הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

70.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51805

⸱

20 באוקטובר 2014

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

במאמר זה

סיכום

אנדוציטוזיס בתיווך קלת'רין, תהליך מהיר ודינמי ביותר שמפנים חלבונים רבים, כולל קולטני איתות. הפרוטוקול המתואר כאן מדמיין ישירות את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. זה חיוני להבנת האופן שבו חברי הליבה של המנגנון האנדוציטי מתאמים זה עם זה, וכיצד מטען החלבון משפיע על תהליך זה.

תקציר

קולטני איתות חשובים רבים מופנמים באמצעות התהליך הנחקר היטב של אנדוציטוזיס בתיווך קלתרין (CME). בדיקות ביולוגיות מסורתיות של תאים, המודדות שינויים גלובליים באנדוציטוזיס, זיהו למעלה מ-30 רכיבים ידועים המשתתפים ב-CME, ומחקרים ביוכימיים יצרו מפת אינטראקציה של רבים מהרכיבים הללו. עם זאת, מתברר יותר ויותר כי CME הוא תהליך דינמי ביותר שהרגולציה שלו מורכבת ועדינה. בכתב יד זה, אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) כדי להמחיש ישירות את הדינמיקה של רכיבי המנגנון האנדוציטי בתיווך קלתרין, בזמן אמת בתאים חיים, ברמת האירועים הבודדים המתווכים תהליך זה. גישה זו חיונית כדי להבהיר את השינויים העדינים שיכולים לשנות את האנדוציטוזיס מבלי לחסום אותה באופן גלובלי, כפי שניתן לראות בוויסות פיזיולוגי. אנו נתמקד בשימוש בטכניקה זו כדי לנתח תחום עניין מתעורר, תפקידו של הרכב המטען בוויסות הדינמיקה של בורות מצופים קלתרין מובחנים (CCP). פרוטוקול זה תואם למגוון בדיקות פלואורסצנטיות זמינות באופן נרחב, וניתן ליישם אותו להמחשת הדינמיקה של מולקולות מטען רבות המופנמות מפני השטח של התא.

מבוא

התהליך של אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) תלוי בהגעה מתוזמן היטב של מרכיבים הרבים של מכונות endocytic בתיווך clathrin לאסוף מטען ולתפעל את קרום הפלזמה לתוך שלפוחית ​​1-3. CME הוא ביוזמת חלבוני עיוות קרום ומטען מתאם שמגיעים יחד באתרים המתהווים של אנדוציטוזה 1. חלבונים אלה לגייס clathrin חלבון מעיל, אשר מרכיבה לתוך מבנה דמוי כלוב שיוצר את הבור מצופה clathrin (מק"ס) 4. ברגע שהמפלגה הקומוניסטית הסיני מורכב במלואו לצורה כדורית, scission קרום, בעיקר באמצעות פעולה של GTPase הגדול, dynamin, יוצר שלפוחית ​​חופשית מצופה clathrin (CCVs) 5,6. הפנמה זו מעוררת פירוק מהיר של מעיל clathrin, המאפשר רכיבים לשימוש חוזר לסבבים רבים של CME.

הגילוי והאפיון של החלבונים המעורבים בCME כבר מושרשים בbioch המסורתיוטכניקות emical, גנטיות, מיקרוסקופיה 4-6,8. מבחני אלה הובהרו התפקידים ונקודות אינטראקציה של מרכיבי endocytic אלה. למרות שמאוד שימושי להגדרת מרכיבים חיוניים של מכונות סחר, מבחני אלה מוגבלים מאוד בלכידת ההתנהגות הדינמית של רכיבי CME או ריכוז מטען. זוהי מגבלה קריטית, שכן CME הוא מונע על ידי ההרכבה כוריאוגרפיה של קבוצות של מודולים חלבון בצעדים מוגדרים, וכן שינויים קטנים בדינמיקה של אירועי endocytic בודדים יכולים להיות השלכות מצטברות גדולות באנדוציטוזה. יתר על כן, הנתונים אחרונים מצביעים על כך שCCPs הבודד עשוי להיות שונה הן בהרכב ובהתנהגות, המצביעה על כך הרגולציה הפיזיולוגית של תהליך זה היא מאוד במרחב ובמוגבל 9-14 בזמן. לדמיין אירועי endocytic פרט, לכן, הוא חיוני כדי להבין מדוע יש חלבונים מרובים מיותרים מעורבים בCME וb איך אפשר לבקר את החלבונים האלהאותות פיסיולוגיים y להסדיר הפנמת מטען.

