ניתוח של Tubular ממברנה רשתות בלב myocytes מאטרייה וחדרי לב

סיכום

בmyocytes לב, מבני קרום צינורי ליצור רשתות תאיות. אנו מתארים מותאמים פרוטוקולים לבידוד i) של myocytes מלב העכבר כוללים בקרת איכות, ii) מכתים תא חי למיקרוסקופ פלואורסצנטי המדינה של-the-art, וiii) ניתוח תמונה ישירה לכמת את מורכבות רכיב והפלסטיות של קרום תאיים רשתות.

תקציר

במיוציטים לבביים רשת מורכבת של צינוריות ממברנה - מערכת הצינוריות הרוחביות-ציריות (TATS) - שולטת בפונקציות איתות תוך-תאיות עמוקות. בעוד שממברנת פני השטח החיצונית ורכיבי ממברנת TATS הקשורים נראים רציפים, ישנם הבדלים מהותיים בתכולת השומנים והחלבונים. במיוציטים חדריים (VMs), רכיבי TATS מסוימים נמצאים בשפע ותורמים לרשתות צינוריות ישרות ולארכיטקטורות תלת מימד מסועפות רגילות. נהוג לחשוב כי רכיבי TATS היקפיים מפיצים פוטנציאל פעולה מפני השטח של התא לאלפי תחומי מגע של ממברנת רשתית סרקואנדופלזמית (SER) תוך תאית מרוחקת, ובכך מפעילים יחידות שחרור Ca²⁺ תוך תאיות (CRUs). בניגוד ל-VMs, הארגון והתפקיד התפקודי של ממברנות TATS במיוציטים פרוזדוריים (AMs) שונה באופן משמעותי והרבה פחות מובן. יחד, אפיון מבני כמותי של רשתות ממברנות TATS במיוציטים בריאים וחולים הוא תנאי הכרחי להבנה טובה יותר של פלסטיות תפקודית וארגון מחדש פתופיזיולוגי. כאן, אנו מציגים שילוב אסטרטגי של פרוטוקולים לניתוח כמותי ישיר של רשתות ממברנות TATS ב-VMs ו-AMs חיים. לשם כך, אנו מלווים בידודי תאים ראשוניים של VMs ו/או AMs של עכברים עם שלבי בקרת איכות קריטיים ופרוטוקולי צביעת ממברנה ישירה להדמיה פלואורסצנטית של ממברנות TATS. באמצעות זרימת עבודה אופטימלית לעיבוד תמונה TATS קונפוקלי או סופר-רזולוציה, נוצרים נתונים בינאריים ושלד לניתוח כמותי של רשת TATS ומרכיביה. בניגוד לאסטרטגיות ניתוח תמונות מצטברות אזוריות עקיפות שפורסמו בעבר, הפרוטוקולים שלנו מאפשרים אפיון ישיר של רכיבים ספציפיים וגוזרים תכונות פיזיולוגיות מורכבות של רשתות ממברנות TATS במיוציטים חיים עם תפוקה גבוהה וכלי תוכנה בגישה פתוחה. לסיכום, ניתן ליישם בקלות את אסטרטגיית הפרוטוקול המשולבת עבור מחקרי רשת TATS כמותיים במהלך הסתגלות מיוציטים פיזיולוגיים או שינויים במחלה, השוואה בין סוגי תאי שריר לב או שלד, פנוטיפ של מודלים טרנסגניים והתערבויות פרמקולוגיות או טיפוליות.

מבוא

בתאי שריר משורטטים בריאים, מבני קרום צינורי עם אוריינטציות "רוחביים" (T-tubules) בניצב לציר התא העיקרי הם בשפע. כתוצאה מכך, T-tubules מתאפיינים כהרחבות מתמשכת של תאי השריר "לרוחב" עיקרי קרום פני השטח (sarcolemma), אשר עמוק לחדור cytosol לכיוון מרכז התא. התפקיד הפיזיולוגי של T-tubules רציף עם קרום פני השטח החיצוני הוא הצימוד החשמלי המהיר של תאים תאיים מרוחקים שהוקמו על ידי תחומים מגע אברון SER לאורך גדול יחסית לב תא שריר על ידי צימוד קרבה ננומטריים של L-סוג מופעל מתח Ca נפח ^{2 +} ערוצים (Cav1.2) פנימה הנוכחי (אני _Ca) הפעלת קולטן ryanodine הסמוך משחרר (RyR2) SER Ca ^{2 +.} בmyocytes חדרית (VM), אנשי הקשר לא רציף קרום ("צמתים") בין תחומים SER junctional וT-tubules הם חשבו לשלוט אלפי nanodomains Ca ^{2 +} שחרור תאיים הבודד בכל תא ^1.

לכל תחום קשר נתון, חלקי קרום זה לצד זה כל אחד מT-אבובית וSER ההיקפי (junctional) הם כ 15 ננומטר קרוב זה לזה, ומכאן שהוגדר כnanodomain. וכך, subspaces cytoplasmic פרט הקטן ביותר הפרדה המאפשרת התנהגויות תא תאים אוטונומיים למחצה. כאשר פוטנציאל פעולה נכנסת מפעיל ערוצי Cav1.2 בT-tubules של מכונות וירטואליות, Ca קטן יחסית ^{2 +} פנימה נוכחי יהיה במהירות להגדיל את ריכוז subspace Ca ^{2 +} _S [Ca ^{2 +]} בnanodomain בגודל attoliter ^1. בשלב בא, העלייה [Ca ^{2 +]} _S מפעילה Ca ^{2 +} קולטנים ryanodine -gated (RyR2) בתוך קרבת ננומטר בצומת קרום SER זה לצד זה, ותהליך צימוד זה מתרחש לאורך כל הזוג חשמליnanodomains myocyte ד. RyR2s להתרחש אשכולות מרובים ערוצים צפופים כמו עם stoichiometry משוער של ערוץ Cav1.2 1 ל5-10 ערוצי RyR2 ^2. מאז SER-to-cytosol [Ca ^{2 +]} שיפוע תלול מאוד (יחס 10 ^4: 1) וRyR2s לתפקד כגבוהות מוליכות Ca ^{2 +} ערוצי שחרור באשכולות בשילוב פונקציונלי, תוצאות הפעלת RyR2 בCa גדול כמותית ^{2 +} לשחרר נוכחי מתחומים T-אבובית יחד junctional SER הגדלת subspace המקומי _S [Ca ^{2 +]} ל100 מיקרומטר או גבוהים יותר בטווח של 1-2 ^3,4 האלפיות השני. זה התנהגות הגברה אות לב גם נקראת Ca ^{2 +} מושרה שחרור Ca ^{2 +} (CICR). יחדיו, T-tubules הם מבני קרום חיוניים שבמהירות להפעיל אותות שחרור Ca ^{2 +} באמצעות אנשי קשר SER nanodomain junctional וCICR תא רחב במהלך עירור והתכווצות צימוד (EC).

בנוסף לT-tubules, אבובית הציריתשל (A-tubules) עם מקביל אורינטציה שונה באופן משמעותי לציר התא הראשי (אורך) תועד על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים (EM), confocal ומחקרי מיקרוסקופיה 2 פוטונים. למשל, סריג רציף תא רחב של-tubules בין myofibrils מחובר עם T-tubules ליד Z-קווי sarcomere הוצג על ידי קליעים נותבים תאיים וההדמיה EM פן ניסיונות קבועים מכונות וירטואליות ⁵ של. באמצעות מכתים והעמסת צמוד dextran תאי ולחיות הדמיה 2 פוטונים של עכברוש מכונות וירטואליות, רשת אבובית 3D רשתי מורכבת הייתה דמיינה בהיקף של ~ 60% T-tubules ו~-tubules 40% ^6. מחקר זה לא רק הוביל להדמיית 3D של-tubules בשפע, אלא גם להבנה שחתכה להדמיה EM מוגבל מטבעו לניתוח של רשתות קרום מורכבות ודינמיות כמו המערכת רוחבית צירית אבובית (מידות). כתוצאה מכך, הדמיה תא חי confocal של קרומי מידות מוכתמות ישירות עם di-8-ANNEPS פותח. אם תא חירשתות מידות מנותחות שינוי פורייה, את המראה הרגיל של רכיבי T-אבובית בחלל קרוב Z-קווי sarcomere בא לידי הביטוי על ידי כוח ספקטרום ההרכב מאזור של אותות משורטטים ^7. אסטרטגית ניתוח עקיפה זה נעשתה שימוש כדי לזהות שינויים אזוריים תא רחב בסדירות מרכיב מידות במודלים של מחלות ^7. לדוגמא, בתיווך shRNA junctophilin-2 עקומות למטה נגרמו אי ספיקת לב והמחסור בחלבון המסוים איזופורם הביאו ארגון מחדש T-אבובית עם nanodomain Ca תפקוד לקוי של שחרור ^{2 + 8.} לאחרונה הרחיבו את הניתוח של רשתות קרום מידות באמצעות גישות כמותיות ישירות ועוד יותר על ידי מיקרוסקופ superresolution התא החי של רכיבי מידות בודדים בעכבר המכונות הווירטואליות באמצעות דלדול פליטה מאולץ (STED) nanoscopy ^9. רזולוציית תמונה ננומטריים אפשרה לניתוח ישיר של רכיבי מידות פרט קטנים יותר, אשר משוער הפצת 50:50 של רוחבילעומת אוריינטציות אבובית ציריות, כמותית המאשר שני מרכיבים בשפע עדיין בכיוון באופן דיפרנציאלי בודדים מידות בלבבות עכבר בריאים ^9. אסטרטגיות אלה יהיו מתוארים נוספים בסעיף הפרוטוקול להלן.

בעוד התפקיד הפיזיולוגי של הרכיבים-אבובית השופעים בלב המבוגר נשאר מסתורי, מחקרי EM תעדו מבני קרום SER הקשורים-tubules מציע Ca אנדוגני ^{2 +} nanodomains שחרור בפן ניסיונות ועכברוש מכונות וירטואליות ^5,10. ניתוח Confocal של Cav1.2 וRyR2 מצא רמה גבוהה של colocalization בצמתים-אבובית ^10. מאז ~ 20% ^{מ2 +} ניצוצות Ca ספונטניים בחולדת מכונות וירטואליות מקורו יחסית רחוקות מפסי Z-קו שבו T-tubules מתרחש בדרך כלל, טיעון אחד היה שnanodomains-אבובית קשורה אכן קיימת ומתפקד ^{כ2 +} אתרי שחרור Ca ^11,12. מעניין, היווצרות T-אבובית וoc ההתבגרותבני כלאיים רק לאחר לידה, ומקביל לצמיחה של תאי לב, למשל, דרך נביטת invaginations sarcolemmal המבשר בP5 ולא בשלה מסועפים מכלולי רשת המידות בP10 בעכברים ^13. נראה כי Junctophilin-2 הוא חשוב במיוחד עבור התבגרות רשת מידות לאחר לידה מאז shRNA לדפוק למטה מנע העיגון של קרומי T-אבובית לצומת SER מוביל לשחרור מושהה Ca ^{2 +} וארגון מידות פתולוגיים בקנה אחד עם ארכיטקטורות-אבובית לא בשלה שלטו ב ¹³ מכונות וירטואליות. תצפיות אלה עשויות סופו של דבר להוביל להוכחה של הקונספט שT-tubules ליצור באמצעות תהליכי invagination הקרום ואילו-tubules עשוי מורף באמצעות מנגנונים תאיים נוספים או אפילו חלופיים ^14.

