במבחנה דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

Summary

תאים גלובואידים הם מאפיין פתולוגי מגדיר של מחלת קראב, לויקודיסטרופיה שכיום חסר טיפול יעיל לטווח ארוך. פיתחנו מודל תרבית תאים כדי לחקור את הביולוגיה המולדת והפוטנציאל הפתוגני של מיקרוגליה מופעלת והפיכתם לתאים גלובואידים.

Abstract

הפונקציה המדויקת של מיקרוגליה רב גרעיניים, הנקראת תאי globoid, כי הם ייחודיים בשפע במערכת העצבים המרכזית של leukodystrophy תא globoid (GLD) אינה ברורה. פער בידע זה התעכב בשל חוסר מתאים במודל חוץ גופית למחקר. במסמך זה, אנו מתארים מערכת תרבות העיקרית עכברית גליה שבו טיפול עם תוצאות psychosine בmultinucleation של מיקרוגליה הדומים לתאי globoid האופייניים שנמצאו בGLD. שימוש במערכת הרומן הזה, שהגדרנו את התנאים ומצבים של ניתוח למחקר של תאי globoid. פוטנציאל השימוש של מערכת מודל זה קבל תוקף במחקר הקודם שלנו, שזיהה את התפקיד פוטנציאלי לmetalloproteinase מטריקס (MMP) -3 בGLD. רומן במערכת מבחנה זה עשוי להיות מודל שימושי שבו ללמוד את המבנה ותפקוד, אלא גם מניפולציה הטיפולית הפוטנציאלית, של תאים הייחודיים אלה.

Introduction

leukodystrophy Globoid התא (GLD), המכונה גם מחלת Krabbe, היא מחלה demyelinating קטלנית כתוצאה מאובדן של מוטציות פונקציה בgalatocerebrosidase הגן (galc) ^1. הצורה השכיחה ביותר של GLD היא הגרסה הילדותית המתאפיינת בהתפרצות בילדות מוקדמת ומאופיינת במהלך קליני אגרסיווי של מנוע וירידה קוגניטיבית שמובילה למוות בטרם עת לעתים קרובות לפני חמש שנים בגיל ^2,3. בדיקות גנטיות משמשות לאימות אבחנה של ⁴ GLD. נוירופתולוגיה של GLD חושפת פגיעה במיאלין נפוצה, ניוון עצבי, astrogliosis ונוכחות של מיקרוגליה רב גרעיניים צבה נקרא תאי globoid ^5-7. זיהוי של תאי globoid, לעתים קרובות המכיל תכלילים tubulous בהציטופלסמה שלהם, היה תכונה מגדירה של GLD ל97 השנים האחרונות, למרות שהתפקיד הספציפי של תאים הבולטים אלה נותר חמקמק.

מעורבותם של הלא myelגליה (מיקרוגליה ואסטרוציטים) inating בפתוגנזה של GLD כבר מזמן נחשבים תגובה משנית לפגיעה במיאלין העמוקה במחלה זו ^8. מעניין לציין, כי התיאור הראשון של מחלה זו, שנעשה על ידי Knud Krabbe 1916 ^5, היווצרות מדווחת של phagocytes multinucleated המכיל פסולת שומנים שכבר בשם 'globoid תאים' והוא מאפיין מגדיר של מחלה זו.

תאי Globoid הם תכונת סימן ההיכר של פתולוגיה GLD, למרות שהתפקיד שלהם בGLD זכה להתעלמות ארוכה. מעניין, תאים אלה הם בין השינויים האופייניים המוקדמים ברקמת מערכת העצבים המרכזית של GLD. זה חוסר הידע אולי היה בשל ההנחה כי ההיווצרות של phagocytes multinucleated, תאים ענק הנקראים במחלות אחרות, נחשבות בדרך כלל כתוצאה של פתולוגיה ולא כוח פתוגניים ראשוני נהיגה ^9. לכן, היו מעט מחקרים החוקרים את המנגנון שבאמצעות WHIתאי globoid ch נוצרים מphagocytes, במיוחד במערכת העצבים המרכזית של GLD. ההליך המתואר בדוח זה מתמקד בחשיבות של היווצרות תאי globoid במערכת העצבים המרכזית וההפגנה הקודמת שלנו שmultinucleation המושרה psychosine של מיקרוגליה במבחנה ותאים אלה הציג רמות גבוהות יותר של פעילות phagocytic. עולה בקנה אחד עם תצפיות אלה, תאי globoid במוח Twitcher לעתים קרובות מכילים פסולת PAS-חיובי, המצביעים על רמות גבוהות של פעילות phagocytic. תאי Globoid גם הם מצאו להיות immunopositive לפריטין (סמן מיקרוגליה) ^10, KP-1 / CD68 (סמן מונוציטים), וחלקם גם חיובי עבור vimentin (חלבון ביניים נימה וסמן של האסטרוציטים ומיקרוגליה הופעלו) ^11, HLA-DRA (קולטן משטח MHCII), וTNF-α ^7, וייבא-1 (חלבון קושר סידן המשמש לזיהוי מיקרוגליה) ^12. בהתבסס על אוסף זה של סמנים, תאי globoid מקורן מיקרוגליה המתפתחיםהפנוטיפ ייחודי.

