אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

סיכום

השימוש בדגימת ציטומברשת לאיסוף לימפוציטים ומונוציטים מהאנדו-צוואר הרחם הוא טכניקה זעיר פולשנית המספקת דגימות לניתוח חסינות דרכי המין הנשיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את איסוף דגימות הציטו-מברשת ובידוד תאי החיסון עבור מבחני זרימה ציטומטרית.

תקציר

למרות החשיבות של פתוגנים ריריים לבריאות הציבור (כולל HIV), מעט יחסית ידוע על חסינות רירית, במיוחד במערכת המין הנשית (FGT). מכיוון שהעברה הטרוסקסואלית מייצגת כעת את המנגנון הדומיננטי של העברת HIV, ובהתחשב בהתפשטות המתמשכת של זיהומים המועברים במגע מיני (STI), חיוני להבין את יחסי הגומלין בין המארח לפתוגן ברירית איברי המין. פערי הידע המשמעותיים סביב חסינות FGT נובעים בחלקם מהקושי לאסוף ולעבד בהצלחה דגימות ריריות. על מנת להקל על מחקרים עם גודל מדגם מספיק, טכניקות האיסוף חייבות להיות זעיר פולשניות ויעילות. לשם כך, בוצע אופטימיזציה של פרוטוקול לאיסוף דגימות ציטומברשת צוואר הרחם ובידוד לאחר מכן של תאים חד-גרעיניים צוואר הרחם (CMC). באמצעות אימונופנוטיפ מבוסס ציטומטריה של זרימה ex vivo, ניתן לכמת בצורה מדויקת ואמינה את תדירות אוכלוסיית הלימפוציטים/מונוציטים CMC ופנוטיפים. טכניקה זו יכולה להיות משולבת עם אוסף של שטיפת צוואר הרחם-נרתיק (CVL), המכילה מתווכים חיסוניים מסיסים כולל ציטוקינים, כימוקינים ואנטי פרוטאזות, שכולם יכולים לשמש לקביעת הסביבה האנטי-דלקתית או הפרו-דלקתית בנרתיק.

מבוא

רוב זיהומי HIV החדשים ברחבי העולם להתעורר באמצעות שידור הטרוסקסואלים, עם נשים המייצגות 47% מזיהומים חדשים ב2011 ⁽¹ UNAIDS). הבנה בדרכי המין הנשית (FGT), אחד מפורטלי הכניסה העיקריים ל-HIV ופתוגנים מועברים במגע מיני אחרים, הוא בעל חשיבות גבוהה בדרך למציאת אסטרטגיות יעילה למניעת זיהום. תגובה חיסונית ברירית איברי המין הם בבירור ייחודיות ושונים מאלו שנמדדו בדם היקפי ^2. עם זאת, ידע הנוכחי של הדינמיקה החיסונית בFGT מוגבל במקרה הטוב. עד כה, מחקרים של הסביבה החיסונית ברירית התמקדו בעיקר ברקמות הקשורים בטן הלימפה (גאלט), שבו התברר שיש לי האירועים המוקדמים ברקמות הריריות בעקבות זיהום השפעה חזקה על התקדמות מחלה לאחר ^3,4. איסוף דגימות מרירית איברי המין מהווה אתגר גדול ולפחות בחלקו אחראי לאקk הבנה של אימונולוגיה של FGT. פתרון החידה מהדינמיקה החיסונית בין המארח והפתוגן בהקשר של הסביבה ברורה שהיא FGT מחייב שיטות יעילה לאיסוף וניתוח של דגימות מאזור זה.