אפיון של מידות שינויי קרום במחלות לב הפך אזור מחקר חשוב לשאלות pathophysiological. דיווחים ראשוניים במודל כלב של failu לב הנגרם על ידי קצבמחדש הראה הפסד של T-tubules ונוכחי Cav1.2 (אני _Ca) ^15. מודל חזיר של קרדיומיופתיה איסכמית הראה מופחת צפיפות T-אבובית ותיאום מופחת של Ca ^{2 +} תאיים לשחרר ^16. תוך שימוש במודל החולדה באופן ספונטני עם יתר לחץ דם (SHR) של אי ספיקת לב, אובדן של T-tubules היה קשור בצימוד nanodomain מופחת של Cav1.2 וRyR2 על ידי המנגנון המוצע של "RyR2 orphaning" ^7. הפסד של T-tubules גם הוכח במכונות וירטואליות אנושיות מדגימות קרדיומיופתיה איסכמית, מורחבות, וhypertrophic ^17. יתר על כן, עלייה ב- tubules דווחה בסעיפי רקמות של קרדיומיופתיה מורחבת האנושית ^18. בעקבות אוטם שריר לב, שהראינו מנגנון ההפרש של ארגון מחדש מידות בעכבר מכונות וירטואליות עם ירידה משמעותית של T-tubules בניגוד לעליות של רכיבים-אבובית ^9. חשוב לציין, לעומת זאת קרום מקומי השתפרו מושגים באמצעות superre תא החימיקרוסקופיה STED פתרון אפשרה ניתוח מרכיבים כמותיים מפורט מדידות ישירות, אשר הראו ריבוי משמעותי של-tubules עם עליות הכוללות של אורך רשת מידות ומסתעפים מורכבות ^9. יתר על כן, הם הראו שאימון גופני יכול להפוך שיפוץ T-אבובית בחולדות לאחר אוטם שריר לב ¹⁹ וכי טיפול resynchronization לב עלול להוביל להיפוך שיפוץ של T-tubules בכלבים עם tachypacing המושרה אי ספיקת לב פרוזדורים ^20. יחדיו, מחקרים הן באדם חולה וחית מכונות וירטואליות כמו גם התערבויות טיפוליות פוטנציאליות לטעון נהנים מהנהלים בידוד תא באיכות גבוהה ובאסטרטגיות ניתוח כמותי מפורטות כפי שתוארו בפרוטוקול ותוצאות סעיפים שלהלן.

יתר על כן, כפי שהודגם לאחרונה על ידי משטח לרוחב לעומת סחר בקרום מידות של ערוץ KATP isoforms ^21, חשוב לשקול מ פרוזדוריםyocytes (AMS) כביולוגי מובחן, כמו גם מודל תא לב השוואתי לעומת מכונות וירטואליות. T-tubules תועדו לאחרונה בכבשים ואנושי ²² AMS. ראיות הנוכחיות מצביעות על כך שכמה T-tubules קיימים בתאים בבוקר ובדרך כלל ביונקים גדולים יותר כמו כבשים ובני אדם, אך לא במכרסמים קטנים ^23. בניגוד למכונות וירטואליות, באדמיניסטרטיבים שחרור תאיים Ca ^{2 +} מופיע להתרחש מpropagating פני תא על ידי דיפוזיה לכיוון מרכז התא וכתוצאה מכך Ca מרחב ובזמן מסומן ^{2 +} הדרגתיים ^23. במסגרת זו נראה חשוב להבהיר מנגנונים של Ca ^{2 +} איתות תאית חוסר יציבות לצורות מחלה נפוצות כגון פרפור פרוזדורי ^24. לסיכום, שני בידוד AM וVM התא וכל ללב בריא וחולה בדרך מועסק פרוטוקולים. רק אם בידוד תא נעשה כראוי כמו להישפט על ידי תיעוד מיקרוסקופי של איכות תא מספיק, דגימות בבוקר וVM צריכה להיות carried קדימה לניתוח מידות כמותי. בהתאם לכך, בסעיפי הפרוטוקול הבאים תלויים באופן קריטי בתא באיכות גבוהה מבודד מעכבר או מינים אחרים ואחריו מיקרוסקופיה תא החי לנתח קרומי מידות ללא פגע. כפי שציין בעבר, אפיון של ממברנות מידות הוא תחום מחקר מאתגר עם נטייה לחפצי קיבעון והכנת ^6, שינויי קרום בשל שינויים האוסמוטי, ומגבלות רזולוציה של מיקרוסקופ אור הקונבנציונלית ^9. נציין, כי פרוטוקולי המדינה של-the-art האחרונים לבידודה של אדמיניסטרטיבים אנושיים הדמיה Ca ^{2 +} ותיקון מהדק ושל עכברוש מכונות וירטואליות לתרבית תאים כבר פורסמו בעבר בכתב עת זה ^25,26.

פרוטוקול

הערה: נהלי כל החיה היו נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת המרכז הרפואי גטינגן בעמידה בטיפול ושימוש האנושיים של חיות מעבדה.

