מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

סיכום

סידן הוא מעורב במסלולי איתות פיסיולוגיים וpathophysiological רבות. הדמיה תא חי דורשת ציוד מיוחד ויכולה להיות זמן רב. שיטה מהירה, פשוטה באמצעות cytometer זרימה לקבוע שינויים יחסי בסידן cytosolic בתאי האפיתל חסיד הביאו להשעיה הייתה מותאמת.

תקציר

מגוון תהליכים תאיים, פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים כאחד, דורשים או נשלטים על ידי סידן, כולל אקסוציטוזיס, תפקוד מיטוכונדריאלי, מוות תאי, מטבוליזם של תאים ונדידת תאים. סידן ציטוזולי נשמר בדרך כלל בריכוזים ננו-מולאריים נמוכים; במקום זאת, הוא נמצא בריכוזים גבוהים של מיקרו-מולרית עד מילי-מולרית ברטיקולום האנדופלזמי, במטריצה המיטוכונדריאלית ובתא החוץ-תאי. עם הגירוי, עלייה חולפת בסידן ציטוזולי משמשת לאותת על אירועים במורד הזרם. איתור שינויים בסידן ציטוזולי מבוצע בדרך כלל באמצעות הדמיית תאים חיים המוגדרת עם צבעים קושרי סידן המציגים עלייה בעוצמת הקרינה או שינוי באורך גל הפליטה בעת קשירת סידן. עם זאת, מערך הדמיה של תאים חיים אינו נגיש באופן חופשי לכל החוקרים. שיטות זיהוי חלופיות עברו אופטימיזציה לתאים אימונולוגיים עם ציטומטריית זרימה ולתאים דבקים לא אימונולוגיים עם קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות. כאן, אנו מתארים שיטה אופטימלית ופשוטה לאיתור שינויים בתאי אפיתל עם ציטומטריית זרימה באמצעות צבע קושר סידן באורך גל יחיד. תאי אפיתל צינורית פרוקסימליים כלייתיים דביקים, שבדרך כלל קשה להעמיס אותם בצבעים, הועמסו בצבע קושר סידן חדיר לתאים פלואורסצנטיים בנוכחות פרובנציד, הובאו לתרחיף ואותות סידן נוטרו לפני ואחרי הוספה של תפסיגרגין, טוניקמיצין ויונומיצין.

מבוא

סידן הוא שליח שני חשוב אחראי להעברת פיזיולוגית סלולריים ואותות pathophysiological ^1. ריכוז יוני הסידן Cytosolic נשמרים נמוך באמצעות הפעילות של משאבות סידן ומחליפי סידן. ATPase סידן הרשתית / endoplasmic sarcoplasmic (SERCA) ממלא reticulum endoplasmic (ER) חנות סידן כחלק ממערכת "דליפת משאבה", ואילו ATPase סידן קרום פלזמה (PMCA) extrudes סידן לתא תאי, הן בנימוסים תלוי ATP ^2. שליחים פיסיולוגיים, כמו הורמונים או נוירוטרנסמיטרים, לשדר אותותיהם באמצעות קולטנים G- חלבון בשילוב, הפעלה של C פוספוליפאז, שhydrolyses phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) בקרום הפלזמה לייצר אדנוזין diacylglycerol ואינוסיטול (IP3) ^3. בעוד diacylglycerol נשאר בקרום הפלזמה, IP3 מתמוסס לתוך cytosol ונקשר לקולטן ה- IP3s (IP3Rs), אשר יגנד מופעלות ערוצי סידן, שנמצאה בקרום ER וסידן משתחררת מחנות luminal ER הגיעה לשיאה בעלייה בריכוז יוני הסידן cytosolic ^4. תוואי חלופי לסידן כדי להגיע לcytosol הוא בערוצי סידן ומחליפים קיימים בקרום הפלזמה. Crosstalk בין שני תאים אלו תוארו: שחרור סידן נגרם סידן (CICR) שבו סידן תאי גורם לשחרור סידן מחנויות ER ^5, וחנות המופעלים על כניסת סידן (SOCE) שבו מתרוקן מחנויות ER נקלטת על ידי STIM וגורם לפתיחה של Orai ערוצי סידן בקרום הפלזמה לקדם מילוי חוזר של חנויות ER ^6.