כאן אנו מתארים את השימוש בסך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM) להתבונן CME ברמה של הדינמיקה של CCPs הבודד בתאים חיים. TIRFM מסתמך על ההבדל במקדם שבירה בין coverslip הזכוכית וסביבת הנוזל של תאי 15,16. כאשר אור העירור מכוון לתאים של יותר מ הזווית הקריטית, זה בא לידי ביטוי באופן פנימי, יצירת גל חולף ששומר על שדה דק של תאורה המשתרע כ 100 ננומטר מעל coverslip. הדבר מבטיח כי מולקולות הניאון רק בתחום צר זה שמחים. למעשה, זה מאפשר העירור של מולקולות ניאון על או ליד קרום הפלזמה, וממזער את הקרינה מחלקי הפנים של התא. זה מספק רזולוציה יחס וציר z אות לרעש גבוהה באופן משמעותי כדי לחזות אירועים בקרום פלזמה, שיתוףmpared למצבים נפוצים יותר כגון epifluorescence הקונבנציונלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. אנו גם מתארים, במבוא וברמה מעשית, השימוש בפלטפורמת ניתוח תמונה נפוץ לנתח ולכמת תכונות מורפולוגיות פשוטות ודינמיקה של אירועי endocytic המטען אישיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1 ביטוי של מתויג fluorescently CME רכיבים בתאים בתרבית

HEK293 תאים הם תאי מודל שימושיים שהיה בשימוש נרחב כדי ללמוד ביולוגיה GPCR ואנדוציטוזה, ומשום כך הם משמשים כמודלים בפרוטוקול זה. השתמש בכל פרוטוקול transfection מתן ביטוי אחיד ללא ביטוי יתר ורעיל נמוכים.