1 בידוד של myocytes הפרוזדורים וחדרית מלב העכבר

1. ידית חיות בעדינות ככל האפשר ובהתאם לפרוטוקולים שאושרו כדי למזער את הלחץ באופן כללי ובאופן ספציפי כדי למנוע תופעות שלא במתכוון חזקות פוטנציאליות מהפרזות neurohormonal בתאי לב בודדים. בנוסף, להזריק כל עכבר עם הפרין (500 IU / sc קילוגרם משקל גוף) לפחות 20 דקות לפני מיצוי לב כדי למנוע קרישת דם ותסחיפי מיקרו אשר באופן משמעותי יכולה להתפשר התשואה ויושרה של תאי לב במהלך בידוד.
2. הרדימי עכברים בגילים 12 שבועות או יותר על ידי שאיפת isoflurane, לאשר היעדר רפלקסים נסיגת כאב, ולהרדים בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם.
   1. חלץ את הלב במהירות הבא פרוטוקולי מומחה הוקמו בעבר (ראה, למשל, Kaestner et al. ²⁶ וLouch et al. ^27). הימנע מכל נזק שלא במתכוון לאטרייה על ידי סחיטה מיותרת או מתיחה.
   2. לשמר בזהירות את הרקמה של אב העורקים עולים הפרוקסימלי באמצעות זוג מלקחיים גדם ומספריים ישר להקמת חזית הרוחבית רציפה דרך קיר כלי אב העורקים, וזה חשוב עבור cannulation וטפטוף של הלב מוצלח.
3. העבר את הלב נכרת מייד לקר כקרח ^{2 +} חיץ זלוף חופשי להלכה Ca (לפתרונות ראו טבלה 1). שמור את כלי הגדול הידק במהלך ההעברה דרך אוויר לחיץ כדי למנוע תסחיף אוויר בשוגג עד הלב הוא שקוע באופן מלא. השתמש BDM בפתרונות החיץ ומקורר בקרח כדי לעכב התכווצות לב.
4. השתמש במיקרוסקופ זום משקפת עם תאורה 3D מספיקination.
   1. Cannulate אב העורקים מתחת stereovision פנורמי של הלב עם חלק, משטח מלוטש 21 צינורית G (מ"מ קוטר 0.81 חיצוני; למשקל לב עכבר רגיל) אשר חייב להיות מלא לחלוטין עם חיץ. ודא שאין בועות אוויר בצינורית על ידי חיבור מאגר פתרון הפרוקסימלי (למשל, מזרק) דרך שסתום Luer 2-way המאפשר זרימת פתרון שליטה מהירה.
   2. אשר תחת הגדלה משקפת שהצינורית ממוקמת כראוי בתוך אב העורקים, שהם כ 1 מ"מ מעל סתם אב העורקים וענפים של עורקים הכליליים. בשום פנים ולהימנע מכל מעבר באו ניקוב מכוון של סתם אב העורקים עם הצינורית (זה באופן קבוע ישבש סגירת שסתום אב העורקים וכתוצאה מכך לשבש זלוף לב).
5. לקשור את אב העורקים בעדינות לחריצים נגד חלקה מחוייט, האוריינטציה circumferentially קרובה לסוף של הצינורית באמצעות שני תפרי משי. אל לשטוף arteri כליליתes בכוח בכל נקודה. חבר את צינורית הפתרון מלא קשורה לאב העורקים והלב למחבר יצוא בחוזקה הולם של מערכת זלוף מותאם אישית ומראש מכויל, aka התקנת Langendorff שונה (בין אם באמצעות לחץ קבוע או זרם בלתי פוסק, וראה גם סעיף דיון בהמשך).
6. Perfuse הלב בהקדם האפשרי למשך 4 דקות באמצעות חיץ זלוף מחומצן על 37 מעלות צלזיוס (שיעור זלוף יעד: 4 מ"ל / דקה). התחל העיכול על ידי מעבר לזלוף collagenase מכיל מאגר עיכול (600 U / סוג collagenase מ"ל II) ל8-10 דקות ב37 מעלות צלזיוס. מעקב אחר ההתקדמות של עיכול רקמה על ידי המאשר שינויי רקמה דומים כוללים עמימות גוברת, רכות, ורפיסות בכל משטח לב לעין.
7. לנתח את תאי לב כעיכול הבא דרוש. מניחים את לב cannulated תחת מיקרוסקופ דו עיני ולדמיין את קיר לב האחורי. לנתח למשל רקמה שאינה לבבית, ריאה שיוריתnd חלקי ספינה, כדי למנוע זיהום תא בחיץ העיכול באמצעות מספריים מיקרו (למשל, מספריים באביב עם 8 מ"מ להבים ישרים) כפי שמוצגים באיור 1.
8. בצע רשימת בדיקה שתאים מסוימים, אזורים, ו / או בתאים של לב collagenase מתעכל צריכים להיות בצור (איור 1): עזב ו / או עלייה ימנית, שמאלי חופשי ו / או קיר חדר ממני, ו / או מחיצת חדרית.
   1. לנתיחה של רקמות לב ספציפיות, להשתמש באמבטיה לנתיחה רחבה ושטוחה יחסית מצופה בשכבה עבה כמה מ"מ של אלסטומר פלסטיק סיליקון. תקן את שיאו של הלב עם סיכת פלדת חרקים קנס לשכבת אלסטומר התחתונה.
   2. להסיט את תוספת פרוזדורים הנכונה ולנתח את העלייה הימנית ממש מעל השסתומים בין העליות וחדרים. המשך לנתיחה עם הפרוזדור השמאלי. לנתח ולהשליך את מנגנון השסתום הסיבי. לבסוף, לנתח את קירות ימין ועל השמאל חופשיים חדרית ומחץ ו / או קטנהאה חלקי רקמה לפי צורך.
   3. שים לב רק לחניכים: כדי לקבל בפועל, להתחיל עם לבבות עכבר שאינו מתעכלים. על מנת להקל על התמצאות אנטומיים, לתרגל את הטיפול ברקמה הכולל את כל שלבי נתיחה ברציפות תחת ראייה דו עינית, כפי שמוצג באיור 1. ברגע האנטומיה 3D, טיפול ידני תחת ראייה דו עינית, וצעדים לנתיחה הם להכיר מספיק, להמשיך בלבבות עכבר collagenase מתעכל כ שתואר לעיל.
9. לmyocyte חדרית בידוד תא (VM): להעביר את רקמת חדרית ל2.5 מ"ל של חיץ עיכול טרי. אם בידודי תא בו זמנית ממספר חלקי איברים, למשל, הפרוזדורים וחדרי לב הוא ניסה, אדם שני עשוי להשתלט על רגל אחת של הליך ניתוק תא, שניהם כדי למזער ולייעל את השימוש בעכברים באמצעות טיפול מתואם של רקמות לב מרובות. תמשיך בצעדים 1.9.1-1.9.4, לאחר מכן 1.10.
   1. לנתח או כל רקמת חדריתאו חלקים מסוימים ממנו (למשל, LV, RV, קירות חופשיים, ו / או מחיצה) ל1 מ"מ ³ חתיכות כ ב2.5 מ"ל חיץ עיכול באמצעות מספריים חדים (למשל, מספריים באביב עם להבים ישרים 8 מ"מ) בצלחת פטרי 60 מ"מ .
   2. בעדינות לנתק מכונות וירטואליות לתוך ההשעיה תא על ידי טחינה דקה איטית של פיסות רקמה עם טפטפת העברה. הימנע מכל מבעבע אוויר בהשעית תא.
   3. הוסף 8 מ"ל של חיץ להפסיק את ההשעיה תא VM ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. לאפשר את חתיכות רקמה שנותרו ליישב בתחתית במשך כ 15 שניות, אבל קצר מספיק לתאים מבודדים להישאר בהשעיה. בשלב הבא, לקצור את ההשעיה VM באמצעות העברה של supernatant הנפח לצינור 15 מ"ל חדש. אם חתיכות רקמה מוגזמות נוכחים, לחלופין להשתמש רשת ניילון מינימאלי 200 מיקרומטר במרווחים להפריד את חתיכות רקמה מהשעית התא.
   4. בואו ההשעיה תא VM ליישב לתחתית של שיתוף 15 מ"לצינור nical על ידי כוח הכבידה במשך 8 דקות.
   5. לשטוף צעד: להסיר את supernatant ועדינות resuspend גלולה VM שנותר ב10 מ"ל של חיץ זלוף. צעד חזור על לשטוף 1.9.5 (אופציונאלי: להוסיף צעדים לשטוף נוספים כדי להגדיל בהדרגה את ריכוז Ca ^{2 +} בהתאם לצורך).
   6. Resuspend גלולה VM התיישב בחיץ זלוף 10 מ"ל ולהפיץ נותר תא ההשעיה הנפח ב1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge (כ -50,000 תאי VM לכל צינור).
10. בידוד תא myocyte (AM) פרוזדורים: להעביר את הרקמה מתעכל / גזור פרוזדורים ל1 מ"ל של חיץ עיכול טרי.
    1. חותך את רקמת פרוזדורים מעוכלת חלקית לכ 1 מ"מ ³ חתיכות במאגר עיכול מ"ל 1 באמצעות מספריים מיקרו בצלחת פטרי קטן (לדוגמא, קוטר 60 מ"מ). בעדינות לנתק תאי AM מתוך פיסות הרקמה מתעכלים לתוך ההשעיה תא באמצעות טחינה דקה עם טפטפת פלסטיק 1 מ"ל עם קצה לחתוך כדי למנוע סילון נוזל מזיק. במהלךטחינה דקה להימנע בקפדנות כל מבעבעת אוויר בהשעית תא. בעקבות תסיסה מכאנית, להוסיף 4 מ"ל של חיץ תחנה (50 מיקרומטר CaCl _2; BCS 10%) לעצור את כל פעילות collagenase שנותרה בהשעית תא.
    2. מעבירים את ההשעיה תא AM לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. לאפשר את חתיכות רקמה שנותרו ליישב בתחתית במשך כ 15 שניות, אבל קצר מספיק לתאים המבודדים להישאר בהשעיה. קציר supernatant המכיל את תאי AM בחינם דרך העברת פתרון לצינור 15 מ"ל חדש בנפח.
    3. צנטריפוגה ההשעיה AM התא, למשל, 2 דקות ב20 XG ב RT או - עדיפה ללימודי קרום - תן התאים להתיישב לאט על ידי כוח הכבידה ל20 דקות בצינור חרוטי 15 מ"ל.
    4. לשטוף צעד: לבטל את supernatant ועדינות resuspend גלולה AM ב 5 מ"ל חיץ זלוף. חזור על 1.10.4.
    5. תאי Resuspend AM בעדינות בחיץ זלוף 5 מ"ל. להפיץ את ההשעיה תא הנפח באמבטית microcentrifuge 1.5 מ"לes (כ -1,000 תאי AM לכל צינור).
11. לנתח ולתעד את איכות אוכלוסיית תא המבודדת לכל לב כולל תשואת התא באמצעות מכתים trypan הכחול.
    1. לשם כך, לדלל 500 μl של ההשעיה התא כ1: כרך פתרון 1 / כרך עם trypan כחול (ריכוז סופי 0.02%) באמצעות 1 מ"ל הטיפים פיפטה לחתוך. מערבבים את התאים וtrypan כחולים בעדינות על ידי איטי מאוד למעלה / למטה pipetting. מייד להחיל את trypan הכחול המכיל השעיה תא נויבאואר הסוג השתפר cytometer ולספור את myocytes שלם באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
    2. תכלול כל תאים עם נזק לכאורה, blebs קרום, פסים שיבשו, contractures, ותאי צבירה כחול תאיים trypan (איור 2). כמו כן תכלול באופן ספונטני הידבקות תאים, אשר רגישים למוות של תאים שלאחר מכן. כדי להעריך את הספירה של תאים שלמים בהשעיה, להשתמש myocytes לב רק עם פסים רגילים שלא לכלול trypan הכחול לאורךנפח התא.
12. לשפוט את היושרה של myocytes פרוזדורים וחדרית הבודד על ידי מיקרוסקופ אור מועברת. שמור את תמונת השדה בהירה כקובץ טיף לתיעוד וניתוח נוסף.
    1. השתמש בקריטריונים הבאים לניתוח של שלמות תא לב:
       1. לאשר את קיומו של פסים קבועים לאורך גלוי נפח התא;
       2. לאשר את התקינות רציפה של קרום פני השטח לרוחב משני הצדדים התא במקביל לmyofilaments;
       3. לדמיין serrations החד בדיסקי intercalated משני הצדדים התא המשקפים את השלמות של מבני קרום פני השטח מסוימים; ו
       4. לדמיין את אותות ניאון של קרומי מידות (או caveolin-3 חלבון immunolabeled או סמני קרום אחרים) כמפורט בסעיף 3 למתאם לוקליזציה ליד המורפולוגיה הבסיסית תא ספציפי בשדה בהיר תמונה (למשל, לשלב את שני התמונות עם ImageJ כמתאר לעצמי מתחם כיסויה).
       5. לקבוע את אורך sarcomere מתמונות השדה הבהירים. לאורך sarcomere ממוצע, למדוד את המרחק של פסי sarcomere ברצף מיושר, ולחלק את המרחק במספר sarcomeres. למדוד לפחות שני מקומות לכל תא. לבצע את הניתוח עם תוכנה מסחרית או לא מקוון עם ImageJ.
          הערה: אם שטופל בסוכנים שחררו את הסוגר, מכונות וירטואליות רגועות ללא פגע מלב העכבר להראות אורך sarcomere ממוצע של ~ 1.9 מיקרומטר ^28.
13. לכמת את המורפולוגיה ואת הממדים של myocytes פרוזדורים וחדרית פרט מתמונת מיקרוסקופ האור מועברת. קח בחשבון שתאים בבוקר וVM שונים באופן משמעותי בגודל. מדוד את אורך תא, רוחב, והאזור, ולחשב את האורך: יחס רוחב.
    1. נתח את ממדי תא 2D מתמונת האור מועברת בImageJ באמצעות כלי בחירת מצולע פקודות ולהוסיף למנהל את ההחזר על ההשקעה, דומה לאיור 3. אם ג מורפולוגייםhanges צפוי בהקשרים מחקר ספציפיים, מסמך נוסף לכל תאי זן העכבר הספציפי, גיל, מין, גודל לב, והתערבויות בשום צורה לסיווג נתונים שלאחר מכן.

.2 הכתמה של ממברנות מידות בחיים פרוזדורים וmyocytes חדרית

1. טען את חדר ההדמיה (למשל, POC-R2) עם coverslip זכוכית 42 מ"מ. עבור התקשרות myocyte היציבה לcoverslip, להכין 20 μl של פתרון laminin ידי 01:10 דילול של מניות laminin במאגר פיסיולוגי זלוף (מ"ג / מ"ל ​​ריכוז 0.2 סופי). מורחים 20 μl של פתרון laminin באופן שווה על coverslip הזכוכית.
2. הכן 800 μl של פתרון di-8-ANEPPS 50 מיקרומטר במאגר זלוף. לשם כך, לדלל 20 μl של פתרון di-8-ANEPPS מניית 2 מ"מ ב780 חיץ פיסיולוגי μl.
3. כדי להכתים מכונות וירטואליות, לתת לתאים להתיישב על ידי כוח הכבידה במשך 8 דקות בצינור 1.5 מ"ל תגובה. כדי להכתים AMS, או להשתמש בשקיעה הכבידה או spבהשעית התא למשך 2 דקות (עיין 1.10.3). עבור שניהם אדמיניסטרטיבים ומכונות וירטואליים, להסיר בזהירות את supernatant תוך הימנעות תסיסה מיותרת של התא גלולה ובעדינות resuspend התא גלולה ב800 μl של di-8-ANEPPS מכיל פתרון (50 מיקרומטר). מייד להעביר את di-8-ANEPPS / ההשעיה myocyte על coverslip מצופה laminin בחדר ההדמיה.
4. כתם ההשעיה VM ל15 דקות ב RT בחושך.
5. לאט לאט להסיר את הנפח עודף באמצעות המניסקוס הנוזל כלפי מעלה בצדדים של חדר ההדמיה עם טפטפת במדריך. ודא שmyocytes רוב di-8-ANEPPS המוכתם נשאר מחובר היטב לcoverslip מצופה laminin ולא להיות חשוף לאוויר. בשלב בא, לשטוף את ההשעיה myocyte המצורפת פעם אחת על ידי הוספה באיטיות 1 מ"ל של חיץ זלוף ואחרי הסרת כל נוזלים עודפים כוללים תאים שאינם חסיד.
6. כיסוי בזהירות את myocytes המוכתם ומשטח מצורף עם 1 מ"ל של חיץ זלוף מהצד של t לאטהוא ההדמיה קאמרית. הנח את תא ההדמיה על הבמה מיקרוסקופ.