בתנאי pathophysiological, תגובת סידן התאית היא עליות סידן וחוסר פיקוח ממשלתיות וcytosolic בהעדר הגירוי פיסיולוגי ^1. תגובת סידן עלולה להיות מושפעת במספר הדרכים: ממושך בסידןאות, התעכב פינוי סידן מcytosol, דלדול של חנויות סידן או שינויים מקומיים בסידן. יתר על כן, המיטוכונדריה לקחת על עצמו תפקיד מרכזי בחציצה ושחרור סידן ^7. מתמשך ו / או עליית סידן cytosolic supramaximal מובילה למוות של תאים. למעשה, סידן הוא לעתים קרובות יותר מאשר לא מעורב בתגובת pathophysiological הסלולרית והוא אירוע מרכזי במגוון רחב של מחלות, כגון מחלת ניוון עצבי, מחלות לב, סרטן, מחלות עצם ומחלת כליות, אשר קשור בעיקר עם מוות של תאים ואובדן או שינוי של איבר או רקמת הפונקציה ^8-10. יתר על כן, ההפרעות של אותות סידן נקשרה להסתגלות ושינויים בפונקציות ותגובות תאיות סלולריים.

באופן מסורתי, אותות סידן נמדדים עם מחוון סידן ניאון טעון שלילי שהוא נטען לתוך תאים בצורת acetoxymethyl החדיר תא (AM) אסתר. ביקע פעם אחת על ידי esteras הסלולריes, אינדיקטורים הניאון להישאר בתוך התא תאיים ועלייה בעוצמת הקרינה כאשר סידן הוא מחויב. מחוון סידן הידוע ביותר ומשמש הוא הפורע-2 ratiometric שפותח על ידי רוג'ר Tsien ועמיתים ^11. מדדי סידן עם זיקות שונות מן לסידן לאפשר בריכות סידן שונות כדי להיות במעקב. שיטות זיהוי כוללות הדמיה תא חי, קורא microplate הקרינה וcytometry זרימה. קינטיקה מהירה יחסית של אותות סידן (בדרך כלל תוך מספר שניות עד דקות), הופכת את התא חי הדמיה השיטה הטובה ביותר להשגת רוב המידע על מאפיינים של אות סידן. מלבד קינטיקה מהירה של אותות סידן (באלפיות שני), הדמיה תא חי היא שיטה טובה יותר ללימודי מידור סלולארי של איתות סידן בתוך תא בודד ^12. ניתן לחשב ריכוז יוני הסידן המוחלט על ידי קביעת הקרינה המינימלית ומקסימלי של ind סידןicator על ידי הוספת chelator סידן וpermeabilizing התאים, בהתאמה, כפי שתואר על ידי et al Grynkiewicz. ^11.

השימוש בזרימת cytometry למדוד אותות סידן פותחה לראשונה בשנת 1980 בתאים חיסוניים שבו את ההזדמנות כדי למדוד פרמטרים מרובים, כגון שלמות קרום והפרדה של אוכלוסיית תאים, ואת הדרישה של תאים בתרחיף בשילוב עם הפיתוח של אורך גל יחיד מדדי סידן עשויות cytometry זרימת שיטה אידיאלית וconvenientdetection ^13-15. בתאים חסיד, הדמיה תא חי מספקת את רוב המידע על איתות סידן, הכי חשוב קינטיקה, אבל דורשת התקנה מסובכת הכוללת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מערכת זלוף, תחזוקה של הסביבה התאית, כגון טמפרטורה, ותוכנת מיקרוסקופ מיוחדת לרכישה וניתוח נתונים. שיטות חלופיות כגון קורא microplate הקרינה או Pharmacolאמצעי ogical באמצעות שימוש בchelators סידן הוא שאין במונחים של מידע שנצבר. Cytometry זרימה הופכת שימוש נרחב יותר כדי לפקח על סידן cytosolic בתאים חסיד אם כי, ברוב המכריע של מחקרים, נקודת סיום מדידות מתבצעות רק. תוך שימוש בשיטה פותחה בתחילה על ידי אל גרגלי ואח. בתאי B של מערכת חיסון ^16, שינויים בריכוז סידן חופשי cytosolic ידי cytometry זרימה עם קינטיקה בזמן אמת וניטור עוצמת הקרינה בתאים בודדים מאוכלוסיית מדגם נמדדו בהצלחה בתאי האפיתל סרטן ותא גזע סרטני כלאי ^17. שיטה זו הותאמה נוספת לשימוש בתאי אפיתל חסיד, שקשה לטעון עם אינדיקטורים סידן ^18.