  1. לטפל בכל תרבית התאים בזרימה למינרית סטרילי. מלא 4 בארות של צלחת 12 גם עם 1 מ"ל של מדיה חיונית (DMEM) השתנה Dulbecco עם 10% בסרום שור עוברי (FBS). מבקבוק T25 ומחוברות של תאי HEK293 לדלל 1:50, 1:25, 01:16, 01:10 בהתאמה לכל אחד 4 הבארות.
    1. לחלופין, תאי זרע לצלחת רבות גם של גודל רצוי, לפי הוראות יצרן. זרעי .4-2 x 10 4 תאים לתוך צלחת 12 גם. לגדול תאי לילה ב37 מעלות צלזיוס סטרילי עם 5% CO 2 ולחות 95%.
      הערה: בהתחשב בכך שr הצמיחהates משתנה בהתאם לתנאים ושורות תאים, שזה עשוי להיות עדיף על זרע בארות מרובות כדי להבטיח confluency האידיאלית עבור transfection למחרת או את האפשרות של ביצוע transfections בשני עותקים.
  2. למחרת בבוקר, בחר גם שהוא ~ ומחוברות 70% עבור transfection (ראה איור 1). אם הגיע לא טוב המצב הזה, לחכות עוד יום.
    הערה: confluency 70% היא אידיאלית עבור HEK293 תאים. Transfecting תאים המהווים את תוצאה דלילה יותר במוות של תאים ורעילות. Transfecting תוצאות תאים מעל ומחוברות בביטוי עני.
  3. הוסף 60 μl חיץ EC (מערכת transfection), 400 ng של פלסמידים קידוד מתויג GPCRs ו / או רכיבים של מכונות clathrin, ו2.4 μl של Enhancer לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, כפי שמתואר בפרוטוקול של היצרן. מערבולת למשך 2 שניות כדי להבטיח ערבוב מספיק, ולהסתובב בmicrofuge ב2,000 XG עבור 2 שניות כדי לאסוף את הנוזלים בתחתית.
  4. הוספה6 μl Effectene כפי שמתואר בפרוטוקול של היצרן. מערבולת למשך 2 שניות, וספין ב2,000 XG עבור 2 שניות בmicrofuge לאסוף את הנוזל בתחתית. חכה ל20 דקות, כדי לאפשר היווצרות של מיצלות המורכבת transfection.
  5. תקשורת לשאוב מהבאר להיות transfected. בעדינות להוסיף 0.8 מ"ל של DMEM עם 10% FBS לתערובת מגיב transfection ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה באיטיות להפחתת שבירת מיצלות. הוסף את התקשורת ותערובת transfection לטוב מאוד לאט מהצד. להוסיף כל תערובת transfection שנותר מצינור microcentrifuge אל הבאר באמצעות micropipettor.
    הערה: לחלופין, להוסיף 0.5 מ"ל נוסף של DMEM עם 10% FBS אל באר transfected לתת תאי תזונה נוספת וכתוצאה מכך transfection העדין וביטוי נמוך יותר חולף.
  6. להחזיר את התאים ל37 מעלות צלזיוס החממה במשך 5 שעות.
  7. תקשורת לשאוב מכילה תערובת transfection. החלף עם 1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS. לאפשרהתאים לגדול בין לילה.
  8. למחרת, להעביר את התאים לcoverslips ללא ציפוי, מעוקר בעבר על ידי מעוקר.
    1. הוסף 0.5 מ"ל של בופר פוספט (PBS) עם 1 mM EDTA היטב כל אחד. לחלופין, להשתמש 0.5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA. השאר בחממה במשך דקות 1.
    2. הנח סיבוב 3, coverslips 25 מ"מ סטרילי לתוך בארות נפרדות של צלחת 6 היטב. ממלא כל היטב עם 2 מ"ל של תקשורת. דחף בעדינות את coverslip עד לתחתית הבאר כדי למנוע מתאים מהגידול בחלקו התחתון של coverslip.
    3. ידני להתסיס גם כדי להרים את התאים מתחתית הבאר. הוסף 1 מ"ל של DMEM עם FBS 10% לresuspend. הפץ את התאים הרימו מהיטב 1 של 12 גם צלחת באופן שווה בין 3 coverslips. לחלופין, תאי צלחת על 3 מנות עם רצפת זכוכית.
  9. לאפשר לתאים לגדול על coverslips לפחות 48 שעות לפני ההדמיה. ודא שתאים פרושים ושטוח.