.3 הדמיה של מבני המידות ממברנה בmyocytes חיים הפרוזדורים וחדרית

1. באופן כללי, לבחור בזהירות את האפשרות הטובה ביותר האפשרית מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ים) זמינה להדמית קרום מידות. הדמיה confocal, לשקול דור האחרון, מיקרוסקופי הקרינה מודרניים עם גלאים מותאמים PMT מערך ונתיבי מחזור הפוטון כי למקסם עוצמת אות ניאון. הדמיה confocal של פרטים קטנים יותר של מידות מבני קרום להשתמש 63X שמן 1.4 NA אובייקטיבי או - בהתאם לזמינות - משתמשים במיקרוסקופ superresolution STED לפרטים הקטנים ביותר מידות כפי שנסקר עבור יישומי myocyte ספציפי על ידי קוהל et al ³⁴ לעקרונות כלליים של גבוה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה, עיין בסעיף הדיון.
2. הגדר את הפרמטרים ההדמיה כדי לאתר את רוב, באופן אידיאלי כל מזכרות תאיות מוכתם di-8-ANEPPSbranes בתוך מטוס הדמיה myocyte נתון. השתמש בפרמטרים הבאים כנקודה מוצא למיקרוסקופיה סריקת לייזר confocal: עירור 458 ננומטר למשל, ב -3% מכוח הלייזר המקסימאלי; לזהות את האות הנפלטת בין 550 ננומטר ו740 ננומטר; רווח גלאי (לדוגמא, פקודת האדון 800); והחריר 1 AU לעובי פרוס אופטי של 900 ננומטר. להתאים את הפרמטרים אלה כדי לייעל את האות לרעש.
3. השתמש במצב בשדה הבהיר כדי לבחור AM שלם או תא VM כ( איורים 4 א ו -4 ב) מתאימים. עיין להצביע 1.12 לקריטריונים רלוונטיים איך לשפוט שלמות תא כדי לבחור תאים כפי שסוכם: פסים רגילים תא רחב ומרווח sarcomere שווה, קצות משטח חדים ומשוננים בכל ארבעת הצדדים התא, יושרה רציפה של קרום פני השטח לרוחב, והעדר כל blebs קרום.
4. קח לדוגמא תמונה של סעיף myocyte תאיים מרכזי. כדי להתאים את ההחזר על ההשקעה להשתמש → "היבול" הפונקציה; להתאים את חלון יבול → גודל פיקסל הסופי מודד 100 ננומטר x 100 ננומטר. התאם את ציר x של חלון היבול להתכתב עם (צירי / אורך) הציר המרכזי של myocyte.
5. בחר את מטוס ההדמיה הסופי. השתמש מסגרות תמונה אחת כדי לבחור באופן ידני את מטוס ההדמיה המתאים בz-הכיוון. ודא שקרומי המידות, כולל T-אבובית ורכיבים-אבובית, מבחינה ויזואלית ברורים במישור המוקד. שימו לב שמטוס הדמיה תאית אופייני עשוי לכלול גרעין כנקודת התייחסות תאית. עיין בדוגמאות באיורי 4 א ו -4 ב.
   הערה: באופן כללי, לשמור על תא חשיפה לאור הלייזר קצר ככל האפשר. במידת האפשר, להשתמש במסגרות תמונה אחת כדי לקבוע את מישור המוקד האופטימלי בmyocytes לב.
6. התאם את הזמן להתעכב פיקסל כ 0.5 μsec. בחר 16x מיצוע ולהקליט את התמונה כתמונת מצב. חזור על שלב תמונת מצב התמונה להקים מטוס ההדמיה המתאימהs תואר למבני קרום מידות ב3.5 לפי צורך.
7. שמור את התמונה הסופית ולאשר שהקובץ נשמר בתיקיית היעד שלה. באופן כללי, לשמור את כל קבצי התמונה באותו הפורמט (למשל, LSM) ליישום אחיד של תוכנת ניתוח. לפני כל ניתוח תמונה, שוב לאשר שלמות תא מספיק off-line (לשקול קריטריונים רשומים תחת צעד 1.12.1) ואינם כולל את כל תאים שניזוק מהניתוח. עיין בדוגמאות ב4C דמויות ו4D.

.4 ניתוח רשת ממברנה המידות ורכיביה

צעדי עיבוד התמונה הבאים לניתוח ישיר של רכיבי קרום מידות מסוכמים כתרשים זרימת עבודה מלמעלה למטה ב5A דמויות ו5B.

1. פתח את קובץ התמונה של myocyte המוכתם di-8-ANEPPS בפיג'י (http://fiji.sc/), גרסה זמינה באופן חופשי של ImageJ המכילה תוספי ניתוח חיוניים לעיבוד תמונה. למידע נוסף אנא עיין בSchindelin et al ^29.
2. שמור את קובץ → התמונה → השמירה ב→ טיף.
3. כדי לנתח את מרכיבי קרום המידות, בחר את ההחזר על ההשקעה המתאימה לא כולל את אות קרום פני השטח החיצונית, ולאחר מכן להשתמש בכלי "מצולע בחירה" להתוות את גבול ההחזר על ההשקעה ללא קרום פני השטח החיצוני (sarcolemma) וכולל מנות תאיות של ממברנות מידות כפי שמוצג ב איור 5 א (ROI). הוסף את ההחזר על ההשקעה שנבחרה ל" מנהל ההחזר על ההשקעה "על ידי היישום לנתח → כלים → מנהל החזר על השקעה.
   1. כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה ספציפית לניתוח הכיוון של רכיבי מידות, ליישר את הציר המרכזי אורכי התא וציר x תמונה במקביל. אם התא הוא מעט מעוגל, לבחור כמה ROIs וליישר כל החזר על השקעה בנפרד. תכלול כל גרעינים מהניתוח. תכלול כל תאים מעוגלים יתר על המידה מהניתוח כי יישור מדויק של ROIS יהפוך קשה יותר ויותר ולהגדיל את שגיאות אורינטציה במהלך ניתוח.
4. כל מידע אות רצוי מקרום פני השטח החיצוני מחק: עריכת → נקה בחוץ על מנת ליצור את "ההחזר על ההשקעה הנבחרת" (איור 5 א). ודא שההחזר על ההשקעה שנבחרה מכיל רק את חלקי קרום תאיים, אשר מתאימים לרשת המידות.
5. בצע את השרשרת של צעדי עיבוד תמונה (פקודות) לפני הניתוח כמותי שלאחר מכן כפי שתועד באיור 5 א הבאים.
   1. לחץ על תהליך → → רקע פחת. הגדר את רדיוס כדור רולינג עד 5 פיקסלים.
      הערה: הגדר את רדיוס הכדור מתגלגל עד 5 פיקסלים אם התמונה להיות מנותחת יש גודל פיקסל של 100 ננומטר x 100 ננומטר. עבור גדלי פיקסל אחרים להגדיר את רדיוס הכדור מתגלגל למספר הפיקסלים שכ מתאים לרדיוס פיזי של 500 ננומטר.
   2. לחץ על → תהליך → שפר ניגודיות המקומית (CLAHE). הגדר את גודל הבלוק ל49, פחי היסטוגרמה 256, שיפוע המרבי עד 3, ואת המסכה "אף אחד".
   3. לחץ על → תהליך → חלק.
   4. לחץ על → Plugins מזיגת פילוח → סטטיסטי אזור →. הגדר את הפרמטרים לQ100 → לחץ על ממוצעים הצג.
   5. לאשר עיבוד של האזור הסטטיסטי שלם מיזוג שצוין על ידי הצגה אוטומטית של מסגרת תמונה חדשה ולאשר כי "ש SRM = 100" התווית מופיע. המשך הצעדים עם קובץ התמונה הבא. לחץ על סוג → התמונה → → 8-bit.
   6. לחץ על תמונת → → התאם → סף. בחר את הסף הנמוך מספיק כדי לזהות את מרבית, באופן אידיאלי כל מבני המידות, בהדרה להימנע מסוימת של רכיבי מידות עם עוצמת אות נמוכה (השתמש סף של 40 כנקודת התחלה). התייעץ "נציג התוצאות" עבור פלט נתונים מפורט ודוגמאות באיור 6(סף עליון של 255). לתעד את הבחירה הסופית של פרמטרים סף. שימו לב שהבחירה הנכונה של סף צריכה לייצר מבני קרום מידות רק ספציפיים אבל לא אותות חיוביים כוזבים בשל רעשי רקע.
   7. לאשר חפיפה נכונה של פרטי תמונת מידות לעומת הנתונים שחולצו שלד, בפרט לרמות אות הקרינה בינונית וגבוהה, שאמור להתאים את ההמשכיות (תצוגה) של מבנה השלד. ברגע סף מתאים זוהה, ליישם את אותו סף זה לכל התמונות במהלך ניתוח ולחזור על השוואת הכיסוי של האות המקורי לעומת נתוני שלד כדי למזער מקור פוטנציאלי של הטיה באופן עקבי.
   8. לחץ על → החל: נתוני התמונה הופך להיות בינארי, כפי שמוצגים באיור 5 תחת "סף".
   9. לחץ על → Plugins → השלד → Skeletonize (2D / 3D). שמור את תמונת 2D skeletonized (כפי שמוצג באיור 5) כקובץ טיף ידילחיצה על קובץ → → שמירה כ→ טיף. לנתח את קובץ תמונת skeletonized לפלט נתונים כמותיים על ידי לחיצה על → Plugins → לנתח שלד (2D / 3D). בחר את שיטת מחזור שזיפים: אף אחד. לאשר יצירה אוטומטית של טבלת הנתונים וכתוצאה מכך.
   10. שמור את טבלת הנתונים שנוצרו באופן אוטומטי כקובץ txt. בחר את הפרמטרים כמותיים הרלוונטיים למשל, את המספר הכולל של נקודות סניף או אורך הסניף הממוצע כפי שמוצג על ידי נתונים למופת באיור 7. שקול ניתוח נתונים נוסף עם / כלי תוכנה תמיכה משלימים כמו Excel ומתאים כ.
6. שקול להשתמש גר עיבוד תמונה אוטומטי בכל ההזדמנות אפשרית, כולל כל צעדים הדרושים שתוארו תחת 4.5 להביא לידי הרמוניה את הניתוח בין תמונות בודדות ו / או קבוצות תמונה. השתמש בקובץ הקוד המשלים הדוגמא המכיל מאקרו עיבוד תמונה מתוכנתים לפיג'י (להתאים את תכנות לפי צורך).
7. לנתח באוריינטציות dividual של בחרו או כל רכיבי רשת מידות מנתוני תמונת skeletonized ידי פיג'י תוסף "כיווניות". צור היסטוגרמה יווניות בי-אבובית או רכיבי T-אבובית אוריינטציה transversally אוריינטציה axially בהתאמה מיוצגות על ידי 0 ° או 90 ° הפחים. שים לב להתייחסות הנכונה של כיוון תמונה ושזה חשוב לציר x של התמונה להתכתב עם 0 ° הציר (האורך) העיקרי של תא VM הדוק כפי שמוצג באיור 8 ונציג תוצאות.
   1. לחץ על → לנתח → יווני → לציין שיטה: רכיבים פורייה, Nbins 180, היסטוגרמה להתחיל -45 → לחץ על שולחן תצוגה.
   2. שמור את טבלת תוצאות שנוצרה זה עתה ומוצג לרבות נתונים היסטוגרמה הקשורים כקובץ txt. לשקול ניתוח נוסף של נתוני קובץ txt על ידי כלי תוכנה חינם כמו Excel ולפי צורך.
8. כדי ליצור subclasses שלנתונים כמו מערכי נתונים מקובצים לדוגמא, לכל התאים שטופלו תחת אותו המצב (ותנאים שעלולים להיות אחרים), לחזור על הניתוח על השלבים 4.1-4.7 לכל תמונות הרלוונטיות כמתאימים. ייבא את הפרמטרים נתונים skeletonized מכל התמונות לקובץ Excel בשילוב אחד על מנת להפיק ערכים ממוצע. בנוסף, לייבא את כל נתוני היסטוגרמה יווניות מאותו מערך נתונים המקובצים לקובץ Excel בשילוב לחשב וליצור היסטוגרמה יווניות הממוצעת. לשקול עיבוד נוסף של מערכי נתונים מקובצים לנתח פרמטרים של רשת מידות נוספות של ריבית לקבוצות טיפול השונות אדם או בין לפי צורך.