FGT מחולק לשני חלקים: מערכת הרבייה העליונה הכוללת חצוצרות, רירית הרחם וendocervix, ודרכים נמוכות יותר המכילה את ectocervix והנרתיק (נסקר על ידי Kaushic אח' ^5). זה עדיין לא ברור מה תרומתו היחסית של אתרים השונים אלה היא הידבקות ב-HIV, אבל הוא האמין כי שני האתרים יכולים לתרום לכניסת ה-HIV ^6. תאי T מייצגים 40-50% מleucocytes בקטעים העליונים ותחתונים הרבייה, ואילו מקרופאגים מהווים כ 10% (בדיקה ב-רודריגז גרסיה ואח' ^2). ניתן לאתר תאי T בנרתיק, צוואר הרחם, ורירית הרחם. המקרופאגים הם חזקים יותר localized ברירית הרחם ורקמת חיבור myometrial מצוואר הרחם, למרות שהם יכולים להיות מזוהים בשתי הרקמות. לבסוף, תאים הדנדריטים plasmacytoid (PDC) ותאים לנגרהנס יכולים גם להתגלות ברקמות FGT. הפנוטיפ והפרופורציות של אוכלוסיות חיסוניים והרגישות שלהם להידבקות ב-HIV עשויים להשתנות חשוב פי מחזורים הורמונליים, השימוש באמצעי מניעה הורמונליים, וגינוזיס חיידקים או פעילות מינית ^5,7-9.

מגוון שיטות פותחו כדי ללמוד את האוכלוסיות וסביבה חיסוניים של FGT. ביופסיה צוואר הרחם, צוואר הרחם וcytobrushes lavages הצרויקו (CVL) ^10-12 הם נפוץ ביותר על פני הספרות. CVL אוסף ידי שטיפת PBS הוא השיטה הפשוטה ומאפשר הלימוד של חלבוני ויסות מערכת החיסון, אך תוצאות בתשואה נמוכה מאוד של תאים, ולכן הוא אינו מתאים ללימוד אוכלוסיות תאים חיסוניים של FGT ^13. דגימות CVL הן, לעומת זאת, very שימושי להערכת הסביבה החיסונית של FGT ידי מדידת הביטוי של ציטוקינים שונים, כמוקינים או גורמים מיקרוביאלית באמצעות שיטות כגון ELISA, מערך חרוז ציטוקינים ¹⁴ או ספקטרומטריית מסת ^15,16. אפיון של תדרים חיסוניים תא, פנוטיפים ופונקציות יכול להיות מושגת על ידי איסוף תאים חד גרעיניים בצוואר הרחם (CMC) על ידי cytobrush צוואר הרחם או על ידי דגימת ביופסיה בצוואר הרחם.

דגימת ביופסיה צוואר הרחם היא שיטה פולשנית המגבירה את אי הנוחות וסיכון לדימום ולוקח 2-11 ימים כדי להחלים לאחר ההליך בהתאם למצב החיסונית של האישה ^12. מצד השני, cytobrushes צוואר הרחם, למרות התשואה נמוכה יותר של תאים שנאספו, היא שיטה פחות פולשנית ונוחה יותר לאיסוף תאים חיסוניים מFGT. שני שיטות יכולות להגיע לאותה תשואה של leucocytes CD45 +, אבל שתי cytobrushes צוואר הרחם רציף נחוצות כדי להשיג את אותה הכמות של תאים הכיל in ביופסיה אחת ^13. יחד עם זאת, דגימת cytobrush עדיין מספקת מספר מקובל של תאים (כ -5,000 CD45 + תאים / cytobrush) עבור vivo phenotyping נוסף לשעבר על ידי cytometry זרימה ^14. כמו כן, אפיון פונקציונלי יכול להתבצע על דגימות אלה, כגירוי וזרימת cytometry תאית או qPCR בוצעו באמצעות CMCs נגזר cytobrush לזהות תגובות HIV-ספציפיות חיסוניים ¹⁷ או ה תא קיטוב ^18. התרחבות של אוכלוסיית תאי T עשויה גם להקל על מחקרים פונקציונליים עם CMCs ^19.

חשוב לציין כי ביופסיות וcytobrushes לטעום מנות שונות של FGT. ביופסיות נגזרות מהחלק העליון של האפיתל ו stroma של ectocervix ^12,13, בעוד cytobrushes צוואר הרחם לדגום את מערכת ההפעלה בצוואר הרחם, איסוף תאים שמקורם האפיתל של endocervix ומן הסתם אזור טרנספורמציה. דגימות Cytobrush לכן לדגום מחדשגיון מורכב משכבה יחידה של אפיתל עמודים, בעוד ביופסיות, כוללות אזור בשורה של אפיתל מרובדת קשקש ^5. כתוצאה מכך, האופי של אוכלוסיות יקוציט שנאספו על ידי ביופסיה וcytobrush צוואר הרחם שונה. ביופסיות לאסוף שיעור גבוה יותר של תאי CD3 + T, ואילו cytobrushes לגרום לאוסף של שיעור גבוה יותר של מונוציטים CD14 + / מקרופאגים ^13.