כאן, באמצעות שורת תאי אפיתל הונצחה חסיד נגזרת ממגזר S1 של אבובית הפרוקסימלי כליות חולדה (WKPT-0293 Cl.2) ^19, אנו מתארים מותאם מ 'פשוטיםethod למדידת שינויים בריכוז סידן cytosolic ידי cytometry זרימה. מאחר ורבים מתאים אפיתל בעלי מספר המובילים האורגניים לתרכובות אניוני, טעינה של תאים עם מחוון סידן יכולה להוכיח להיות אתגר. כדי למנוע הזרימה של אינדיקטורים סידן, probenecid, המעכב הטיפוסי של מובילי אניון אורגניים ופותח במקור כדי להקטין את הפרשת כליות של פניצילין ^20, מיושם בו זמנית במדיום הדגירה. התאים נשמרים בmonolayers לטעינת מחוון סידן, הביאו לאותות השעיה וסידן יכולים להתגלות מייד לאחר בנוסף מתחם.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

1. הכן הפתרון של האנק שונה המאוזן מלח (HBSS) (מ"מ: 136.9 NaCl, KCl 5.37, 0.34 Na _{2 4} HPO, 0.44 KH ₂ PO _4, 4.17 NaHCO _3, pH 7.2, לא פנול אדום). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
2. הפוך 1.5 M CaCl ₂ ו ₂ M 4 חומצה (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7.2) פתרונות מניות באמצעות מים מזוקקים.
3. הכן פתרון 250 מניות מ"מ של probenecid. לצורת החומצה החופשית (המכונה לעתים קרובות במים מסיסים), לפזר אבקת probenecid ב 1 N NaOH, למלא עד שלושה רבעים מהנפח הסופי עם מים מזוקקים ולכייל לאט pH 7.4 עם 1 N HCl. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
4. לפזר צבע קרום ניאון סידן חדיר מחייב בsulfoxide דימתיל נטול מים (DMSO) לריכוז מניות של 1 מ"מ. חנות ב -20 ° C בחושך.
5. לפני כל ניסוי, טרי להכין H המכיל probenecidBSS שטף חיץ (PHF) על ידי שילוב של שינוי HBSS עם (בריכוזים סופיים) 1.5 מ"מ CaCl _2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.2, 5% בסרום שור עוברי, 2 probenecid מ"מ, ו5.55 גלוקוז מ"מ. חם 37 מעלות צלזיוס.

תרבות 2. תא

1. תאי צלחת 2.5 x 10 ⁵ כליות הפרוקסימלי אבובית (WKPT-0293 Cl.2) לכל טוב של צלחת 6 צלחת גם או 35 מ"מ במדיום התרבות הסטנדרטי ולגדול במשך 2 ימים להגיע confluency של כ -70%.

טעינת צבע 3. סיד

1. לכל מנה טובה או, לערבב מדיום תרבות מיליליטר 1 המכיל 5% בסרום שור עוברי, צבע סיד חדיר 4 תאי מיקרומטר מחייב ו -2 probenecid מ"מ.
2. החלף את התרבות בינונית עם תערובת צבע טעינת 1 מיליליטר בכל טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחממה humidified עם 5% CO _2. מכסה את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה של מחוון הניאון.

4. הכנת CeLLS לcytometry הזרימה

1. פתרון חומצת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic 0.05% חמים (EDTA) עד 37 מעלות צלזיוס.
2. פתרון טעינת צבע סידן לשאוב מכל טוב ולהוסיף טריפסין 1 מיליליטר לאורך הקיר גם.
3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד שכל התאים מנותקים.
4. העברת תאי צינור 1.5 מיליליטר וכדור על ידי צנטריפוגה בmicrocentrifuge ב 10,000 גרם במשך דקות 1.
5. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
6. שטוף תאים על ידי הוספת חיץ PHF 1 מ"ל וגלול על ידי pipetting למעלה ולמטה.
7. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 10,000 גרם במשך דקות 1.
8. חזור על שלבים 4.6. ו4.7. עוד שתי פעמים.
9. Resuspend תאים בנפח סופי של 500 חיץ PHF μl ולהשתמש בתאים לניסויים בשעה 1.
10. אופציונליים: תאי ספירה כדי לקבוע את ריכוז התא ולהשתמש 5 x ^04-01 אוקטובר x 10 ⁵ תאים לכל מדידה.