תוצאות

בנוסף, לניתוח רשתות קרום מידות מספר טכניקות ביולוגיה של תא נפוץ כמו הדמיה תאית Ca ^{2 +,} אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק, או מחקרי מנת תגובה תרופתיים תלוי באופן קריטי על בידוד תא ראשוני באיכות גבוהה מהאטרייה או חדרי לב או בחר חלקים של רקמת לב כדי לאפשר אפיון של myocytes לב שלם מובחן, מבחינה מבנית והפיזיולוגי הבוגר. לפיכך, הערכת הבידוד ואיכות לתאים בבוקר וVM המתוארים בסעיף 1 היא סופו של דבר מועיל לשאלות רבות ושונות, כולל ניתוח רשתות מידות שתואר כאן, שתלוי באופן קריטי על קרום שלם ושלמות תא.

איור 1 מספק מדריך לצעד חכם של תמונות כיצד להמשיך עם נתיחת רקמת הלב מתחילה עם תאי פרוזדורים בלב עכבר. בהמשך לכך, התאים של החדר ומחץ מוכניםד גזור לפי צורך. בחירה והכנה של חלקי הרקמה הנכונים מדויקות חשוב להקים באופן מהימן בידודי AM וVM עם טוהר תא מספיק. בעקבות עיכול collagenase זה יכול להיות קשה יחסית לזהות את הקו הנכון של נתיחה בין פרוזדורים ורקמת חדרית, אבל ברגע שהתאים בבוקר וVM מעורבבים בלתי מבוקרים בהשעית תא, אי אפשר להחזיר את הגלגל לאחור אוכלוסיית תאים המעורבת. לכן, נטייה אנטומיים, הדמיה רקמת 3D, מספיק ניסיון עם טיפול רקמות מעוכל, זיהוי נכון של חלקי רקמה ספציפיים וקווי הנתיחה שלהם, כל אלה תורמים להצלחה של בידוד התא.

איור 1.Dissection של רקמת פרוזדורים. () מול החלק הקדמי של הלב, שתי של כירורגיםutures לתקן את אב העורקים הפרוקסימלי לסוף הגדם של צינורית 21 פלדת G. צפה (ב ') לקראת מופעי בסיס לב שנותרו רקמת ריאה ולהקשות על תצוגת תא פרוזדורים במהלך נתיחה. LA, עזב אטריום; דלקת מפרקים שגרונית, עלייה ימנית. (C) lungtissue נותר וכלי גדול הוסרו כדי לגשת לתאי פרוזדורים. מילאתי ​​משולש שחור, עורק ריאה; משולש מפוספס, ורידי ריאה; מילא משולש לבן, וריד נבוב עליון; משולש בארגזים, וריד נבוב תחתון. (ד) ראשית, קיר פרוזדורי ימין גזור בעוד המלקחיים להחזיק את תוספת פרוזדורים. (E) צפה בלתוך חלל תא פרוזדורים תקין. המשולש השחור מסמן את מחיצת interatrial שלמה. (F) לנתיחה שהמשיכה להיכנס לחלל חדר פרוזדורי השמאל. (G) בעקבות נתיחה של פרוזדורי ימין ועל שמאל מלא, השסתומים בין העליות והחדרים הפכו גלויים. מנגנון השסתום הסיבי הוא גזור והושלך לsubsequently לקצור רק רקמת שריר של חדר. תצוגה (H) האחורית של פרוזדורי ימין ועל שמאל המבודדים. LA, עזב אטריום; דלקת מפרקים שגרונית, בארים תקין atrium.Scale: 700 מיקרומטר.

כדי לקבוע את האיכות של בידודי תא, איור 2 מספק דוגמאות תא טיפוסיות במהלך ההערכה של התשואה והכדאיות של מוט או לבנים בצורה myocytes שלם המפוספס טיפוסיים, הן עבור אדמיניסטרטיבים ומכונות וירטואליים. קצת פגום, מבחינה ויזואלית לא בולט, כמו גם תאים שניזוקו באופן חמור עם מורפולוגיות חריגות יתר על המידה מעוקלות, או תאים כדוריים לא נורמלים בצורה, יכול להיות מזוהה בקלות כולל הרחקת trypan הכחולה כפי שתואר בסעיף 1.11. בעוד myocytes שלם יישאר בהיר וhomogenously משורטט בעת החשיפה לtrypan תאי הכחול, תאים פגומים בדרך כלל להראות blebs קרום מרובה ו / או במהירות לצבור נזק trypan הכחול intracellularly המציין קרום. עם זאת, trypan כחול על ידי עצמו יכול להזיק לתאים דרך unnecessarily דגירה ארוכה והערכת איכות תא מיידית ולכן חובה. דוגמאות לצורות ברורות יותר של נזק לתאים כמו התכווצות myofilament או שלמות נזק פני השטח ברוטו להתפשר תא מוצגות ב4C דמויות ו4D. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 Trypan מכתים תא הרחקה כחולה. מבודד () בבוקר, ותאים (B) VM מעורבים בהשעיה עם trypan הכחול ומדמיינים ידי מיקרוסקופ אור הפוכה שמוצגת ב40Xmagnification. הערה thatabnormal תאים כדוריים ב (א) ו (ב) תופסים trypan כחול, שindicatesmembrane leakage ונזק מבנים. בניגוד לכך, תאי centralAM וVM עם קרומים שלא לכלול trypan הכחול כפי שמוצגים. יתר על כן, שים לב כי בבוקר שלם ותאי VM להראות פסי sarcomere ברחבי תא הנפח שלהם, blebs nomembrane, וקצוות חדים בשני הצדדים לרוחב ושני דיסקי intercalated. ברים סולם: 20 מיקרומטר.

בעקבות תשואות בידוד, תא מוצלחות של מכונות וירטואליות מ5 x ^{5 אוקטובר - 6 אוקטובר} ניתן לצפות ממערכת עיכול לב עכבר אחת. התשואה של AMS היא נמוכה באופן משמעותי בסדר הגודל של תאים לא כולל 3 x 10 ³ x 3 10 ^4, trypan הכחול דמוי מוט. בניגוד לVM, הנני בידודים לעתים להיכשל אפילו בידיים מנוסים. שלב 1.11 מסכם נהלים כיצד להעריך את התשואה של תאים בריאים מבודדים בהשעיה. בנוסף, לקבוע את ממדי תא הממוצע עד שלב 1.13 כפי שמוצג באיור 3 עבור AM בודד או מבודד תא VM או כדי להשוות AM לעומת אוכלוסיות תאי VM Side-by-צד (לפי צורך). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור ניתוח morphometric שדה 3.Bright של myocytes לב. גובה VM זוהה על ידי כלי ניתוח תמונה המתוארים תחת צעד 1.13. השתמש בכלי בחירת המצולע חזותי סימן ולהגדיר את הגבול תאי של התאים שהוגדר על ידי קרום פני השטח החיצוני לניתוח. מודעת האזור הנבחר של עניין (ROI) למנהל את ההחזר על ההשקעה ואחרי מדידות מרחק 1D. ללימודים השוואתיים של AM לעומת ממדי VM, כדאי לתעד את אורך תא, רוחב, והאזור, וכדי לחשב את האורך: יחס רוחב.

nt "> לממברנות מידות כתם fluorescently או בתאי AM או VM, צבע הקרום נפרד di-8-ANEPPS משמש כאמור בסעיף 2 ואחריו מיקרוסקופיה confocal, אשר הביאה את תמונות הנציג של רשתות מידות שמוצגים באיורי 4 א ו 4B. בנוסף, איור 4 א מציג את תמונת האור המועברת המקבילה של AM שלם Side-by-צד עם תמונת מידות confocal (לרכישת תמונה ראה סעיף 3). כפי שתואר על ידי צעד 1.12, שלמות הקרום מורפולוגיים ופני שטח של חיים myocytes נשפט דרך תמונות אור המועברות. האזור המוגדל של אות di-8-ANEPPS מדגיש את המורפולוגיה הבסיסית של רשת המידות בAMS, מאופיינת בצירי בשפע tubules קרום (אורך). לעומת זאת, מורפולוגיה המידות של מכונות וירטואליות בריאים כפי שמוצג באיור 4 מתאפיין במספרים כ דומים של צירירכיבים רוחביים ד. בניגוד לכך, דמויות דוגמאות מופע 4C ו4D של myocytes לב הפגוע שצריך להיות מחוץ ניתוח נוסף. בפרט, תא AM באיור 4C הוא נדבק כפי שמעיד אורך קצר באופן חריג sarcomere של 1.2 מיקרומטר ורשת לא סדירה, מעוותת מידות ואילו תא VM באיור 4D מציג blebs קרום מרובה (כמה מודגש על ידי משולשים אדומים) המצביעים על שיבושי קרום , אשר עלול להתרחש בקרום פני השטח החיצוני, אלא גם בקרומי המידות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מכתים קרום איור 4.Live של פרוזדורים ללא פגע ומיו חדריתcytes. מקביל מועבר אור ותמונות confocal החיים di-8-ANEPPS מוכתם בשלמותה (א) בבוקר ותאים (B) VM. בניגוד לכך, בבוקר באופן חלקי חוזה ואפשרות שנפגע באורך sarcomere של 1.2 מיקרומטר מוצג ב( C). myocytes נדבק בדרך כלל להראות באופן חריג מקוצר ומבני מידות מעוותים, ולכן לא נכללו בניתוח נוסף. עוד אינדיקטור חשוב לפגמי קרום תא הוא blebs קרום (משולשים אדומים) כפי שמוצגים בVM ב( ד '). blebs קרום מייצגים מבני ניזוק משטח קרום ותאים עם blebs צריכים להיות מחוץ ניתוח מידות נוסף. יתר על כן, VM תערוכות נזק גולמי כנראה חסר חלק שלם של החלק השמאלי התחתון שלו (המסומן בכוכבית). לסיכום, על ידי השוואת אור מועבר ותמונות confocal, תאי המורפולוגיה ותקינות משטח מתועדת ומשולבת עם מידע אות ניאון. הסימנים 'N' נוclei הושמט מהניתוח של כתם קרום המידות. צהובים ברים לציין מוגדלים ROIs מאותה התמונה confocal שהוצגה לעיל. ברים סולם:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תמונות confocal של קרומי מידות עם יחס אות לרעש מספיק כפי שמוצגים באיורי 4 א ו -4 ב מתקבלות לניתוח כמותי נוסף. ניתוח קרום המידות מבוסס על נתונים skeletonized נגזרים ממרכיבי אות מרובעות ניאון. איור 5 מראה את תרשים זרימת העבודה של צעדי עיבוד תמונה הבודדים שמתוארים בפירוט בצעדים 4.3-4.5. צעדים אלה להפיק תמונות skeletonized מייצגות מידות מרובעות רשתות קרום כפי שמוצגים עבור כל VM (איור 5 א) המבודדים והננו תאים (Fiתרשים 5 ב).