למרות הייחוד שלהם, את הפונקציה ותרומתו של GCS לפתוגנזה GLD הספציפיים הוזנחה. תאי Globoid כבר חשבו להיות תוצאה משנית של פגיעה במיאלין הכרונית. עם זאת, המחקרים האחרונים שבחנו את הקשר הזמני של תאי globoid לפתולוגיה בחומר הלבן של GLD זיהו הנוכחות של תאי globoid בסוף העוברי לתקופות לאחר לידה מוקדמת; פעמים הקודמות אפופטוזיס oligodendrocyte ופגיעה במיאלין הגלוי ^13. כך, הרצף הזמני של פיתוח בנוירופתולוגיה של GLD מצביע על כך שתאי globoid נוצרים מראש של פגיעה במיאלין במחלה זו ^14. זה הוביל להשערה שלנו כי ההיווצרות המוקדמת של תאי globoid בGLD עשויה לייצג אירוע פתוגניים הגדרה ולא תגובה משנית, תגובתי לנזק oligodendrocyte ^15. בנוסף, חוסר ויסות של פעילות microglial בGLD כבר נחשב פקטוr הגבלת היעילות ארוך הטווח של טיפולים בתאי גזע hematopeotic לטיפול במחלה זו ^16. כך, חוקר את התפקודים התאיים ורגולציה של מיקרוגליה, ותאי globoid, בתגובה לpsychosine צפוי לספק תובנות חדשות בפתוגנזה של GLD.

עד לאחרונה, חוסר המודל מתאים שבו תוכל ללמוד היווצרות תא globoid הגביל את ההבנה של התפקיד והתרומה של תאים אלה לפתולוגיה של GLD המדויקים. במחקרים שנעשה לאחרונה, נקבע כי יכולים להיווצר תאי globoid-כמו בתגובה ישירה לpsychosine, רעלן שומנים פתוגניים שמצטבר בGLD. מצאנו מיקרוגליה את זה, אבל לא מקרופאגים, מופעלים ולהפוך לתאי globoid בתרבויות גליה עיקריות בתגובה לpsychosine ^15. השינוי הזה לתאי globoid נמצא להיות מתווך על ידי פרוטאז תאי, metalloproteinase מטריקס (MMP) -3 ^15. לאחרונה, אנוהרחיבו את הממצאים הללו וקבע כי תאי מיקרוגליה וgloboid מופעל psychosine פותחו במבחנת מערכת מודל זה הם בעצמה רעילה לoligodendrocytes ובתאי oligodendrocyte. לפיכך, כאשר נחשבו בהקשר של GLD, ההצטברות המוקדמת של psychosine והיווצרות של תאי globoid לפני הפגיעה במיאלין יתמוך תפקיד עיקרי ואולי פתוגניים המתעוררים למיקרוגליה במחלה זו.

אנו מציעים מחקר שהיווצרות תא globoid יחשפו מידע חדש על הפתוגנזה של GLD שיתרום להבנה של מחלה זו שלנו. יתר על כן, מודל הסלולרי החדש של GLD עשוי לספק פורמט חדש שממנו הגישות טיפוליות חדשניות לטיפול בשינויים פתולוגיים במחלה זו יכולים להיבדק. לפיכך, בדוח זה אנו מספקים פרוטוקול מפורט לפיתוח במבחנה של תאי globoid מושרה psychosine מתרבויות עיקריות של גליה myelinating שאינו.

Protocol

כל הנהלים הקשורים בעלי חיים בוצעו בהתאם למדיניות על צער בעלי חיים טיפול ושימוש בחי מעבדה שנקבע על ידי המשרד למעבדת צער בעלי חיים (NIH), ורק עם אישור מהוועדה המוסדי הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת מרכז לבריאות קונטיקט.