2.TIRFM באמצעות הדמיה המק"ס וDynamics המטען

  1. נוגדנים נגד דגל המצומד M1 עם צבעי Alexa באמצעות ערכת תיוג חלבון אלקסה פלואוריד על פי הפרוטוקול של הייצור. לחלופין, נוגדנים מראש מצומדות ניתן לרכוש.
  2. טרום דגירה תאים עם הנוגדנים בדילול 1: 1,000 ב 1 מ"ל של מדיום ליבוביץ מראש חימם עם 10% FBS, או Opti-ממ עם 50 FBS 7.4 ו10% HEPES מ"מ pH 10 דקות ב 37 ° C (הדמיה בינוני), לתייג GPCRs מתויג דגל על ​​פני התא. דלג על השלבים הבאים אם חלבוני ניאון מקודדים גנטיים, כגון GFP, משמשים כתגים (ראה דיון לפרטים נוספים).
  3. העבר את coverslip לחדר הדמיה לחיות תאים. לחלופין, עבור מנות עם רצפת זכוכית, תקשורת נוגדן תיוג לשאוב ולהוסיף 700 μl של מדיום הדמיה מחומם מראש.
    1. השתמש בזוג מלקחיים ולכופף את קצה מחט 25 מד לתוך וו.
    2. להחזיק זוג מלקחיים ביד הדומיננטית. החזק את המחט הכפופה בothאה. הפעל את המחט עד לעקומות הוו מטה לכיוון הזכוכית. בעדינות לגרור את המחט, צד וו למטה, על פני החלק התחתון של צלחת 6 היטב עד שווים על coverslip. יש להיזהר שלא לשרוט את פני השטח של coverslip, כפי שהוא יהיה לנתק את התאים. רם בעדינות את coverslip מתחתית הבאר. לאזן את coverslip נגד קיר של גם לתמיכה.
    3. השתמש במלקחיים כדי לתפוס ליד הקצה של coverslip ולעבור בצד תא coverslip עד לחדר ההדמיה, ולהרכיב את החדר. הוסף 700 μl (או כמות מתאימה) של מדיום הדמיה מחומם מראש. ידית coverslips בזהירות בלי לחץ כדי למנוע פיצוח או שבירה.
  4. העבר את התא על מיקרוסקופ ולשמור על הטמפרטורה של התאים על 37 מעלות צלזיוס באמצעות תנור במה או חממה סגורה.
  5. להביא תאים אל מוקד באמצעות מטרת 100X או 60X TIRF נפט טבילה (1.45 NA ומעלה). תמונת התאים בepifluorescence או נגד קונבנציונלייםמצבי מוקד של תאורה (כלומר, לא TIRFM) כדי לזהות תאים המבטאים את המבנים המתאימים. Out-of-להתמקד תאים הם כמעט בלתי נראים בעומק הדק של תאורת TIRF ולכן קשה למצוא את המטוס ותאי מוקד.
    הערה: חלק מהמערכות להשתמש באותו הלייזרים לTIRFM לתמונה בepifluorescence הקונבנציונלי, על ידי הזזת זוית פגיעה של הלייזר מעל הזווית הקריטית. כאמצעי בטיחות חשוב, תמיד להיות מודע לזווית של קרן הלייזר, ותמיד לכוון אותו הרחק מצופה.
  6. פוקוס עד למשטח התחתון של תא להביע עד קווי המתאר של קרום פלזמה סביב התא נעלמים ומרכז התא מופיע. זה בולט במיוחד עם חלבון מטען מקומי קרום פלזמה כגון קולט μ-אופיואידים (ראה איור 2 א).
  7. לעבור להדמית TIRF.
    1. אם משתמש באותו לייזרים להדמיה בepifluorescence הקונבנציונלי, להגדיל את הזווית של שכיחות שללייזר עד הקרינה מחוץ לפוקוס בחלק הפנימי של התא נעלם, ולא קווי המתאר של קרום פלזמה סביב התא נראה. (השווה איור 2 ג ל2A דמויות ו2B)
      הערה: בTIRFM, נעה מטוס המוקד גורמת תמונה ללכת לגמרי מחוץ לפוקוס ו / או עמום, ורמות הקרינה הכוללות יורדת עקב העומק הקטן יותר של תאורה. לכן, שיטה חלופית כדי לעבור לתאורת TIRFM הוא המוקד הראשון במרכז התא בepifluorescence confocal / קונבנציונלי, ולאחר מכן להגדיל את זוית פגיעה עד שאתה מאבד את רוב הקרינה, ולאחר מכן להתמקד במורד לקרום הפלזמה.
    2. ברגע שבTIRFM, להבטיח לייזר העירור משקף בחזרה דרך האובייקטיבי ואינו נראה מעל המטרה. לאשר זאת על ידי בדיקה אם כתם הלייזר הוא גלוי.
      הערה: במצבי epifluorescence או confocal קונבנציונליים, תאורת הלייזר היא נראית מעל המטרה,כמו על התקרה.
    3. לחדד את הפוקוס כדי לקבל תמונה חדה. המרכיבים העיקריים של מכונות endocytic, כגון clathrin, יהיו גלויים בpuncta. התאם את המיקוד על קנס, כך puncta הם עגול כאפשרי.
      הערה: לקבלת מטען מקומי קרום, להתאים להתמקד בסדר עד filopodia מופיע מובחן.
    4. השתמש בתכנית רכישה כדי להציל את כל הפרמטרים ההדמיה כגון מראות וזווית TIRF. האם זה עבור כל אורכי הגל הנדרשים.
  8. סריקה סביב coverslip למצוא תאים המבטאים את כל סמני endocytic הרצויים: קולט μ-אופיואידים והמתאם β-arrestin בדוגמא המוצגת באיור 3 א. בחר תאים שמביעים אך לא מעל להביע. ראה דיון לפרטים.
  9. ברגע שתאים מזוהים, לרכוש תמונות בכל 3 שניות ל10 דקות. זה מספיק כדי ללכוד את כל החיים של המק"ס, מאז החיים של המק"ס הממוצע בHEK293 תאים צילמו בתנאים אלה הוא around 40 שניות 10-11. זה מאפשר על 12-14 מסגרות להתבונן המק"ס. לדוגמא לראות סרט 1. חזרה על כל השלבים לתאים נוספים תמונה.