איור 5.Workflow לskeletonization של תמונות מידות ניאון. מדרגות עיבוד תמונה אשר יובילו לתמונת skeletonized של רשת המידות מיוצגות על ידי דוגמאות תמונה בודדות צעד אחר צעד הן עבור di-8-ANEPPS מוכתם VM (א) ו AM (B). לצעד עיבוד תמונה בודד, עיין בסעיף 4. הערה הבדלים בברים בקנה מידה:. 20μm (א) ו 10μm (ב ') אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

צעד קריטי במהלך עיבוד תמונה, לקבוע את הסף המתאים לbinarization נתונים כאמור בסעיף 4.5.6. התמונה בינארי וכתוצאה מכך צריכה לכלול רק אותות אמיתיים קרום מרשת המידות, אך לא מבנים כוזבים שהופקו על ידי thresholding השגוי מרעש אות רקע. עם זאת, חשוב שהסף הוא נמוך מספיק כדי לזהות את כל מבני המידות נכונים כך שרכיבי מידות אמיתיים לא הולכים לאיבוד בטעות במהלך ניתוח תמונה. איור 6 ממחיש את התהליך כיצד לבחור את הסף במהלך binarization נתונים. בעוד סף של 40 כפי שמוצג ב6B דמויות ו6C נראה מתאים כדי לזהות את כל מבני המידות האמיתיים בנפרד, בחירה למשל סף גבוה יותר, של 60 כפי שמוצג באיור 6 א אינו מזהה מבנים צירי חלשה קרום (ATS) כפי שצוין על ידי משולשים צהובים . בניגוד לכך, בחירה למשל סף נמוך יותר, של 20 כפי שמוצגים באיור 6 ד מובילה לזיהוי שגוי של מבני מידות כחיוביים שגויים רעשי רקע כפי שצוינה על ידימשולשים צהובים.

איור 6.How כדי לקבוע את סף האות במהלך skeletonizing של נתוני תמונת מידות. דוגמאות להראות שלדי מידות כל שנוצרו עבור ספים שונים במהלך binarization נתונים (המתוארים בשלב 4.5). תמונות העליונות: מראות התאמות הסף באמצעות פיג'י. תמונות תחתונה: כיסוי של תמונות skeletonized עם תמונת הקרינה קלט המקבילה ואזורים מוגדלים כפי שצוין. למשל סף גבוה, 60 יושמו ב() הוא כנראה לא מתאים כדי לזהות את כל מבני המידות האמיתיים כפי שצוין על ידי משולשים צהובים בקטע המוגדל. סף של 40 יושמו ב( ב) ו (ג) מזהה את כל מבני המידות וצורה נכונה אינו מזהה רעשי רקע, ואילו למשל סף נמוך., 20 ב( ד ') בטעות מזהה רעשי רקע כמבני מידות ובכך מייצר אותות חיוביים שגויים של מבני קרום שאינו קיימים. אותות חיוביים שגויים מסומנים על ידי משולשים צהובים בהבלעה המוגדלת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"נתח השלד (2D / 3D)" תוסף תומך בניתוח מפורט של מבני מידות skeletonized. ברגע שהוצא להורג, התוסף מייצר טבלת הנתונים עם הפרמטרים הבאים השלד: #branches, #junctions, voxels נקודת סיום #, אורך ממוצע סניף, נקודות #triple, נקודות #quadruple, ואורך סניף מרבי. לתיאור מפורט של כל הפרמטרים הפלט האפשריים עיין tohttp: //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton ומאמרים הקשורים ^29-31. פלט טבלת הנתונים טיפוסי מוצג באיור 7 א.

אורך שלד הכולל להחזר על השקעה:

Σ (x #branches אורך סניף ממוצע) = 5155 px = 515.5 מיקרומטר

האורך הכולל של השלד יכול להיות מנורמל לאזור התמונה. לדוגמא מוצגת באיור 7 אורך השלד המנורמל של 0.64μm / מיקרומטר ² והסכום של כל צמתים מחושבים כפי שמוצגים להלן:

אורך שלד מנורמל:

515.5 מיקרומטר / 803.6 מיקרומטר ² = 0.64 מיקרומטר / מיקרומטר ²

מספר מנורמל של צמתים:

155 צמתים / 803.6 מיקרומטר ² 2

איור פלט נתונים 7.Automated מתמונות skeletonized. גיליון אלקטרוני נתונים אופייניים שנוצר על ידי התוסף 'לנתח שלד (2D / 3D) "מתמונת skeletonized מוצגת ב( ב) (). לתיאור מפורט של פרמטרים פלט אפשריים להתייחס בבקשה לhttp://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יכולים להיות אוטומטי צעדי עיבוד תמונה מתוארים תחת 4.5 ובאיור 5 באמצעות מאקרו פיג'י מסופק כקובץ משלים קוד 4.3 ו4.4. מאקרו יכול להיות יתרון לניתוח של קבוצות במערך שלמות, למשל על ידי הכנת ערימות תמונת כניסה נפרדות לכל אחת מקבוצות טיפול עצמאיות לניתוח אוטומטי באמצעות פקודות מאקרו.

אסטרטגית התוכנה שמתואר נוסף מאפשרת ניתוח אורינטצית רשת מידות עבור כל הרכיבים. לשם כך, השתמש בתוסף "כיווניות" (http://fiji.sc/Directionality) ^29,31 אשר מייצר נתונים היסטוגרמה המציגים את התפלגות הנטייה של כל מידות אוריינטציות רכיב. אם ציר x של תמונת הקלט תואם את הציר המרכזי של תא AM או VM נתון, צירי רכיבי מידות (אורך) יהיו מיוצגים על ידי הסל 0 °, ואילו הרכיבים הרוחביים יהיו מיוצגים על ידי 90 &176 #; בן. איור 8 מראה יווני מופת היסטוגרמות מתמונות מידות skeletonized לVM (8A) לעומת תא AM (8B). בעוד היסטוגרמה כיווניות של VM טיפוסי מראה הפצת שיא כפולה ב0 ° ו90 °, היסטוגרמה AM מציגה שיא דומיננטי יחיד ב0 °. דוגמאות אלה הן בהסכם עם תצפיות קודמות שרכיבי מידות בודדים של מכונות וירטואליות הם כמעט חילקו שווה בשווה בין T-tubules ו- tubules, ואילו רכיבי מידות באדמיניסטרטיבים יכולים להיות מורכבים בעיקר מ- tubules.

איור היסטוגרמה יווני 8.Representative מרשתות מידות של תאים בודדים. היסטוגרמות יווניות נוצרה מתמונות skeletonized של VM הבודד () לעומת בבוקר (B >) רשתות מידות חזקות. בהתחשב בכך שציר x של התמונה ניתחה תואם את הציר המרכזי (אורך) של myocyte כפי שמוצג, רכיבים-אבובית מיוצגים על ידי הסל 0 °, ואילו רכיבי T-אבובית מיוצגים על ידי בן 90 °. גאוס מתאים רק לpeakasshown היסטוגרמה הגדולה כגרף רקע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חיץ זלוף	מ"מ
NaCl	120.4
KCl	14.7
KH 2 PO 4	0.6
Na 2 HPO 4	0.6
4 MgSO	1.2
HEPES	10
NaHCO 3	4.6
טאורין	30
2,3-Butanedione-monoxime	10
גלוקוז	5.5
pH 7.4
חיץ עיכול	מ"מ (אם לא צוין)
NaCl	120.4
KCl	14.7
KH 2 PO 4	0.6
Na 2 HPO 4	0.6
4 MgSO	1.2
HEPES	10
NaHCO 3	4.6
טאורין	30
2,3-Butanedione-monoxime	10
גלוקוז	5.5
סוג Collagenase השני	600 U / ml
pH 7.4
חיץ Stop	מ"מ (אם לא צוין)
NaCl	120.4
KCl	14.7
KH 2 PO 4	0.6
Na 2 HPO 4	0.6
4 MgSO	1.2
HEPES	10
NaHCO 3	4.6
טאורין	30
2,3-Butanedione-monoxime	10
גלוקוז	5.5
CaCl 2	0.0125
עגל בסרום שור	10%
pH 7.4

solut 1.Buffer שולחןיונים. התוכן של שלושה פתרונות חיץ פיסיולוגיים שונים לבידוד תא והדמיה מסוכמים.

דיון

למרות myocytes לב היה מבודד ולמד במשך עשרות שנות ^32, הסקירה האחרונה הגיעה למסקנה כי בידודי תא myocyte באיכות גבוהה בקנה אחד יישארו מאתגרים ^27. זה משקף פרוטוקולים מורכבים יחסית לבידודה של myocytes לב העיקרי כלפי מול חוסר גישות סטנדרטיים נפוצות, מטה משותף, ותיעוד באיכות תא שקוף. פרוטוקולי בידוד תא בדרך כלל מותאמים אישית על ידי קבוצות בודדות, לייצר תוצאות משתנה של תא מבודד, תלויים בהגדרות בודדות דגם (לדוגמא, מין, גיל, מחלות לב coexisting), והם בדרך כלל מותאמים לתנאי ניסוי מסוימים. בהקשר של המידות כמותי מחקרי קרום ופרוטוקולים שהוצגו כאן, ברמה מהותית של הערכת איכות ותיעוד נוגע למיקרוסקופיה confocal או superresolution של מבני קרום תא בודדים נוטים לשינויים תלויים חילוף חומרים ופרוטוקול בידוד, שניהםבבוקר או VM. חשוב לציין, גם אם תשואות גבוהות של בידודי תא מציעות myocytes שלם בריא, חוקרים צריכים לתעד וביקורתי לשפוט כל תא בודד בזהירות נגד קריטריונים מורפולוגיים של פני השטח ושלמות קרום מידות לעומת נזק שאינו ספציפי בשל נהלי בידוד לעומת שינויים ספציפיים בשל סוגים שונים של התערבויות בהשוואה לשליטה בתנאים. משתנה חשוב בבידוד תא לב הוא הפעילות הספציפית של הרבה collagenase נתון. כדי לבחור הרבה חדש של collagenase, הפעילות האנזימטית של כמה דגימות collagenase צריכה להיבדק אחד נגד השני על ידי הערכת תשואת myocyte לב ואיכות, ובהתאם להוראות יצרן. באופן אידיאלי, הרבה חדש של collagenase מזוהה עם פעילות collagenase דומה להרבה השתמש בהצלחה קודמת (להערכה מורחבת של פעילויות אנזים אפשריות מתייחס ל" כלי הבחירה הרבה collagenase "בטבלת החומרים ושיטות). TAken יחד, גישות כמותיות של הדמיה קרום מידות תלויות באופן קריטי על איכות בידוד תא ו, להיפך, בידודי תא לב מובילים לנזק קרום נוקב כפי שתועד על ידי מיקרוסקופ מידות צריכים לעורר ביקורת ותיקון קריטיות של נהלי הבידוד. מאז איכות בידוד התא ויזואליזציה קרום המידות וכימות קשור באופן מהותי, את הפרוטוקולים שנדונו במאמר זה לכסות את כל ההיבטים המרכזיים כאסטרטגיה מתמשכת.

