אנדוציטוזיס בתיווך קלת'רין, תהליך מהיר ודינמי ביותר שמפנים חלבונים רבים, כולל קולטני איתות. הפרוטוקול המתואר כאן מדמיין ישירות את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. זה חיוני להבנת האופן שבו חברי הליבה של המנגנון האנדוציטי מתאמים זה עם זה, וכיצד מטען החלבון משפיע על תהליך זה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית
במאמר זה
סיכום
תקציר
קולטני איתות חשובים רבים מופנמים באמצעות התהליך הנחקר היטב של אנדוציטוזיס בתיווך קלתרין (CME). בדיקות ביולוגיות מסורתיות של תאים, המודדות שינויים גלובליים באנדוציטוזיס, זיהו למעלה מ-30 רכיבים ידועים המשתתפים ב-CME, ומחקרים ביוכימיים יצרו מפת אינטראקציה של רבים מהרכיבים הללו. עם זאת, מתברר יותר ויותר כי CME הוא תהליך דינמי ביותר שהרגולציה שלו מורכבת ועדינה. בכתב יד זה, אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) כדי להמחיש ישירות את הדינמיקה של רכיבי המנגנון האנדוציטי בתיווך קלתרין, בזמן אמת בתאים חיים, ברמת האירועים הבודדים המתווכים תהליך זה. גישה זו חיונית כדי להבהיר את השינויים העדינים שיכולים לשנות את האנדוציטוזיס מבלי לחסום אותה באופן גלובלי, כפי שניתן לראות בוויסות פיזיולוגי. אנו נתמקד בשימוש בטכניקה זו כדי לנתח תחום עניין מתעורר, תפקידו של הרכב המטען בוויסות הדינמיקה של בורות מצופים קלתרין מובחנים (CCP). פרוטוקול זה תואם למגוון בדיקות פלואורסצנטיות זמינות באופן נרחב, וניתן ליישם אותו להמחשת הדינמיקה של מולקולות מטען רבות המופנמות מפני השטח של התא.
מבוא
התהליך של אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) תלוי בהגעה מתוזמן היטב של מרכיבים הרבים של מכונות endocytic בתיווך clathrin לאסוף מטען ולתפעל את קרום הפלזמה לתוך שלפוחית 1-3. CME הוא ביוזמת חלבוני עיוות קרום ומטען מתאם שמגיעים יחד באתרים המתהווים של אנדוציטוזה 1. חלבונים אלה לגייס clathrin חלבון מעיל, אשר מרכיבה לתוך מבנה דמוי כלוב שיוצר את הבור מצופה clathrin (מק"ס) 4. ברגע שהמפלגה הקומוניסטית הסיני מורכב במלואו לצורה כדורית, scission קרום, בעיקר באמצעות פעולה של GTPase הגדול, dynamin, יוצר שלפוחית חופשית מצופה clathrin (CCVs) 5,6. הפנמה זו מעוררת פירוק מהיר של מעיל clathrin, המאפשר ר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1 ביטוי של מתויג fluorescently CME רכיבים בתאים בתרבית
HEK293 תאים הם תאי מודל שימושיים שהיה בשימוש נרחב כדי ללמוד ביולוגיה GPCR ואנדוציטוזה, ומשום כך הם משמשים כמודלים בפרוטוקול זה. השתמש בכל פרוטוקול transfection מתן ביטוי אחיד ללא ביטוי יתר ורעיל נמוכים.
- לטפל בכל תרבית התאים בזרימה למינרית סטרילי. מלא 4 בארות של צלחת 12 גם עם 1 מ"ל של מדיה חיונית (DMEM) השתנה Dulbecco עם 10% בסרום שור עוברי (FBS). מבקבוק T25 ומחוברות של תאי HEK293 לדלל 1:50, 1:25, 01:16, 01:10 בהתאמה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בתאי החיים TIRF מיקרוסקופית יש לנו נרשם דינמיקת endocytic של μ-אופיואידים קולטן (מור), קולטן G-חלבון בשילוב (GPCR) וβ-arrestin חלבון מתאם endocytic. מבנה β-arrestin היה transfected זמני לקו תא מור ביציבות להביע באמצעות הפרוטוקול המתואר באיור 1, וצלם 96 שעה מאוחר יותר. מור בשורת התאים היציב הוא N-סופני מתויג עם GFP pH רגיש. חלבון פלואורסצנטי זה מאיר רק בנוזל החוץ תאי הניטרלי. כמו כן, מור endocytoses רק הופעל בעבר על ידי אגוניסט, ונשאר אחר מתחלק באופן שווה על .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מתארים את השימוש בTIRFM לדמיין אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) ברמה של CCPs הבודד בתאים חיים בזמן אמת. CME הוא אירוע מהיר ודינמי מאוד מתווך על ידי ההשפעה המצטברת של אירועים בודדים רב מרחב ובזמן נפרד. רוב מבחני המשמשים כיום, כגון מדידות ביוכימיים של הפנמה באמצעות biotinylation משטח או ליגנד המחייב, זרימת cytometry או מבחני תאים קבועים למדידת כמות חלבונים הפנימו, או הלוקליזציה מיקרוסקופית אלקטרונים של חלבונים, לעקוב אחר שינויי הרכב בלוקליזציה חלבון בנקודות זמן קבועות . שיטו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות לד"ר C. Szalinski, H. Teng ו-M. Bruchez על העזרה עם Imaris, R. Vistein ו-D. Shiwarski על העזרה הטכנית והייעוץ, ולד"ר M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin ו-Dr. W Almers על ריאגנטים ודיון מועיל. המימון הניתן על ידי מענק T32 NS007433 ל-SLB ו-NIH DA024698 ו-DA036086 ל-MAP.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM/גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין ונתרן פירובט | פישר סיינטיפיק | ||
| תמיסת מלח פוספט בופר (DPBS) של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום | Gibco, מאת Life Technologies | 21600-010 | |
| חומצה חופשית | EDTA Amresco | 0322-500G | |
| סרום בקר עוברי | Gibco, מאת Life Technologies | 10437-028 | |
| L-15 Medium של לייבוביץ, ללא פנול אדום | Gibco, מאת Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, מאת Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE מאת Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | מגיב טרנספקציה |
| 25 מ"מ כיסוי זכוכית Fisher | Scientific | 12-545-86 | |
| צלוחיות מטופלות בתרבית תאי קורנינג, 25 ס"מ2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| תרבית תאים 6 בארות צלחת | Greiner Bio-One, מאת VWR | 82050-896 | |
| מונוקלונלי ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-מלח אנקפלין אצטט (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 ערכת | תיוג חלבוןLife Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris תוכנת ניתוח תמונות | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, לניתוח אוטומטי | |
| מיקרוסקופ הפוך Nikon Eclipse Ti ואביזרים נדרשים כולל קוביות פילטר ומסננים | זרוע Nikon | ||
| TIRF עם מתאמים נדרשים עבור Nikon Eclipse Ti | Nikon | להתאמת זווית התרחשות | |
| מצלמת iXon+ EMCCD ומתאמים | Andor |
מקורות
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clath....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