.3 ניתוח endocytic Dynamics על ידי אימות ידנית

למרות שאימות ידנית של החיים המק"ס מוגבל מאוד על ידי מספר CCPs שניתן לאתרם, זה עדיין נשאר אמצעי מדויק של זיהוי לא נרתע משינויים הגלובליים בחפצי תמונה וזיהוי. ראה דיון לפרטים.

  1. פתח את הקובץ בImageJ. תמונות מאוחסנות כערימה אחת של קבצי TIFF עם ערוצים רציפים. המרת תמונות לhyperstacks. עבור לתמונה> Hyperstacks> מחסנית לhyperstack. הזן את מספר הערוצים שנרכשו (כלומר, אם ההדמיה β-arrestin וקולט μ-אופיואידים, הזן 2), הזן 1 לערימת Z (TIRFM הוא מטוס יחיד), ומספר הפריימים של הסרט (כלומר 10 דקות סרט ליום 1 במסגרת כל i 3 שניותשל 200) בחלון הקופץ.
  2. פורמט hyperstack מניב חלון עם שני פסי גלילה. השתמש בסרגל העליון כדי לעבור בין הערוצים והתחתון כדי לעבור זמן. גלול לערוץ של החלבון שמשך חייהם יהיה assayed.
  3. לעבור למסגרת 10 או 15 של הסרט כדי להקטין את הכללת CCPs קיים מראש המשכים שכל אינם גלויים. לצייר תיבת ROI סביב נקודה שנבחרה באקראי.
  4. לספור את מספר מסגרות מקום גלוי.
    הערה: ראה איור 3 ב ו3C לדוגמאות משלוש קטגוריות מורפולוגיות של אירועי endocytic 10,11,16-19.

.4 ניתוח endocytic Dynamics על ידי הכרה אובייקטיבית

הכרה אובייקטיבית מאפשרת זיהוי של כמעט כל CCPs צילם בתא, אבל יכולה להיות מועדים לטעויות עקב זיהוי מזויף של מבנים שגויים. ראה דיון לפרטים במשקל היתרונות וחסרונות של דוארשיטת ACH. מספר תוכניות, כוללים אלגוריתמים שנבנו מותאמים אישית, עשויות לשמש כדי לזהות באופן אובייקטיבי CCPs. פרוטוקול זה מתאר הכרה אובייקטיבית של CCPs באמצעות Imaris, תוכנת דימוי ניתוח (ראה חומרים).