.1 הכנת תרבויות גליה מעורבות

1. לעקר את כל המכשירים לפני השימוש. הוסף 3 מ"ל של התמיסה קרה כקרח סטרילי של האנק המאוזן מלח (HBSS) המכילה לא קטיונים (Mg ^{2 +} או Ca ^{2 +)} לשלוש 60 מ"מ צלחות פטרי סטרילי שמרו על קרח כדי לשמור על הקור.
2. לבודד את קליפת המוח מגורי עכבר P0-P2 לאחר לידה, כפי שתואר קודם לכן ^17,18.
   הערה: מבנים קורטיקליים, כגון hippocampi, אינם כלולים בתרבויות אלה.
3. מוציא בזהירות את קרומי המוח ולאחר מכן להעביר את קליפת המוח המבודדים לHBSS הטרי ולנתק את רקמות אנזימים, באמצעות neערכה לנתיחה רקמות אוראל על פי הפרוטוקול של היצרן.
4. צלחת התאים לתוך T-175 צלוחיות סטרילי ודגירת הלילה בתקשורת [בינוני הנשר (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) המכיל פניצילין / סטרפטומיצין 1x שונה Dulbecco].
5. החלף את כל אמצעי התקשורת ביום שלמחרת עם תקשורת טרי. תמשיך לדגור תרבויות, עם שינויי מדיה רגילים, למשך כ 3 שבועות או עד monolayer סלולרי שהוקם.
   הערה: monolayer זה יהיה מורכב מהאסטרוציטים ומיקרוגליה עם כ 10: 1 יחס ^19.

.2 אינדוקציה סלולארי Globoid בתרבויות גליה מעורבות

1. הכן את coverslips ECM מצופה.
   1. משרים coverslips העגול עם חומצת סטרילי 1 N הידרוכלורית (HCl) בצלחת פטרי סטרילית למשך 30 דקות. לשטוף coverslips עם 3x מים סטריליים ולאחר מכן לטבול ב95% EtOH לפחות 20 דקות. ואז לתת לי אוויר יבש.
   2. טיפות מקום matr תאי המדוללחומרי ix ציפוי (ECM) חלבון על גיליון של Parafilm (למשל 150-250 μl / טיפה של laminin 10 מיקרוגרם / מ"ל מומס בתמיסת חיץ פוספט סטרילי [PBS]). להפיץ את הטיפות כדי שcoverslips לא לגעת כאשר הניח על גבי הטיפות הללו. מניח בעדינות כל coverslip מיובש על אגל באמצעות מלקחיים.
   3. השאר את coverslips על הטיפות למשך כ. 4-6 שעות בתוך מכסה המנוע התרבות עם האבנט סגור.
   4. מניחים את coverslips ECM מצופה (בצד עד מצופה ECM) לכל אחת מהבארות של צלחת 24 גם. לשטוף היטב עם כל PBS 3x סטרילי ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.
2. הכנת תאי גלייה לציפוי על coverslips.
   1. לשאוב את התקשורת מתרבויות גליה ולשטוף בעדינות 3x monolayer גליה עם 10 מ"ל של PBS סטרילית. לאחר מכן, להוסיף 8-10 מ"ל פתרון טריפסין-EDTA לT-175, ודגירה של 5-10 דקות ב37 מעלות צלזיוס.
   2. כאשר רוב monolayer כבר מנותק, להוסיף 20 מ"ל של מדיה מלאהלבקבוק כדי להפסיק trypsinization. לאסוף את המדיה המכילה את התאים מנותקים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל וספין 10 דקות ב XG 300 בטמפרטורת חדר.
   3. לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ"ל של מדיה מלאה טרי בעדינות על ידי pipetting הפתרון באמצעות pipet P1000.
   4. לקבוע את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן מחדש להשעות תאים בינוניים מלא בצפיפות הרצויה (10 ⁵ תאים / מ"ל לדוגמא). פלייט התאים על coverslips ECM מצופה (למשל 500 μl לבאר כל הצלחת 24 גם). הוסף מדיה שלמה טרי נוספת לכל גם ל3-5 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, או עד שתאים לגדול למפגש החזותי הרצוי.
3. טיפול בPsychosine.
   1. מחדש את psychosine לריכוז המניה (108.3 מ"מ) בsulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל מניות זה ב100% EtOH לעשות מניית עובדת שיכולn יתווסף לבאר כל צלחת 24 גם כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
   2. בעת הוספת psychosine, בעדינות מערבולת צלחת התרבות לערבב psychosine לתקשורת והתרבות. להשלים את psychosine ידי הוספה המקבילה של 10 מיקרומטר בכל יום אחר במשך שבוע אחד.
4. לאחר 7 ימי טיפול psychosine, לאסוף את התקשורת ו500 μl pipet של paraformaldehyde הקר 4% (PFA) לתוך כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, לשטוף היטב 3x כל אחד עם PBS ולאחר מכן לשמור על צלחות ב 4 ° C. עד מעובד לimmunocytochemistry (ראה להלן).
   הערה: תקשורת תרבית תאים ניתן לאסוף להאנזימטית או assay ELISA בשלב זה אם תרצה בכך.