לומד אימונולוגיה של FGT כבר עניין לשנים רבות ^ו20-22 שצברנו מומחיות רבה בחקר CMCs נגזר cytobrush. המחקרים שלנו מתמקדים בעיקר בלימוד seronegative HIV-נגוע, נגוע ונחשף ב-HIV (HESN) עובדי מין נשיים מניירובי, קניה. HIV משכפל מעדיף בתאי T מופעלים ²³ ונמוכות מספרים של תאים מופעלים שיכול להיות ממוקד על ידי HIV בFGT יכולים לתרום להגנה מפני רכישת ה-HIV. בקנה אחד עם השערה זו, כמה Studies תיאר הפעלה חיסונית נמוך יותר בקרב עובדי תעשיית מין HESN שנמצאים בחשיפה גבוהה לאיידס עדיין יישאר נגוע ^24,25, והפנוטיפ שקט זה נצפה גם בFGT ^14. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לעיבוד והערכת הפעלת תאי T בדגימות CMC נגזרות מcytobrushes צוואר הרחם על ידי vivo לשעבר cytometry זרימה.

פרוטוקול

שמירה על אתיקה: לוחות האתיקה המחקריות של שניהם מאוניברסיטת מניטובה וקניאטה הלאומית בית חולים / אוניברסיטת ניירובי אישרו מחקר זה וכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל משתתפי המחקר.

1. הכנת מדיה וCMC אוסף צינורות

1. הכן ופר פוספט פתרון (PBS) (137.93 mM NaCl, 2.67 מ"מ KCl, 8.1 מ"מ Na ₂ HPO _4, 1.47 מ"מ KH ₂ PO _4). החיטוי על סטריליות. זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
2. טרום aliquot 5 מיליליטר PBS לתוך צינור 50 מיליליטר בז (אחד לדגימה שנאסף) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד למועד איסוף דגימה.
3. תווית 2-4 cryovials או 1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות לדגימה לאסוף שטיפה לאחסון.
4. הכן תקשורת תרבית תאים: RPMI 1640 1% פניצילין / סטרפטומיצין / amphotericin B + (ריכוז סופי 100 יחידות / מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר ו250 ng / ml, respectivאיליי, ללא FCS / FBS הוסיף.

2. איסוף דגימות Cytobrush

איסוף דגימות cytobrush הוא הליך פולשני שחייבת להתבצע על ידי MD או גינקולוג מיומנים.

1. איסוף תאי צוואר הרחם מונונוקלארים (CMC) באמצעות שני cytobrush ומגרד עץ או פלסטיק. לאסוף CMC מהמשתתף בבדיקת ספקולום ידי הוספת המגרד ומסתובב סביב מערכת ההפעלה צוואר הרחם (איור 1). הכנס את cytobrush לתוך מערכת ההפעלה האנדוצרוויקאלית, לסובב 360 °, ואת המקום באופן מיידי שני cytobrush והמגרד לתוך הצינור הבז 50 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של PBS.
2. שמור על דגימות קרח / על 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. כדי לשמור על כדאיות תא, דוגמאות תהליך תוך 2 שעות של אוסף.
3. במידת האפשר, לאסוף דגימות דם מתאימים בvacutainers הפרין העליון הירוק לתא הדם היקפי mononuclear בידוד (PBMC) לשמש כמשווה / שליטה לניתוח CMC.

3. בידוד של CMCs

לבצע עיבוד דגימה במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2, בתוך ארון בטיחות ביולוגי סטרילי עם כפפות כפולות.