  1. כדי להתחיל, לפתוח את קובץ תמונת הגלם בתוכנת דימוי ניתוח. כברירת מחדל, תמונת צבע ממוזגת תופיע. השתמש בחלון "התאמת תצוגה" כדי להתאים את הבהירות של ערוץ. לחץ על השם של ערוץ כדי לשנות את הצבע מוצג. הסר את הסימון מהתיבה שליד הערוץ כדי למנוע התצוגה שלה (ראה איור 4 א).
  2. צור "כתמים" על ידי לחיצה על הסמל עם כתמים כתומים. ראה איור 4. בחר אזור של העניין (ROI) סביב התא. ראה איור 4C. השתמש בהחזר על השקעה לאי הכללה של אזורים שבצורה לא נכון יהיה לזהות קצוות מובילים בהירים ושלטים. לנתח תאים מרובים עם רמות ביטוי שונות בנפרד.
  3. מדוד את הקוטר של ספוט לproviהערכות ראשוניות דה לאלגוריתם. עבור למצב "Slice", ולחצו על קצוות קוטביים של מקום כדי למדוד את קוטרו. ראה איור 4E. האם זה עבור 4 או 5 נקודות עגולות שנראות מעידים על המק"ס בשיא יציבותה, לאחר היווצרות ולפני scission. השתמש במדידות אלה כדי לחשב קוטר ממוצע עד לעשירית הקרוב ביותר של מיקרון.
  4. זיהוי כתמים. לחזור למצב "לעלות". בחר את הערוץ המתאים לגילוי. הזן את הקוטר הנמדד הממוצע, בדרך כלל 0.3 או 0.4 מיקרומטר. לחץ על החץ קדימה הכחול לכמת את כתמים. ראה איור 4E. אם הקוטר של כתמים הוא להמעיט, נקודות מזויפות של הקרינה תהיה מזוהות ככתמים. אם הקוטר גדול מדי, כתמים אמיתיים יהיו להתעלם ממנו. כאשר לא בטוח, מעריך נמוך מעט, ולסנן את התגליות שגויות מאוחר יותר.
  5. סנן כתמים על ידי איכות. התאם את המסנן כדי ללכוד כתמים רבים ככל האפשר בלי גבקרקע. מסנן האיכות נבחר כברירת מחדל 20. ראה איור 4F.
    1. השתמש בעקומת "האיכות" כמדריך להגדרת סף מתאים. הזז את הסף התחתון של המסנן עם לחצן העכבר השמאלי כדי לטבול ראשון בעקומה. זוהי נקודת התחלה טובה עבור המסנן, כעמדה זו בדרך כלל מזקקת איתור לכתמים רק נראים לעין. ראה איור 4F.
    2. כתמים שאותרו מופיעים בסרט כתחומים או פיקסלים מרכז. שימוש בכרטיסייה "הצבעים", להתאים את הצבע של כתמים לצבע מנוגד כדי להפוך אותו קל יותר לראות אותם. גלול בסרט כדי לבחון את כתמים בכל מסגרת. המטרה היא לזהות כתמים רבים ככל האפשר למכלול חייהם.
    3. לחסל את כתמים עמומים או ידני לחבר אותם למסלולים רציפים בשלב מאוחר יותר, כפי שהם אינם מזוהים היטב באמצעות מהלך חייהם.
    4. הסר שלטים מוארים עם fil "עוצמה"ter, במידת צורך. לחץ על הסימן הפלוס הירוק להוסיף מסנן חדש. ראה איור 4F. יצירת מסנן עוצמה כדי לסנן באו כתמים של אותות הקרינה שניתנו החוצה. השתמש בעקומה שנוצרה העוצמה, (המקבילה לאיכות Curve דנה ב4.5) כדי לקבוע את הסף. השתמש בלחצן העכבר השמאלי כדי להסיר את הקצה השמאלי הקיצוני של העקומה המייצגת את כתמים הבהירים.
      הערה: מבני שלט גדולים הם בדרך כלל בין האלמנטים הבהירים ביותר בתא, והם אינם נכללים בקלות עם מסנן זה.
    5. גלול בסרט על מנת להבטיח שCCPs מזוהים ככתמים והלוחות הבהירים כבר לא זוהו. איור 3D מראה תא שבו זיהוי של CCPs (כונה על ידי כדורים לבנים) היה מותאם עם מסנן האיכות ושלטים הוצאו עם האיכות מסנן.
    6. להפחית קצות תא בהירים עם מסנן האיכות. אובייקטים מואר עדיין ייתכן שיהיו הצורך להסיר באופן ידני, בשלב הבא. המשך עם הכחולחץ.
    7. הסר כתמים חריגים במסך כתמי עריכה. Switch to "בחר באפשרות" מצב. לחץ על המקום. זה יהפוך צהוב. לחץ על "מחק". לחץ על החץ הכחול כדי להמשיך לבנות את האלגוריתם. ראה איור 4G.
  6. מסלולי מידה. להגדיר מסלולים ל" תנועה בראונית. "המפלגה הקומוניסטית הסינית לא צריכה להציג כל תנועה מכוונת, נסחף מינימאלי בלבד על פני קרום הפלזמה. אלגוריתם זה הוא מתאים ביותר לתנועה ש. ראה איור 4H.