.3 Immunocytochemistry (ICC) לדמיין תאי Globoid

1. החלף PBS עם חיץ חסימה [+ 0.3% Tween-20 5 +% עזים בסרום נורמלי PBS (NGS)], ודגירת התאים עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
2. בcubate תאים הקבועים בantisera העיקרי נגד איבא-1 [(1: 1,000) בדילול מלא PBS + 0.3% Tween-20 + 2% NGS] במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף היטב עם כל דקות 3x PBS 5 / לשטוף.
3. מוסיף את נוגדן פלואורסצנטי מצומדות- המשני המתאים כדי לזהות את עיקרי תיוג נוגדן ונגד כתם עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1,000) לזהות גרעינים. דגירה בפתרון נוגדנים משני עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר ולשטוף עם דקות 3x PBS 5.
4. הר כל coverglass לשקופיות מיקרוסקופ באמצעות הרכבה בינונית. צפה בשקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור ניתוחים חזותיים וכמותית.

.4 ניתוח ואפיון של תאי Globoid בתרבות ראשית

1. השתמש בשלושה הקריטריונים מורפולוגיים הבאים כדי לזהות תא globoid בתרבות:
   1. לזהות תאי globoid באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי תיוג immunopositive עבור סמן microglial, + איבא-1.
   2. זההתאי globoid כ( כלומר שתיים או יותר גרעינים חיוביים DAPI המכילים) polynucleated.
   3. לזהות תאי globoid ידי מורפולוגיה מעוגלת להבדיל מההופעה מסועפת מאוד של מנוחה תאי microglial.
      הערה: תאים יכולים להיות גם שנאסף לצורך ניתוח סמן פני תא וכימות על ידי cytometry זרימה מתרבויות אלה.
2. מדידת הפעלת phagocytic של מיקרוגליה ותאי globoid
   1. כדי להעריך את פעילות phagocytic של מיקרוגליה טופל psychosine, להוסיף חרוזים לטקס FITC שכותרתו לבארות בהתאם להוראות היצרן. להוסיף חרוזים לטקס ניאון מצומדות- 48 שעות לפני קיבוע עם PFA. תקן תאים שטופלו בחרוזים (כאמור בסעיף 2.4), ותהליך לimmunocytochemistry (כאמור בסעיף 3).
   2. בחר נוגדנים משני fluorophore מצומדות-, כך שהם אינם חופפים ספקטרום פליטת הניאון של חרוזים fluorophore שכותרתו.
   3. Analyzדואר פרופילי phagocytotic של איבא-1 + מיקרוגליה על ידי זיהוי אותם התאים שישתפו למקם עם חרוזים fluorescently שהכותרת.
      הערה: Psychosine יפעיל מיקרוגליה. חרוזים phagocytosed יזוהו בתוך איבא-1 תאים + mononucleated וmultinucleated בהגדרת התרבות זו.

.5 אינדוקציה של תאי Globoid מתרבויות מזוקקים microglial

הערה: גישה חלופית לפענח איתות בין תאית בין astrocyte ומיקרוגליה היא יתרון נוסף של במבחנה globoid מודל זה תא. טיהור של תאי microglial העיקריים לreplating או שיתוף culturing יכולה להיות מושגת על ידי רכוש הדבקות הנמוך שלהם בתרבות, כפי שמתוארת בשלבים הבאים (ראה סעיף 5.2).