5. הזרימה CYTהתקנת ometer

1. התחל cytometer הזרימה, לפתוח את מגירת fluidics ולוחץ על מתג דו-מצבי שסתום האוורור כדי להגדיל את לחץ האוויר של מיכל נדן הנוזל.
2. "ראש" המכשיר כדי להסיר בועות אוויר המתגורר פוטנציאליות מתוך הצינורות הפנימיים ותא הזרימה.
3. בתוכנת cytometry זרימה, שני חלונות עלילת נקודה פתוחים.
   1. עלילת הנקודה הראשונה דורשת קדימה אור מפוזר (FSC) עבור פרמטר X ואור בצד מפוזר (SSC) לפרמטר Y כדי לשלוט על האיכות של התאים בתוך המדגם באמצעות גודלם והגרעיניות שלהם, בהתאמה.
   2. עלילת הנקודה השנייה מודדת את עוצמת הקרינה של הצבע-קשור סידן. בחר את ערוץ גילוי הקרינה המתאים לפרמטר Y באמצעות סולם וזמן לוגריתמים בשניות עבור פרמטר X בקנה מידה ליניארי.
4. הגדר את קצב הזרימה ל" גבוה ".

6. cytometry הזרימה Measurement

1. לבצע את המדידות בRT. בcytometry זרימת צינור דגימה (11.5 x 75 מ"מ), להוסיף למאגר PHF 480 μl.
2. הוסף השעיה תא 20 μl בקצרה מערבולת לערבב.
3. הזז את זרוע תמיכת צינור בצד ולמקם את צינור הדגימה מעל צינור הזרקת מדגם עד חותם חזק נוצר. החזר את זרוע תמיכת צינור לעמדה המקורית שלו במרכז.
4. לייעל מדידה על ידי התאמת ערוץ הקרינה כזו שעוצמת הקרינה הממוצעת של המדגם היא בכ -10 ² על ציר y. לשמור ולהשתמש בניסויים הבאים.
5. כדי להתחיל ניסוי, חזור על שלבים 6.1-6.3.
6. הקרינה בסיס שיא 50 שניות.
7. השהה מדידה, להסיר את צינור המדגם, להוסיף מתחם של עניין, בקצרה מערבולת ולחזור לצינור הזרקת מדגם. צעד זה לא אמור לקחת יותר מ -15 שניות.
8. קורות חיים מדידה ולהמשיך לסך כולל של 204.8 שניות.
9. השתמש i סידןonophore, כגון ionomycin (10 מיקרומטר), וchelator סידן, כגון חומצת tetraacetic אתילן גליקול (EGTA), MnCl ₂ או CoCl ₂ (2 מ"מ), לבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה.

ניתוח 7. נתונים

1. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת cytometry הזרימה ייעודית לניתוח לא מקוון, כגון WinMDI (ממשק המסמך מרובה של Windows עבור cytometry הזרימה), חבילת תוכנה חופשית שפותחה על ידי ג 'טרוטר בסקריפס המכון, מתקן cytometry הזרימה Core.
2. פתח עלילת נקודה עם פרמטרים SSC וFSC.
3. בחר את האזור של תאים לניתוח שימוש באפשרות "האזורים" (לחץ לחיצה ימנית על התמונה) שלא לכלול תאים מתים או פסולת תא שנמצאה בפינה השמאלית התחתונה מניתוח נתונים (איור 1).
4. ניתוח Quadrant (איור 2)
   1. פתח עלילת צפיפות עם זמן על ציר X ועוצמת הקרינה על ציר y. להשתמש בכל האירועים.
   2. שלנודואר באותו האזור gating כמו ב7.3.
   3. לכמת את הנתונים על-ידי שימוש באפשרות "Quadrant".
   4. התאם את המפרידים הרבע כך הקו האנכי ממוקם בזמן בנוסף מתחם והקו האופקי ממוקם במרכזה של הקרינה הבסיסית בבקרה. ודא שהמיקום של מפרידי רבע שווה בכל הדגימות.
   5. אחוז התאים בכל רבע מוצג בכל פינה (איור 2). להשוות ברבע הימני העליון (UR) בין דגימות.
5. ניתוח היסטוגרמה (איור 3)
   1. פתח את נתוני בקרה בחלון היסטוגרמה עם עוצמת הקרינה על ציר ה- x ואירועים על ציר y. להשתמש בכל האירועים.
   2. לסקירה ציורית, להוסיף את נתוני הבדיקה להשוואה לעלילת השליטה כחלקות כיסוי (ללכת קובץ → פתח קובץ → כיסוי → בחר קובץ).
   3. ניתוח כמותי, היסטוגרמה אחת לנצחיש להשתמש Dows. שער אוכלוסיית התא באמצעות אזור R1 מצעד 7.3.
   4. בשליטה שאינו מטופלים, להשתמש בפונקציית הסמן ("מרקרים") כדי לסמן את האזור לניתוח מתחיל מנקודת האמצע בין המינימום והקרינה המרבית של שיא השליטה ומסתיים בעוצמת הקרינה המרבית. אחוז התאים באזור זה מחושב.
   5. אחזור נתונים מחלון הסטטיסטיקה. חזור לנותר קבצי נתונים תוך שימוש באותו האזור המסומן לניתוח.
6. ניתוח עוצמת הקרינה (איור 4)
   1. פתח עלילת נקודה עם זמן על ציר X ועוצמת הקרינה על ציר y. להשתמש בכל האירועים.
   2. אפשר "קינטיקס Mode" ו- "Overlay קינטיקס קו". קו כחול יופיע בעלילת הנקודה המייצגת את עוצמת הקרינה הממוצעת.
   3. לכמת את זרימת סידן היחסית על ידי יצירת אזורים מלבניים מרובים. כל אזור צריך להיות awidth של כ "50", שהוא שווה ערך ל "10 שניות". להגדיר עד 15 אזורים מלבניים.
   4. אחזר כימות מחלון הסטטיסטיקה ולהעתיק לגיליון אלקטרוני.
   5. השתמש בנתוני y-ממוצע לניתוח. לחשב את הממוצע של R2 לR6, שהוא שווה ערך ל20-50 שניות. זהו הערך הבסיסי.
   6. בחר מרווח זמן מתאים לניתוח זרימת סידן (תלוי בהופעה, משך ועוצמה).
   7. לחשב את אותות סידן מכל אזור בתוך מרווח זמן יחסי זה לערך הבסיס הממוצע, כלומר, אות הקרינה לפני בנוסף מתחם, אשר נקבע על 100%. לקבוע את התוחלת וסטיית תקן של האזורים לפרסם בנוסף מתחם; זה אות סידן הממוצעת שמעוררת את המתחם.

