נוירונים דופמינרגיים ממלאים תפקיד ויסות חיוני במוח. אובדן שלהם קשור למחלת פרקינסון. בסרטון זה, אנו מראים כיצד ליצור תרביות ראשוניות של נוירונים דופמינרגיים מרכזיים ממזנספלון של עכברים עובריים. תרבויות כאלה שימושיות לחקר הפגיעות הקיצונית של נוירונים אלה ללחצים שונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוירונים דופאמין מהווים פחות מ -1% מהמספר הכולל של תאי עצב במוח. סכום זה נמוך של תאי עצב מווסת את תפקודי מוח חשובים כגון שליטה מוטורית, מוטיבציה, וזיכרון עבודה. נוירונים דופאמין Nigrostriatal להידרדר באופן סלקטיבי במחלת פרקינסון (PD). איבוד עצבי מתקדם זה קשור באופן חד משמעי עם הסימפטומים מנועים של פתולוגיה (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות שרירים ו). הסוכן העיקרי האחראי לניוון תא עצב דופאמין הוא עדיין לא ידוע. עם זאת, נוירונים אלה מופיעים להיות מאוד פגיעים בתנאים מגוונים. תרבויות עיקריות מהוות אחד המודלים הרלוונטיים ביותר לחקור תכונות ומאפיינים של נוירונים דופאמין. ניתן להגיש תרבויות אלה לסוכני מתח שונים המחקים פתולוגיה PD ותרכובות הגנה עצביות על מנת לעצור או להאט את הניוון עצבי. מודלים רבים מהונדסים העכבר של PD כי כבר generated בעשור האחרון גדל עוד יותר את האינטרס של חוקרים לתרבויות נוירון דופאמין. הנה, פרוטוקול הווידאו מתמקד בנתיחה העדינה של מוח עכבר העוברי. כריתה מדויקת של mesencephalon הגחון היא חיונית כדי להשיג תרבויות עצביות מספיק עשירות בתאי דופאמין כדי לאפשר מחקרים עוקבים. פרוטוקול זה יכול להתממש עם עכברים הטרנסגניים עובריים ומתאים לצביעת immunofluorescence, PCR כמותי, כימות שליח שני, או הערכת מוות / הישרדות עצבית.
מבוא
דופמין, אחד מהמוליכים העצביים במוח החיוני 1,2, בעיקר שפורסם על ידי דופאמין המוח התיכון הנוירונים (DA). רוב הנוירונים DA מתגוררים בחלק הגחוני של mesencephalon 2-6. סכמטי, ניתן לחלק את תאי עצב DA המוח התיכון בשלוש מבחינה אנטומית ותפקודי של מערכות שונות הקרנה: mesostriatal, mesolimbic, ומסלולי mesocortical 2,5. מסלול nigrostriatal מעורב במנוע התנהגות, מסלולי mesolimbic לשחק תפקיד חשוב בחיזוק, מוטיבציה, ולמידה, ואילו מסלולי דופאמין מקרינים לקליפת מוח הקדם חזיתית הם מעורבים בקוגניציה 2.
נוירונים DA מעורבים בכמה הפרעות נוי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
העכברים המשמשים בעבודה זו טופלו ויטופלו בהתאם להנחיות של מועצת האיחוד האירופית (86/609 / איחוד אירופי) לשימוש בחיות מעבדה.
.1 הכנת פתרונות הנדרשים
- פתרונות מניות
- פתרון 10x פולי-L-ornithine (אש"ף): לשקול את 10 מ"ג hydrobromide אש"ף (משקל מולקולרי = 30,000-70,000) ולפזר ב70 מ"ל של מים סטריליים. סנן את הפתרון באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן מזרק, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תרשים זרימה מאוירת של צעדי תרבות mesencephalon מוצג באיור 1. בקצרה, לאחר איסוף עוברי E13.5 מעכבר שוויצרי בהריון, mesencephalon הגחון הוא גזור מכל העובר. שברי המוח המבודדים הם ברציפות שהוגשו לעיכול אנזימטי וניתוק מכאני. תאים ניתקים הם pelleted על ידי צנטריפוגה, resuspended במדיום התרבות ומצופה בלוחות 12- או 24 גם מצופה מראש. תאים נשמרים עד 15 ימים ללא החלפה בינונית.