    1. הגדר את המרחק מקסימאלי לערך קטן כגון 0.7 מיקרומטר. ראה איור 4H.
      הערה: הגדרת מרחק קטן ממזערת חיבור של כתמים סמוכים ועדיין מאפשרת למעקב מתמשך של נקודת תא דרך המק"ס או תנועת תא.
    2. להגדיר גודל מקסימאלי גאפ ל -1 זה מאפשר מסלול כדי להמשיך אם יש רק אחד מסגרת החסרה ברציפות. לחץ על החץ הכחול לחישוב מסלולים. ראה איור 4H.
      הערה: Gגדלי ap של מסלולים שונים יותר מ 3 סיבות להיות מקושרים יחד בצורה לא נכונה.
    3. מסלול מתג צפייה ל" זנב הדרקון. "גלול בסרט התבוננות איכות זיהוי. אם כתמים סמוכים להיות מחוברים, להקטין את המרחק מקסימאלי מתחת 0.7 מיקרומטר. אם כתמים נשברים מדי בקלות, להגדיל את גודל מקס גאפ. לחץ על החץ הכחול כדי ליצור מסלולים. זה מוביל למסך מסלולי מסנן. ראה איור 4H.
  7. מסלולי סינון ויצוא נתונים. השתמש במסנן "עוצמה" כדי להסיר פלאק הבהיר נוסף. השתמש במסנן "עקירה" כדי להסיר endosomes שלהיכנס לתחום TIRF. השתמש בזהירות, ככתמים כבר יהיו לי התקות ארוכות יותר גם כן. לחץ על החץ הכפול הירוק כדי להשלים את הפרוטוקול. ראה איור 4I.
    1. השתמש בכרטיסיית המסלולים ערוך, עם סמל העיפרון, כדי להסיר לתגליות חיוביות כוזבות של מסלולים שלא ניתן להסירו באמצעות מסננים. הגעה לdiscontinuities או קשרי שווא. כדי לחבר בין שני מסלולים, בחר אותם באמצעות Ctrl-שמאל לחץ, ואז ללחוץ על "התחבר" בתיבת מסלולי עריכה. כדי לנתק מסלולים לכתמים נפרדים, לבחור מסלול ופגע "נתק". בחר כתמים מרובים עם Ctrl + שמאל לחץ ולחץ על "התחבר" כדי ליצור מסלול חדש. השיטה היא זהה עבור עריכת כתמים, שתוארו ב4.5.7. ראה איור 4J.
    2. כדי לייצא נתונים, פתח את כרטיסיית הסטטיסטיקה. לחץ על סמל התקליטון היחיד לייצא נתון שנבחר. לחץ על הסמל שנראה כמו סדרה של תקליטונים כדי לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים. נתון "משך מסלול" מכיל את אורך מסלולי endocytic. ראה איור 4K.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שימוש בתאי החיים TIRF מיקרוסקופית יש לנו נרשם דינמיקת endocytic של μ-אופיואידים קולטן (מור), קולטן G-חלבון בשילוב (GPCR) וβ-arrestin חלבון מתאם endocytic. מבנה β-arrestin היה transfected זמני לקו תא מור ביציבות להביע באמצעות הפרוטוקול המתואר באיור 1, וצלם 96 שעה מאוחר יותר. מור בשורת התאים היציב הוא N-סופני מתויג עם GFP pH רגיש. חלבון פלואורסצנטי זה מאיר רק בנוזל החוץ תאי הניטרלי. כמו כן, מור endocytoses רק הופעל בעבר על ידי אגוניסט, ונשאר אחר מתחלק באופן שווה על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מתארים את השימוש בTIRFM לדמיין אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) ברמה של CCPs הבודד בתאים חיים בזמן אמת. CME הוא אירוע מהיר ודינמי מאוד מתווך על ידי ההשפעה המצטברת של אירועים בודדים רב מרחב ובזמן נפרד. רוב מבחני המשמשים כיום, כגון מדידות ביוכימיים של הפנמה באמצעות biotinylation משטח או ליגנד המחייב, זרימת cytometry או מבחני תאים קבועים למדידת כמות חלבונים הפנימו, או הלוקליזציה מיקרוסקופית אלקטרונים של חלבונים, לעקוב אחר שינויי הרכב בלוקליזציה חלבון בנקודות זמן קבועות . שיטו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות לד"ר C. Szalinski, H. Teng ו-M. Bruchez על העזרה עם Imaris, R. Vistein ו-D. Shiwarski על העזרה הטכנית והייעוץ, ולד"ר M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin ו-Dr. W Almers על ריאגנטים ודיון מועיל. המימון הניתן על ידי מענק T32 NS007433 ל-SLB ו-NIH DA024698 ו-DA036086 ל-MAP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM/גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין ונתרן פירובטפישר סיינטיפיק 