אתגר נוסף ובעיה נפוצה של מחקרי לב, נזק לתאים ו / או אובדן תא להתרחש עקב התערבות מטבולית להתפשר למשל, בעקבות אוטם שריר לב ^9, עדיין צריכים להישפט על פי דוגמא נזק שלא במתכוון פוטנציאלית, בעקבות תסחיף אוויר מעיניו במהלך בידוד תא. בידוד של myocytes לב מלב חולה עלול להוביל ל, אובדן תא משמעותי נוסף וירידה בתשואות תא. לכן, comparison של המספר הכולל של תאים שלמים מבודדים בין שליטה ולבבות חולים יכול להיות משמעותי אם בידוד תא וספירה מיושמים באופן עקבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. כתוצאה מכך, זה הוא קריטי כדי לשפוט שלמות תא דרך קבוצת ביקורת מתאימה, המבטאת את איכות בידוד תא myocyte הטובה ביותר האפשרי. חשוב לציין, באיכות תא בודדת ומיקרוסקופיה תא החי של בריא לעומת חולה לעומת myocytes נפגעו בטעות על ידי הליך הבידוד עשויים להשפיע על הניתוח של רשתות קרום מידות באופן משמעותי. הפרוטוקולים שהוצגו כאן ולכן מדגישים את השלמות ויציבות של רכיבי קרום פיסיולוגיים במהלך בידוד תא ומיקרוסקופיה תא החי של קרומים. כל זרימת העבודה נועדה כאסטרטגיה מתמשכת כדי להשיג ולשמר את מרכיבי קרום מידות ללא פגע ואילו בניכוי תאים פגומים, שכן אלה יציגו חפצי קרום תלויים בידוד כמו צינוריות קרום שיבשו, membranblebs דואר, ורשתות מידות שינו בטעות בתנאי בקרה ולהתפשר ניתוח כמותי נוספת. להיפך, את אותן האסטרטגיות חיוניות למחקרי התערבות עם הפוטנציאל לשבש קרומי מידות, אשר תלוי באופן קריטי על בקרות השוואה משמעותיות בין אמיתי בריא לעומת תאים חולים אמיתיים עם מידות שינויי קרום.

בנוסף, אנו פונים נהלים כדי להשיג את הבידוד מבחינה טכנית הרבה יותר מאתגר של תאי AM. למרות התקדמות ופרוטוקולים משופרים, חשוב להדגיש שזה לא טריוויאלי לשחזר בידודי תא באיכות גבוהה של מכונות וירטואליות ועוד פחות אמינה לחובבנים. זאת בשל התשואה הנמוכה הכוללת של תאי AM שבו אפילו שגיאות או שינויים קטנים בבידוד תא עלולות להוביל להשלמת כישלון של בידוד תא AM, ואילו מידה מתונה של נזק לתאי VM עלולה להיות פחות נראית לעין בהשעית תא עקב גבוה יחסית תא מספרי השוואה לAM. מאחר ותאי AM עלולים להפוך גurved לאחר בידוד, ניתוח באמצעות מספר ROIs יכול להיות יתרון כפי שתואר תחת שלב 4.3. בעקבות הליך מפורט של צעדי בידוד תא, אנו מספקים פרוטוקול מכתים ישיר נפרד קרום וconfocal או הדמיה superresolution STED של רשתות מידות הן למכונות וירטואליות וחובבנים. פרוטוקולים אלה מאפשרים גם ניתוח כמותי ובידול של רכיבים נבחרים של קרומי מידות באמצעות פרמטרים שנקבעו בעבר. בהשוואה למכונות וירטואליות, ארגון 3D והתנהגויות פונקציונליות של רשת מידות פרוזדורים באדמיניסטרטיבים כרגע פחות מובן.

הנהלים לממברנות מידות תמונה בתאים חיים (שלבים 3.1-3.7) פותחו עם confocal המסחרי (טבלה של חומרים / ציוד) ומיקרוסקופים הקרינה STED מחוייט ^9. כדי לייעל את הגדרות מיקרוסקופ לדור תמונת ניאון וניתוח מידות כמותי, את הנקודות הבאות הן בעלי חשיבות כללית:

• מטרה
  על מנת לפתור את הפרטים קטנים של מבני קרום מידות, באופן אמפירי לבדוק בו מטרה מספקת את איכות התמונה הגבוהה ביותר, תוך התמקדות כמה מיקרומטר עמוק בתא. מיקרוסקופי confocal מסוימים עשויים לתפקד טובים יותר עם מטרות מים או גליצרול, בניגוד למטרת נפט NA 63X 1.4 משמשת כאן. יעדים עם ההגדלה 100x משמשים למיקרוסקופיה STED superresolution, נסחר מעל שדה קטן יותר של תצוגה עבור רזולוציה ננומטריים ^34.
• עירור ורווח
  ההגדרות אופטימליות של כוח העירור ורווח גלאי תלוי בדרך מיקרוסקופ האור, ביצועי לייזר, ומאפייני מדגם. באופן אידיאלי, כוח הלייזר ורווח מותאמים לנצל את הטווח המלא של הגלאי, עדיין למנוע הרוויה תמונה. חבילות תוכנת מיקרוסקופיה מסחריות בדרך כלל מספקות שולחנות בדיקה שלדמיין את הגבול התחתון והעליון של הטווח הדינמי. יתר על כן, על מנת למזער הלבנת צבע להעסיק l הנמוך ביותר האפשריכוח aser שעדיין מספק פרטי קרום מידות מבניים מספיק. כמו כן, כוח העירור צריך להיות נמוך מספיק כדי למנוע נזק מצטבר תמונה מובילה לcontractures myocyte ומוות.
• גודל פיקסל
  השתמש בגודל פיקסל תואם דגימת נייקוויסט, כמחצית מהרזולוציה שהושגה עם ההגדרות שניתנו. ההדמיה confocal גודל פיקסל של 100 ננומטר x 100 ננומטר הוא תואם, אשר יהיו גם להגביל את ההלבנה. למיקרוסקופיה superresolution גדלי פיקסל קטנים יותר באופן משמעותי נמצאים בשימוש לדוגמא, 20 ננומטר x 20 ננומטר לSTED מיקרוסקופיה ^9.
• Dwell זמן
  מיקרוסקופי confocal לספק פונקצית מיצוע. באופן כללי, שימוש בזמן להתעכב פיקסל הקצר ביותר האפשרי, כדי למנוע הלבנה בשילוב עם למשל מיצוע אות, ≥ 8 כדי לשפר את רעש יחס אות לממוצע אונליין.
• לתעד את הגדרות מיקרוסקופית מיושם באמצעות Meta-data
  ברגע שההגדרות איךפרטי תמונה של מבני קרום מידות היו מותאמים במיקרוסקופ confocal מסוים, בטוחים ו / או לתעד את ההגדרות (meta-data פרוטוקול). לרכוש את כל התמונות בתוך קבוצה (או בין) (ים) של תאים עם אותה המטרה, כוח העירור, רווח, גודל פיקסל, פיקסל להתעכב זמן, ותפקוד בממוצע. תנאי הדמיה שווים לאפשר השוואה ישירה ולכמת בתוך קבוצה (או בין) (ים) של תאים.
• להנחיות כלליות ופרטים נוספים על עקרונות ויישומים של מיקרוסקופיה confocal מתייחס לHandbook of Biological Confocal מיקרוסקופית (פולי JB, מהדורת 3 ^rd, 2006 פרינגר מדעי + עסקי מדיה, LLC).

בניגוד לאסטרטגיות הישירות הניתוח שהוצגו כאן, הפרסומים קודמים המתארים את קרומי מידות ושינויי מחלה קשורה, השתמש קריאות כוללת אזוריות של צפיפות T-אבובית כאסטרטגיה כמותית ^16,17, או אסטרטגיות אזוריות עקיפות המבוססת על transf פורייהניתוח ormation של אותות קרום מפוספסים על מנת להעריך סדירות מרכיב T-אבובית ^7. בניגוד לכך, גישות כמותיות שתוארו כאן קשורות ישירות לרכיבי מידות אישיים ולספק מספר פרמטרים נוספים הכוללים מאפייני רשת קרום ורכיבים ספציפיים כמו אחוז-tubules. יתר על כן, צפיפות רשת מידות ניתן לכמת כאורך המנורמל של השלד שחולץ כל לאזור החזר על השקעה. מספר צמתים משולשים של שלוש בודד, ניתן להשתמש ברכיבי אבובית מחוברים באופן רציף כמדד למורכבות ההסתעפות של רשת קרום המידות. נציין, כי כל ניתוח של רכיבי מידות הקטנים ביותר תלוי בנהלים מכתים. מניסיוננו, 800 μl של פתרון di-8-ANEPPS 50 מיקרומטר יש בם כדי להכתים רשתות מידות מלאה בתא גלולה המכילים 50,000 תאי VM ^9. עם זאת, אם התא גלולה מכיל מספר נמוך יותר של myocytes לב, אם גלאי הקרינה רבי עוצמה זמינים, ואם ההדמיה confocal של ההפצה ברשת מידות הכללית ולא פרטי הקרום הקטנים ביותר ושינויים הכמותיים הם עניין, ריכוזי צבע נמוכים יותר ניתן להשתמש על בסיס בדיקות אמפיריות. לבסוף, תוכנת מקרו שנכתב לניתוח שתואר יכול לשמש כדי להפוך את צעדי עיבוד תמונה כדי להקל על ניתוח של מערכי נתונים גדולים יותר, שהוא שימושי במיוחד להשוואה בין קבוצות שונות טיפול (למשל, תרופות), סוגי תאים (לדוגמא, הנני מול VM ), והתערבויות pathophysiological (למשל, העמדת פנים מול אוטם שריר לב).

לניתוח תמונה של רשתות מידות, הרצף של צעדים עיקריים הבא מוחל: 1) כדור מתגלגל רקע חיסור (4.5.1) כדי להסיר וריאציות מרחבית בעוצמת רקע; 2) שיפור לעומת מקומי (4.5.2).; 3) החלקת תמונה (4.5.3); 4) התמזגות האזור סטטיסטי (4.5.4); 5) המגדיר אתסף של binarization תמונה (4.5.6); ו6) חישוב נתוני השלד (4.5.8). צעד קריטי במהלך skeletonization של תמונות מידות ניאון הוא binarization התמונה שמוצגת באיור 6. צעדי thresholding הקשורים סופו של דבר להגדיר אילו מבני קרום אמיתיים מתגלים לייצג את רכיבי מידות הבסיסיים לעומת מבנים שעלולים להיות כוזבים זוהו על ידי שגיאה מרעשי רקע. זיהוי של הסף הנכון לניתוח תמונה בינארי צריך להתכתב עם המידות האמיתיות מבני קרום, אשר תלוי ביחס גבוה מספיק אות לרעש (SNR) עבור כל גישות מיקרוסקופיה confocal וsuperresolution. לכן, איכות תמונה מספקת צריכה להיות ראשונה שהוקמה בשילוב לאחר מכן עם שיפוט ביקורתי של איכות תא בודדת כולל תיעוד על ידי תמונות שדה בהירות כפי שתואר. אפשרויות חלופיות להתאמת פרוטוקול פילוח תמונה עבור פלט נתון מיקרוסקופ נתונים ו / או Physשאלות iological כוללות deconvolution תמונה ונהלי thresholding אחרים כמו "אוטסו" או "Iso-נתונים" זמין כתוספי ImageJ. בלי קשר להליך הפילוח הסופי, אנו רואים את ההשוואה בין הנתונים שחולצו וגלם על ידי שכבת תמונת צעד בקרת איכות חובה. לסיכום, יושרה מורפולוגיים וקרום של myocytes המבודד הבודד, מכתים מספק של קרומי מידות תאיים, אופטימיזציה פרמטר עבור דימות פלואורסצנטי, ושליטה כיסוי של נתוני שלד חילוץ תהיה כולם תורמות לאיכות תמונות מידות ניאון ותוצאות כמותיות.