תוצאות

כדי להגדיל סידן cytosolic, שתי תרכובות תרופתיות יושמו תאי כליות הפרוקסימלי אבובית (WKPT-0293 Cl.2) עמוסים צבע סיד חדיר תא מחייב, Fluo-3-AM. דגימות בקרת Nontreated הועמסו עם צבע מחייב סידן בנוכחות probenecid והיו מעורבות אך ללא תוספת של כל תרכובות. Thapsigargin (TG) הוא מעכב קלאסי של משאבת SERCA המובילה לזליגה החוצה של חדר המיון, וכתוצאה מכך סידן cytosolic מוגבר. בלוקים Tunicamycin (TUN) N-glycosylation של חלבונים מובילים להפעלה של תגובת החלבון המקופלת אלא גם מגביר סידן cytosolic <...

דיון

סידן הוא אירוע מרכזי בתהליכים תאיים רבים מתנהגים כמו מולקולת איתות השליח שנייה וגם כאמצעי לתקשורת בין ER ומיטוכונדריה. היכולת למדוד שינויים בריכוזי סידן cytosolic חופשיים היא טכניקה שימושית שיכול לחול על כל תחומי ביולוגיה של תא. ישנן שיטות שונות לזיהוי אותות סידן cytosolic. קלסי, אותות ממחוון סידן ratiometric, כגון פורע-2, נמצאים במעקב בתאים חיים באמצעות התקנת הדמיה הקרינה וריכוזי סידן מוחלטים יכול לנבוע מקביעת עוצמות הקרינה מינימליות ומקסימלי. עם זאת, טכניקה זו דורשת ציוד מיוחד, ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פלואו-3, AM	Invitrogen	F-1241	חדיר לתאים
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	בלתי מסיס במים, מתמוסס ב-1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSציטומטר זרימה של קליבור + תוכנת CELLQuest	Becton Dickinson
ממשק מסמכים מרובים של Windows עבור ציטומטריית זרימה (WinMDI)	ג'ו טרוטר, מכון		שים לב שמדובר ביישום ישן יותר של 16 סיביות הקורא קבצים תואמי FCS 2.0 אך אינו מזהה נתונים דיגיטליים של FCS 3.0.
WKPT-0293 Cl.2 קו תאי צינורית פרוקסימלית של כליית חולדה			ביופיזיקה, קייס<בר/> אוניברסיטת ווסטרן ריזרב, קליבלנד, אוהיו)

סקריפס זמין על ידי ד"ר אולריך הופר (המחלקה לפיזיולוגיה &