1. לאסוף את התקשורת מתרבויות גליה מעורבות ומחוברות לצינור חרוטי 50 מ"ל ולתחזק אותו על 37 מעלות צלזיוס בחממה.
2. בידוד microglial מתרבויות גליה מעורבות ראשית.
   1. לאחר הסרת התקשורת מבקבוק T175 מחוברות מעורבת תרבות גליה, להוסיף מדיה רועדת חמה [בהיקף של מדיה מלאה + 25 מ"מ 4 החומצה (2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 סודיום ביקרבונט מ"מ (Sigma)]. לנער את צלוחיות ל3-4 שעות בייקר מסלולית ב100 סל"ד (37 מעלות צלזיוס). לאסוף את המדיה מצלוחיות מזועזעות אלה לתוך 50 צינורות חרוטי מ"ל.
      הערה: תקשורת זה תכלול מיקרוגלים פחות חסיד מהצלוחיות.
   2. ספין התקשורתי XG 300 10 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ"ל של תקשורת מיזוג astrocyte (שנאסף בשלב 5.1).
   3. להקים את מספר התאים שנרכש באמצעות hemocytometer ולאחר מכן צלחת תאי microglial על coverslips מצופה מצע (ראה סעיף 2.1) לimmunocytochemistry, או צלחת על גבי צלחות גם דבקות ultralow לאוסף עתידי של תאי globoid לתרבות משותפת עם סוגי תאים אחרים, כגון oligodendrocytes (כיורדribed בסעיף הבא).
      הערה: ברגע שמצופית המיקרוגלים יכולים להיות מטופלים עם psychosine (10 מיקרומטר) כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 2.3).
3. שיתוף תרבות עם ראשוני Oligodendrocytes לניתוח רעיל.
   הערה: אוסף של מיקרוגליה טופל psychosine מצלחות ההיענות הנמוכה לתרבות משותפת שלאחר מכן על תרבויות עיקריות של oligodendrocytes, או תאי אב oligodendrocyte, יכולה לשמש כדי לבחון את התפקוד ציטוטוקסיות הפוטנציאל של תאים דמויי globoid אלה במבחנה.
   1. לפתח תרבויות של oligodendrocytes העיקרית בשיטות הוקמו ^18,20. כדי לאסוף את מיקרוגליה טופל psychosine, בעדינות pipet לנתק את התאים חסיד רופף מהחלק התחתון של הבארות. לאסוף את התאים, צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות, ולאחר מכן resuspend בזהירות בתקשורת בידול oligodendrocyte [מורכבת מתקשורת Neurobasal, L-גלוטמין (1x), B-27 תוספת (1x), וtriiodothyronine (T3, 10 ng / ml )].
   2. לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן זרע מיקרוגליה על תרבות oligodendrocyte ב1 x 10 ⁵ תאים / מ"ל, וכתוצאה מכך 1 משוער: 2 מיקרוגליה / יחס oligodendrocyte. דגירה כשיתוף תרבות לתקופה של עד 3 ימים.
   3. תקן את התאים לimmunocytochemistry (ראה סעיף 2.4). אסוף תקשורת תרבית תאים לELISA או בדיקות כימיות לפי צורך.

Results

פרוטוקול זה, כפי שנכתב, צפוי להימשך כ 36 ימים כדי להשלים מהתחלה ועד הסוף (ראה איור 1: ניסיוני זרימת העבודה Scheme). זה היה הניסיון שלנו כי התפתחותם של תאים 'כמו globoid' במערכת התרבות העיקרית זה היא גם אמינה ושחזור: ההיווצרות של תאי multinucleated בתגובה לpsychosine הוא ציינה באופן עקבי עם 7 ימים של טיפול.

צביעת Immunocytochemical של מיקרוגליה באמצעות איבא-1 בשיתוף עם נגד גרעיני כתם יאפשר זיהוי ש...

Discussion

הפרוטוקול המתואר במסמך זה מספק מערכת מודל חדשה שבו ללמוד פיתוח ואפיון פונקציונלי של מיקרוגליה מופעלים ותאים globoid. עבודה מוקדמת של אל Im et. באמצעות שורת תאי HEK293 סיפק תבנית לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי לחקר תא globoid היווצרות ^21. כמו כן, חשוב להצביע על כך שתאי globoid נגזרים במודל שונה מתאי globoid האם של זיהוי בGLD. לדוגמא, יש לנו ציינו באופן שגרתי quadranucleation של מיקרוגליה בתרבויות העכבריות שלנו, בזמן שהתאים globoid בGLD נצפו לעתים קרובות מכילים...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
האנק' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) שאינה מכילה קטיונים (Mg2+ ו-Ca2+).	טכנולוגיות חיים	14175-095
ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות	Miltenyi	130-092-628
40 & #956; מסננת תאים m	פישרברנד	22363547
האנק' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) המכילה קטיונים (Mg2+ ו-Ca2+).	Gibco	14025-092
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)	Gibco	11995-065
סרום בקר עוברי (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilin/Streptomycin	Life technologies	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Trypsin-EDTA	solution Life technologies	25299-056
פסיכוזין	סיגמא	P9256
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא	D2650
פרפורמלדהיד (PFA)	מדע מיקרוסקופיה אלקטרונית	19208
סרום עיזים רגיל (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iva-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor מצומד antisera	Life Technologies	מדיה הרכבה שונות
	Southern Biotech	OB100-01
ערכת בדיקה פגוציטית קיימן	כימיקלים	500290
HEPES	Sigma	BP310-500