Canon: 18-55 מ"מ; 30 פריימים לשנייה; פונקציית וידאו 640 x 480
מראהליל הבדולח267708930 x 30 ס"מ 
גליל זכוכית אקרילית שקוףH& S Kunststofftechnikקוטר: 8 ס"מ,   גובה: 25 ס"מ
שמיכת חימוםFHC בקר
מספריים עדיניםFST15000-00
מספריים מאיוFST1410-15
מלקחייםFST11616-15
כותנהNOBA Verbondmitel Danz974116
תמיסת מלחבראון131321
Bepanthen pommadeBayer
IsofluraneAbbotB506
מערכת הרדמה לאיזופלורןDrager
Stereomikroskop ZeissStemi DV4
ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerä t
מקדחהProxxonD-34343
קטמיןInresa Arzneimittel GmbH
קסילאציןאלברכט
5 מ"ל מזרק בראון
פוספט חוצץ מי מלח PH: 7.4Apotheke Innestadt Uni MünchenP32799
IsopentaneFluka59070
CryostatThermo Scientific CryoStarNX70
Superfrost Plus SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Cresyl VioletSigma Life ScienceC5042-10G
חומצה אצטיתSigma Life Science695092
אתנול 70%CLN Chemikalien Laborbedorf521005
אתנול 96%CLN Chemikalien Laborbedorf522078
אתנול 99%CLN Chemikalien LaborbedorfETO-5000-99-1
Roti-Histokit הרכבה בינוניתRoth6638.1
עכברי C57Bl/6J עכברינהר צ'ארלס000664
אופטיקה טמפרטורה DCמכשיר אלקטרו-כירורגי

מקורות

  1. Donnan, G. A., et al. Stroke. Lancet. 371, 1612-1623 (2008).
  2. Di Carlo, A., et al. Frequency of stroke in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. ILSA Working Group and the Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Italian Longitudinal Study on Aging. Neurology. 54, 28-33 (2000).
  3. Hacke, W., et al. Thrombolysis with alteplase 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke. N. Engl. J. Med. 359, 1317-1329 (2008).
  4. Jauch, E. C., et al. Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44, 870-947 (2013).
  5. Longa, E. Z., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  6. Engel, O., et al. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J. Vis. Exp. (47), e2423(2011).
  7. Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 123-135 (1997).
  8. Tamura, A., et al. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
  9. Chen, S. T., et al. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
  10. Tureyen, K., et al. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).
  11. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
  12. Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).
  13. Schallert, T., et al. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  14. Swanson, R. A., et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J. Cereb. Blood Flow Metab. 10, 290-293 (1990).
  15. Kitano, H., et al. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1108-1128 (2007).
  16. Effect of intravenous recombinant tissue plasminogen activator on ischemic stroke lesion size measured by computed tomography. NINDS; The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) rt-PA Stroke Study Group. Stroke. 31, 2912-2919 (2000).
  17. Sowell, E. R., et al. Mapping cortical change across the human life span. Nat. Neurosci. 6, 309-315 (2003).
  18. Brott, T., et al. Measurements of acute cerebral infarction: lesion size by computed tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
  19. Hacke, W., et al. Malignant' middle cerebral artery territory infarction: clinical course and prognostic signs. Arch. Neurol. 53, 309-315 (1996).
  20. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
  21. Liesz, A., et al. Boosting regulatory T cells limits neuroinflammation in permanent cortical stroke. J. Neurosci. 33 (44), 17350-17362 (2013).
  22. Liesz, A., et al. Inhibition of lymphocyte trafficking shields the brain against deleterious neuroinflammation after stroke. Brain. 134, 704-720 (2011).
  23. Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 259, 211(1968).
  24. Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nat. Protoc. 4, 1560-1564 (2009).
  25. Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. J. Neurosci. Methods. 117, 207-214 (2002).
  26. Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38, 2771-2778 (2007).
  27. Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33, 1869-1875 (2002).
  28. Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Arch. Neurol. 59, 1870-1873 (2002).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MCA

מאמרים קשורים