אם מינים גדולים יותר מעכבר המשמשים לבידוד תא, הפרוטוקולים ניתן להתאים בקלות על פי צורך. עבור המינים הגדולים הבאים, ניתן cannulated לב חולדה עם צינורית בוטה 14 G (קוטר חיצוני 2.1 מ"מ) וperfused ב8 מ"ל / דקה. באופן משמעותי את לב מבוגר או חולה עשוי לדרוש גדלי צינורית גדולים עוד יותר. בגןRAL, זלוף לב יכול להתבצע גם על ידי דוגמא לחץ קבועה, תוך שימוש בעמודת מים גבוהים מ 1 בין מאגר ואב עורקים או על ידי זרם בלתי פוסק באמצעות משאבת peristaltic. בידוד תא מלב מכרסם קטן כמו עכברים וחולדות זרם בלתי פוסק עשוי להיות יתרון מאז עיכול collagenase סופו של דבר לשבש כלי התנגדות כליליים מובילים לשיעורי זלוף מוגזמים מהמיטות כלי דולפות שיהיה בשליטה במידה מסוימת על ידי זרימת פרוטוקולים קבועים. בניגוד לכך, זלוף לחץ הקבוע הוא יתרון אם ניטור של קצב הזרימה וcannulation הנכון הוא בראש סדר עדיפויות, וזה יתרון עבור דגמי התערבות עם התנהגויות התנגדות כלי דם שינה כמו גם להכשרה של נהלי בידוד תא.

כפי שתואר לעיל, איכות תא מספיקה היא מאוד חשובה עבור מחקרים כמותיים של מערכות קרום אנדוגני. עם זאת, במהלך עיכול זלוף וcollagenase לב גורמים רבים יכולים CRitically להשפיע על איכות בידוד התא, שאף פעם לא צריך לזלזל באופטימיזציה פרוטוקול או פתרון בעיות ^27. בפרט, הפעילות של הרבה collagenase נתון יש לקבוע עבור הרקמות הספציפיות של עניין למשל, אטריה או חדרי לב לפני ביצוע המחקרים בתום לב הניסיוני לשם קביעת תנאי בידוד להישמר בכל שאר המחקר. יתר על כן, איכות מים, רמת חומציות, טמפרטורה, אופטימיזציה והניקוי של תוכנית ההתקנה של זלוף תהיה למזער את הסיכון לניזק שלא במתכוון ממזהמים ותסחיפים, וגורמים פוטנציאליים נוספים צריכים להיות במעקב לשם קביעת תנאים ההומיאוסטטית אופטימליים במהלך בידוד תא. BDM (2,3-butanedione-monoxime) מעכב הפיך של גשרים צולבים ATPase שרירן משמש בדרך כלל במהלך נתיחה ועיכול רקמה כדי לקיים הרפיה שריר לב, דבר המגדילה את התשואה של בידודי תא. עם זאת, חוקרים צריכים t o להיות מודע לכך שBDM יכול להפעיל פעילויות phosphatase שאינם ספציפיות שמובילות להשפעות מחוץ היעד למשל, עיכוב של זרמי ^{2 +} חילופי Na ⁺ / Ca בתנאים מסוימים ^33. עבור חלק מניסויים שזה עשוי להיות יתרון להחליף BDM ידי blebbistatin כפתרון cardioplegic, מעכב עם זיקה חזקה לשרירן בריכוזים מייקרו שהוא, לעומת זאת, רעיל ויקר יחסית ועשוי להיות השפעות מחוץ יעד אחרות. שריר לב בריא נח לא צריך להראות התכווצויות כל בהעדר גירוי החשמלי ותאים מסוג זה צריך להיות מחוץ ניתוח נוסף. מצד השני, התכווצות לב myocyte ורגיעה בתגובה לגירוי חשמלי בCa ^{2 +} ריכוזים תאיים פיסיולוגיים יכול לשמש כדי להקים נורמלי התנהגות התכווצות כאמצעי נוסף להערכת איכות פונקציונלית תא ו / או התנהגות חריגה במחלת לב לעומת שליטה בריאה תאים.

"Jove_content"> לסיכום, הפרוטוקולים לבידוד תא בודד וניתוח תמונת כמותית המתואר כאן יושמו בהצלחה למיקרוסקופיה confocal וsuperresolution של רשת קרום המידות ^ב9 VM והנני תאי ²¹ כמו גם לניתוח כמותי של רשתות microtubule ב myocytes קבוע לב (מידע לא מוצג). של פרוטוקולי יישומים אלה ובעתיד עשוי לפתוח כיווני מחקר עבור מגוון רחב של שאלות ניסיוניות כגון האפיון של ממברנות מידות בשלבי התפתחותיים שונים או הניתוח של מבנים חלבוניים או אברון קרום קשור שקשר עם רשת המידות להפעיל מקומיים, איתות תחום מאוד ספציפי פונקציות בתאים בבוקר וVM.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כימיקלים ואנזימים
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich, מינכן, גרמניה	B0753
סרום עגל בקר	Thermo Scientific, Schwerte, גרמניה	SH30073	Triple 0.1 µ M סטרילי מסונן.
CaCl2	Sigma-Aldrich, מינכן, גרמניה	21115	מדולל 1:10 במי MQ כדי להשיג ריכוז של 100 מ"מ CaCl2 מלאי.
קולגנאז מסוג II	וורת'ינגטון באמצעות Cell Systems, Troisdorf, גרמניה	על פי בקשה	פעילות אנזימטית תלויה באצוות קולגנאז בודדות. ניתן להעריך קולגנאז II ופעילויות אנזימים אחרות (קזנאז, קלוסטרפיין, טריפטיק) ב"כלי בחירת מנות הקולגנאז". קבעו את תפוקת התאים ואיכותם בנפרד עבור כל אצווה חדשה של קולגנאז.
גלוקוז	קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה	HN06.1
Heparin	Rotexmedica, Trittau, גרמניה	PZN-03862340	מדולל ב-0.9% NaCl ומוזרק תת-עורית בעור הבטן.
HEPES	Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה	9105.4
Forene 100% (V/V)	Abbott, Libertyville, IL, ארה"ב	B506	חומר פעיל: איזופלורן, 250 מ"ל. השתמש בכ-2 Vol% במכשיר מתקן אוויר/חמצן.
KCl	Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה	6781.3
KH2PO4	Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה	3904.2
למינין (2 מ"ג/מ"ל)	BD Biosciences, היידלברג, גרמניה	354232	למינציה מתוארת בשלב 2.1.
MgCl2· 6H2O	Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה	2189.2
MgSO4· 7H2O	Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה	8283.2
Na2HPO4· 2H2O	Carl Roth, קרלסרוה, גרמניה	4984.2
NaHCO3	Carl Roth, קרלסרוה, גרמניה	HN01.1
Taurin	Carl Roth, קרלסרוה, גרמניה	4721.2
Dyes
Di-8-ANEPPS	בדיקות מולקולריות, Life Technologies, דרמשטדט, גרמניה	D-3167	תמיסת מלאי 2 מ"מ ב-DMSO
Trypan blue	Sigma-Aldrich, מינכן, גרמניה	T8154	כחול טריפן מעורבב בעדינות 1:1 באמצעות פיפטת פלסטיק 1 מ"ל חתוכה בקצה עם תרחיף תאים לפני ספירת התאים בציטומטר נויבאואר.
Langendorff Perfusion Setup
Circulation thermostat	Lauda, Lauda-Kö nigshofen, גרמניה		נא לעיין ב-Louch et al. (JMCC 2011). לחמם תרמוסטט ומאגרים בצינורות זלוף ל-37 מעלות; C 15 דקות לפני השימוש.
צינורות סיליקון גמישים Tygon למשאבה פריסטלטית	VWR, דרמשטדט, גרמניה	224-2252	יש להחליף צינורות באופן קבוע.
צינורות סיליקון גמישים Tygon לתרמוסטט	VWR, דרמשטדט, גרמניה	228-4340
סליל חימום סביב צינורות זלוף	Rettberg, Gö ttingen, גרמניה	בהתאמה אישית	יש לנקות היטב באמצעות מי MQ לאחר השימוש. אין להשתמש בחומרי ניקוי. יש לרחוץ רכיבי זכוכית באופן קבוע  ב-10 מ"מ NaOH בן לילה.
משאבה פריסטלטית	Ismatec, ורטהיים, גרמניה	ISM830
זין עצירה תלת כיווני דיסקופיקס C Luer Lock 10 ס"מ	בראון, מלסונגן, שוויץ	16500C
זין עצירה תלת כיווני דיסקופיקס 3SC	בראון, מלסנגן, שוויץ	4095146
<חזק>מכשירים
>42 מ"מ כיסויי	זכוכיתMenzel Glä ser via Thermo Scientific, Schwerte, גרמניה	על פי בקשה	בעובי 0.13-0.16 מ"מ
צינורית 21 G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA	304432	חתוך לאורך של ~5 מ"מ, מחוספס בנייר זכוכית.
כיסויים לציטומטר נויבאואר 24 x 24 מ"מ	Menzel Glä ser via Thermo Scientific, Schwerte, גרמניה	על פי בקשה	0.38-0.42 מ"מ עובי
מלקחיים Graefe, 0.5 מ"מ קצות, עקומה קלה	Fine Science Tools, היידלברג, גרמניה	11151-10
LSM 710 NLO	Carl Zeiss, Jena, Germany		63X 1.4 NA מטרת שמן
נויבאואר ציטומטר משופר	Labor Optik, פרידריכסדורף, גרמניה	1100000	נוהל ספירה: נגב את הציטומטר ואת הכיסוי המסופקים עם תא הספירה עם 70% אתנול. לחץ על הכיסוהחלקה בעדינות על תא הספירה כך ששני משטחי הזכוכית יהיו במגע וניתן יהיה לצפות בטבעות של ניוטון. לאחר מכן, 10-20 ומיקרו; ניתן ליישם את מתלה התאים L על קצה הכיסוי כדי להישאב לתוך הריק על ידי פעולה נימית. ספרו את המיוציטים השלמים לעומת הפגמים באמצעות הריבועים של רשת הציטומטר המשקפת 100 nl. חזור על הליך הספירה ברשת השנייה המסופקת בציטומטר. חשב את צפיפות התאים בתרחיף התא המקורי שלך על ידי התחשבות בדילולים וספירת קיצורי דרך.
תא הדמיה POC-R2	פקון, ארבך, גרמניה		נפח תרחיף תאים: 800 ומיקרו; l; צפיפות ציפוי רצויה: ~1,000 AM ו- ~10,000
מספריים קפיציים VM, להבים 8 מ"מ ישרים,	כלים מדעיים קהים, היידלברג, גרמניה	15025-10
מלקחיים סטודנטים dumont #7,	כלי מדע עדין inox, היידלברג, גרמניה	91197-00
מספריים לקשתית הסטודנטים, מעוקלים, 11.5 ס"מ	כלי מדע עדין, היידלברג, גרמניה	91461-11
מספריים לקשתית הסטודנטים, ישר, 11.5 ס"מ	Fine Science Tools, היידלברג, גרמניה	91460-11
מספריים סוריגליים לסטודנטים, ישרים, חדים, 12 ס"מ	Fine Science Tools, היידלברג, גרמניה	91402-12
מלקחיים לרקמות, 1 x 2 שיניים, דקים, 10 ס"מ	Fine Science Tools, היידלברג, גרמניה	11023-10

סליל חימום וצינורות