מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Summary

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה לאפיון תכונות ההדבקה הפנימיות של מולקולות הידבקות תאים משוערות. האקטודומיין המופרש המתויג באפיטופ של מולקולת הידבקות תאים נלכד ממדיום התרבות על חרוזים קטנים ואחידים מתפקדים. לאחר מכן ניתן להשתמש בחרוזים אלה באופן מיידי במבחני צבירת חרוזים פשוטים.

Abstract

הידבקות תאי תאים היא יסוד לחיים רב תאיים ומתווכת על ידי מערך מגוון של חלבונים בתא שטח. עם זאת, האינטראקציות הדבקה לרבים מחלבונים אלו הם הבינו היטב. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, מהירה לאפיון מאפייני ההדבקה של מולקולות הידבקות תא homophilic המשוערות. HEK293 תאים בתרבית הם transfected עם פלסמיד דנ"א קידוד ectodomain של חלבון בתא שטח מופרש, epitope מתויג. באמצעות חרוזים פונקציונליות ספציפיים לתג epitope, החלבון המסיס, מופרש ההיתוך הוא נתפס ממדיום התרבות. לאחר מכן ניתן להשתמש חרוזים המצופים ישירות במבחני צבירת חרוז או בחרוז ניאון מיון מבחני לבדיקת הידבקות homophilic. אם תרצה, mutagenesis לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להבהיר את חומצות אמינו הספציפיות או תחומים הנדרשים להידבקות. assay זה דורש רק כמויות קטנות של חלבון ביטא, אינו מחייב את הייצור של שורות תאי יציבות, ויכול להיות עכוmplished ב4 ימים.

Introduction

הידבקות תאי תאים חיונית לפיתוח ושלמותם של אורגניזמים רב תאיים ומתווכת על ידי מערך מגוון של מולקולות פני השטח של תא. רב של מולקולות הדבקה אלה זוהו ואופיין, שרבים יישארו להתגלות. מספר שיטות משמשות כדי לחקור את התכונות של מולקולות הידבקות תא (מצלמות), כוללים מבחני מיון תא, מבחני צבירת תא ^1-8 ושיטות biophysical, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי וכוח ספקטרוסקופיה משטח ^9-12.

המורכבות אפילו פשוטים במערכות מבחנה באמצעות שורות תאים עושה את זה קשה לקבוע את מאפייני ההדבקה של CAM משוער. בדרך כלל, מולקולה נחשבת CAM אם זה גורם להצטברות של תאים כאשר transfected לקו תא הלא דביק. עם זאת, ברור שזה לא עדות ישירה של פעילות הדבקה. למשל, להקל על מסירת השטח פני תא או יציבותCAM היה גם לגרום להצטברות תא גדל ^1,13. יתר על כן, CAM אמיתי עלול להיכשל לתווך צבירת תא אם שורת התאים חסרת שיתוף גורמים אחרים הנדרשים למשלוח פני תא או התייצבות.

כדי להימנע מגורמים שמסבך אלה, יותר מבחני ישירים יכול להיות מועסקים המבוססים על הרעיון כי אינטראקציות דבקים צריכים להיות רכוש ביוכימיים פנימי של תחום תאי. בעוד חרוזים בתחילה שימשו לאפיין Ng-CAM ^2, אלה מבחני שהורחבו על מנת לחקור ^12,14,15 הידבקות בתיווך cadherin. שימוש בשילוב של שילובי ectodomain-FC C-cadherin, המעבדה Gumbiner הראתה כי חזרות cadherin מרובות לתרום לhomophilic אינטראקציות ^14. שימוש במבחני צבירת חרוז דומים, E-cadherin והידבקות N-cadherin גם היו מאופיין ^12,15, כמו שיש לי מספר protocadherins ^1,15-18 וisoforms Dscam מדרוזופילה ^19. כאן אנו מתארים assay יחסית פשוט והמהיר לאפיון הפעילות הדבקה של ectodomains של מצלמות המשוערות homophilic (איור 1) המופרש, מתויג epitope. יש לנו בשימוש assay זה בעיקר כדי לאפיין חברי superfamily cadherin.

Protocol

.1 תא הכנה (יום -2 ל0)

1. פיצול תאי HEK293 1: 5 באמצעות 0.05% פתרון טריפסין-EDTA ודגירה בצמיחת מדיה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ עד 60 - 80% ומחוברות (2 - 3 ימים). עבור כל תנאי, תאי תרבות ב2 x 100 מנות מ"מ.

.2 Transfection תא (יום 1)

1. Transfect HEK293 תאים עם FC-היתוך קידוד פלסמיד באמצעות מגיב transfection כגון Lipofectamine. גם שיטות חלופיות שתבאנה ליעילות transfection הדומה ניתן להשתמש.
2. חזור תאי transfected לחממה ל24 שעות.

.3 תא רביה (יום 2)

1. צמיחת מדיה מחממים ללא סרום שור העוברי (-FBS) ל37 מעלות צלזיוס.
2. יש לשטוף את הכלים 2x עם 10 מ"ל צמיחת מדיה -FBS, ולהחזיר את המנות ל37 מעלות צלזיוס החממה במשך שעה 1.
3. יש לשטוף את זמן מנות תרבויות אחד יותר עם 10 מ"ל צמיחת מדיה -FBS, עבור הסכום כולל של 3 שוטף.
4. Incuבייט HEK293 תאי transfected על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחרת 48 ללא FBS לפני איסוף תקשורת.