תרשים מפורט זרימה של נתיחת mese.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מציג את הנהלים וחומרים כימיים הדרושים כדי להכין את התרבות העיקרית של נוירונים mesencephalic מהעכבר העוברי והליך immunofluorescence לזהות נוירונים דופאמין. שלבים קריטיים של ההליך הם לנתיחה של העוברים והניתוק המכני של שברי המוח שנאספו. מכשירים לנתיחה באיכות גבוהים מסייע להשתלט על הטכניקה לנתיחה. נוירונים DA מהווים חלק קטן מmesencephalon. בהתאם לכך, איסוף החלק הימני של mesencephalon הגחון הוא חיוני להשגת תרבות המכילה 2-4% מתאי עצב DA. ניתוק מכאני צריך להתבצע בזהירות ובעדי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
נתמך על ידי מענקים מ-CNRS ו-INSERM. ראש הממשלה מכיר בתמיכת הקרן למחקר רפואי בצרפת (Equipe FRM 2009). SC מודה על תמיכתה של הקרן הצרפתית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סרום בקר עוברי | לונזה | 14-801F | |
| DMEM 4.5 גרם/ליטר גלוקוז עם L-גלוטמין | לונזה | BE12-604F | |
| 0.05% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדום | Life Technologies | 25300-054 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-גלוטמין, תמיסה של 200 מ"מ | Life Technologies | ||
| Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| דולבקו s Modified Eagle' s תערובת בינונית/תזונתית F-12 חזיר | סיגמא-אולדריץ' | D0547 | אבקת |
| למינין - 1 מ"ג/מ"ל ב-Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| פולי-L-אורניתין הידרוברומיד | סיגמא-אולדריץ' | P3655 | |
| אינסולין מלבלב חזיר | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin Human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| פוטרסין דיהידרוכלוריד | סיגמא-אולדריץ' | P5780 | |
| פרוגסטרון | סיגמא-אולדריץ' | P8783 | |
| נתרן סלניט | סיגמא-אולדריץ' | S5261 | |
| HEPES | סיגמא-אולדריץ' | H4034 | |
| גליצין | סיגמא-אולדריץ' | G7126 | תמיסת מלאי 1 M במים |
| ג'לטין | סיגמא-אולדריץ' | G9391 | תמיסת מלאי 2% (w/v) במים |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% במים | מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים | RT 15710-S | |
| נתרן ביקרבונט (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-גלוקוז, מונוהידראט | Merck Millipore | 4074-2 | |
| חומצה הידרוכלורית - c(HCl) = 1 מול/ליטר (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| מים סטריליים - Aqua B. | Braun | ||
| אתנול מוחלט NORMAPUR מגיב אנליטי | VWR | 20821.321 | |
| צלחות פטרי סטריליות | VWR | 82050-566 | |
| פיפטות פסטר זכוכית רגילה - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| תא ספירה Malassez | VWR | 631-0975 | |
| מסנן מזרק Acrodisc סרום עם קרום Supor, סטרילי, GF/0.2 ומיקרו; m, 37 מ"מ | PALL Life science | 4525 | |
| מספריים כירורגיים - ישרים, חדים-חדים, באורך 14.5 ס"מ | Fine Science Tools | 14002-14 | לפתיחת דופן הבטן |
| מספריים - ישרים, מחודדים, עדינים, באורך 10 ס"מ | MORIA | 4877A | לפתיחת דופן הרחם |
| מלקחיים - לסתות מעוקלות, רגילות, משוננות 1 מ"מ | MORIA | 2183 | למניפולציה של עוברים |
| Vannas מספריים - מעוגלים, מחודדים, 7 מ"מ | MORIA | MC50 | להוצאת מלקחיים עדינים במיוחד של mesencephalon |
| - מעוקל, עדין, באורך 13 ס"מ | MORIA | 9987 | להסרת קרומי המוח |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12 בארות צלחת תרבית תאים, תחתית שטוחה עם מכסה | BD Bioscience | 353043 | |
| שקופיות מיקרוסקופ SuperFrost, קצוות קרקע 90º | מנזל-GL ואומל; משקפי כיסוי מדויק SER | AG00008032E | |
| עובי מס' 1.5H עגול 18 מ"מ Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| ארנב פוליקלונלי חלבון הקשור למיקרו-צינוריות 2 (MAP2) נוגדן | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| נוגדן חד-שבטי נגד גלוטמט דקרבוקסילאז (GAD67), שיבוט 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| נוגדן נגד טרנספורטר נגד דופמין (DAT) חולדה חד-שבטית, שיבוט DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| נוגדן | עכבר 1/8,000 - מתנה נדיבה מאיב צ'רניי (שוויץ, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| סרום עיזים, ניו זילנד Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 עיזים נגד ארנב IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 עז נגד חולדות IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet הרכבה Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| סטריאומיקרוסקופ | קרל זייס מיקרוסקופיה | Stemi-2000C | |
| מבער בונסן FIREBOY | פולקסווגן | 451-0136 |
מקורות
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
- Dahlstro....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