תמיסת מלח פוספט בופר (DPBS) של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיוםGibco, מאת Life Technologies21600-010
חומצה חופשיתEDTA Amresco0322-500G
סרום בקר עובריGibco, מאת Life Technologies10437-028
L-15 Medium של לייבוביץ, ללא פנול אדוםGibco, מאת Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, מאת Life Technologies
HEPESCellPURE מאת Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425מגיב טרנספקציה
25 מ"מ כיסוי זכוכית FisherScientific12-545-86
צלוחיות מטופלות בתרבית תאי קורנינג, 25 ס"מ2Fisher Scientific10-126-28
תרבית תאים 6 בארות צלחתGreiner Bio-One, מאת VWR82050-896
מונוקלונלי ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-מלח אנקפלין אצטט (DAMGO)Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 ערכתתיוג חלבוןLife TechnologiesA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris תוכנת ניתוח תמונותBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris, לניתוח אוטומטי
מיקרוסקופ הפוך Nikon Eclipse Ti ואביזרים נדרשים כולל קוביות פילטר ומסנניםזרוע Nikon
TIRF עם מתאמים נדרשים עבור Nikon Eclipse TiNikonלהתאמת זווית התרחשות
מצלמת iXon+ EMCCD ומתאמיםAndor
SH3024301

מקורות

  1. McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
  3. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
  4. Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
  5. Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
  6. Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
  7. Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
  8. Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
  9. Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
  10. Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
  11. Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
  12. Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
  13. Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
  14. Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
  15. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
  16. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
  17. Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
  18. Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
  19. Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
  20. Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  21. Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
  24. Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
  25. Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
  26. Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
  27. Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
  28. Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
  29. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
  30. Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גומחות מצופות קלתריןמיקרוסקופיית פלואורסצנציהניתוח תמונותדימות תאים חייםדינמיקה אנדוציטוטיתהרכב המטען
חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.