.4 ביד צבירה (יום 4)

1. כדי לאסוף מדיה ממנות התרבות, להעביר מדיה מכל זוג של מנות ל50 צינורות מ"ל וספין חרוטי ב XG 500 במשך 5 דקות עד גלולה פסולת הסלולר.
2. תקשורת מסנן מצינור חרוטי 50 מ"ל לתוך מסנן צנטריפוגלי באמצעות מזרק 30 מ"ל ו0.45 מיקרומטר מסנן מזרק.
3. ספין מסנני צנטריפוגלי ב4,000 XG ו -4 ° C עד נפח של תקשורת בתרבות המרוכזת הוא כ 500 μl (כ 15 דקות). חזור על פעולה עד כל התקשורת והתרבות כבר הוסיפה ומרוכזת.
4. הוסף 1.5 μl של חרוזים מגנטיים חלבון G ל1 מ"ל של קר כקרח כריכת מאגר בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge עבור כל דגימה, מקום על מגנט ולהסיר חיץ. מייד להוסיף תקשורת והתרבות המרוכזת לחלבון G חרוזים מגנטיים.
5. סובב צינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
6. Plצינורות אס על מגנט ולהסיר תקשורת. מהר לשטוף חרוזי פעמיים עם קרח קר 1 מ"ל חיץ מחייב, ולאחר מכן resuspend חרוזים ב300 μl חיץ מחייב.
7. פיצול resuspended חרוזים לתוך 2 צינורות, 150 μl לתוך צינור אחד, ולאחר מכן להוסיף 1.5 μl של 200 מ"מ CaCl ₂ או 200 mM EDTA ל" סידן "ותנאים" אין סידן ", בהתאמה.
8. העברה מכל מצב 100 μl לדיכאון גם להחליק ולאסוף micrographs באמצעות מיקרוסקופ מועבר אור (איור 2). לאסוף תמונות מ5 שדות של תצוגה עבור כל ניסוי בכל נקודת זמן רצויה.

ניתוח .5 נתונים

1. באמצעות ImageJ, או תוכנת ניתוח תמונה דומה, פתח את אחת מחמש מערכות נתוני תמונה באמצעות יבוא תמונת הרצף / ... מהתפריט הנפתח קובץ. אלה ייפתחו כערימת תמונה.
2. בתמונה / מאפיינים ... תיבת הדו שיח, לשנות את iיחידות קוסם לפיקסלים ורוחב פיקסל להגדיר ופיקסל ל1.0.
3. להמיר את התמונות לינארי באמצעות / הסף ... הפקודה התאם בתפריט תמונה. לקבוע את הסף לכולל פיקסלים שתורמים לחרוזים או אגרגטים חרוז, אבל שלא לכלול רקע וחלקיקים קטנים. אחול על כל התמונות בערימה.
4. בתיבת הדו שיח מדידות הסט, סמן את תיבות פינת וסטאק התפקיד.
5. הפעל לנתח חלקיקים ... בניתוח תפריט הנפתח. זה יהיה ליצור רשימה של חלקיקים מזוהים, כולל גודלם (שטח) ואת התמונה שבה הם זוהו.
6. חזור על תהליך זה עבורו ניסוי ותנאי ניסוי.

Results

דוגמא לניסוי מוצג באיור 2, אשר מציג צבירת חרוז סידן תלוי על ידי ectodomain של N-cadherin התמזג Fc (NcadEC-FC). בהעדר סידן, חרוזים תערוכת נטייה קטנה או לא כדי לצבור ואין עלייה בגודל כולל עם זמן (איור 1 א, ג). בנוכחות סידן, חרוזים מצופים בצבירה איתנה מופע NcadEC-FC, עם גודל כולל הגדלת לאורך הזמן (איור 1 ב, ג). ניסוי זה חזר על עצמו שלוש פעמים, עם כל מופע המורכב מתמונות מחמישה שדות שאינם חופפים. גודל החלקיקים באזור פיקסל נקבע עבור כל ...

Discussion

הידבקות תא היא תכונה חיונית של חיים רב תאיים ומתווכת על ידי מגוון רחב של חלבונים בתא שטח. מבין אלה, מאפייני הדבקה מפורטים הם הבינו רק חלק קטן יחסית. הנה, יש לנו תארנו פרוטוקול פשוט, מהיר לחקירת היכולת הדבקה homophilic של ectodomains המופרש התמזג תג epitope נוח. לגישה זו יש מספר היתרונות חשובים. ראשית, שורות תאי יציבות אינן נדרשות ^14,20, ככמויות מספיקות של חלבון יכולות להיות שנוצרו על ידי transfection החולף של 100 מנות מ"מ. זה מאפשר ההקרנה של מספרים גדולים יותר של מ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFc-N1 פלסמיד	Addgene	<חזק>להגשה
HEK293 תאים	תרבית מסוג אמריקאי	CRL-1573
DMEM	Mediatech - Corning	10-013-CV
סרום בקר עוברי (FBS)	Sigma	F2442
100x Pen-Strep (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300054
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668030
Dynabeads – חלבון G	Life Technologies	10003D
סרום בקר אלבומין	סיגמא	A3294
שקופיות דיכאון	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	71878-06
Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי עם קרום Ultracel-10	Millipore	UFC901024
מסנן מזרק 0.45 מ"מ	Sarstedt	83.1826
Dynamag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
פיג'י (ImageJ) תוכנת ניתוח תמונה	http://fiji.sc/Fiji
טבלה של מאגרים/פתרונות
צמיחה מדיה	DMEM + 10% FBS + מסנן עט-סטרפטוקוס	לעקר ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
מדיה צמיחה – מסנן	FBS DMEM + Pen-Strep	לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
מאגר מחייב	50 מ"מ טריס, pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl, 0.2% מערבולת BSA	עד להמסה, שמור על קרח.