1. במהלך איסוף, דגימות CMC יכולות להיות מזוהמות בדם. תכלול דגימות עם זיהום דם גלוי מהמחקר כדי למנוע הכללה של בלבול PBMC במדגם הסופי. בשל המספר הנמוך של לימפוציטים שבודדו דגימות CMC, זיהום דם קטין יכול בקלות להכריע את מרכיב הלימפוציטים CMC.
2. צינורות בז ורטקס המכילים את שני cytobrush ומגרד ל45 שניות לנתק תאים מהמברשות. דוגמאות עשויות להיות קצף בתהליך זה; זה נורמלי.
3. השתמש cytobrush לגרד כל חומר שנותר מן המגרד, וזורקים את המגרד לפתרון אקונומיקה. לאסוף את כל תאים שנותרו צמודים למברשת / המגרד, השתמש כפפה טרי לסחוט המגרד בין האגודל לאצבע.להחליק במורד המברשת, המאפשר לתאים וPBS להיות שנאספו באותו צינור מיליליטר 50. מחק את cytobrush לפתרון אקונומיקה, וזורקים את הכפפה.
   חשוב: השתמש בכפפות חדשות עבור כל דגימה.
4. להתאים מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר לצינור בז טרי 50 מיליליטר. בעזרת פיפטה העברה, לאסוף את ההשעיה PBS התאים מצינור המדגם ולסנן דרך המסננת לתוך הצינור הטרי.
5. הוסף 5 מיליליטר של RPMI 1640 לצינור המדגם המקורי. באמצעות פיפטה ההעברה, לשטוף את הצדדים של צינור המדגם עם RPMI, ולהעביר דרך המסנן לצינור האיסוף החדש. שטוף את החלק התחתון של מסנן הניילון עם RPMI גם כן.
6. צנטריפוגה הדגימות 10 דקות ב 514 x גרם. זה חיוני כדי להשאיר את בלם צנטריפוגות מבמהלך שלב זה, על מנת למנוע דחיקה של גלולה CMC.
7. בעדינות להסיר את supernatant מהצינור, נזהר שלא להפריע גלולה. גודל גלולה יהיה משתנה מאוד; בכךלי דוגמאות, גלולה היא די גדולה בשל נוכחותם של מספר הגדול של תאי אפיתל, ואילו במקרים אחרים, גלולה היא בקושי נראית ושקופה מאוד.
8. Resuspend את הכדור על ידי תסיסה עדינה של הצינור הבז. הוסף 5 מיליליטר של PBS לשטוף את המדגם.
9. שוב צנטריפוגות במשך 10 דקות ב XG 514 עם בלם לא צנטריפוגות.
10. להשליך בזהירות את supernatant מחדש להשעות גלולה כאמור לעיל. התאים מוכנים או הקפאה (באמצעות פרוטוקול הקפאת PBMC), גירוי או cytometry זרימת phenotyping.

4. מכתים משטח CMC וזרימת cytometry

1. Resuspend את הכדור מהצעד 3.10 בחסימת פתרון 100 μl ולהעביר או לתוך צלחת 96 היטב או צינור FACS. פתרון החסימה (לחסום קולטני Fcγ) מתכון הוא כדלקמן: IgG עכבר 1.8 μl (ריכוז סופי 0.2 מיקרוגרם / μl), 5 FBS μl ו93.2 μl FACS לשטוף (PBS 2% FBS).צביעה יכולה להתבצע בצלחת גם אם 96 גדלי גלולה קטנים מספיק, אבל ייתכן שתצטרך להתבצע בצינורות FACS אם כדורים הם גדולים באופן שיגרתי. חשוב לכיל נוגדנים בהתאם.
2. חסום את הדגימות עבור 10 דקות ב/ קרח ב 4 ° C.
3. לשטוף את התאים עם FACS של שטפי (FBS +2% PBS) 100 μl בצלחות 96 היטב, או 500 μl בצינורות FACS. צנטריפוגה ב XG 600 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם על נמוך (או כבוי, אם הגדרת בלם נמוכה אינה זמינה).
4. הסר את supernatant מחדש להשעות את התא גלולה על ידי תסיסה. תוסיף כתם כדאיות (צבע כדאיות בשידור חי המלח ניתן לתקן). הכן את צבע כדאיות פי הוראות יצרן. זה ייתכן שיהיה צורך טיטרציה לשימוש בכל התקנת המעבדה / cytometer. דגירה במשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C.
5. לשטוף את התאים של PBS 100 μl/500 μl (לצינורות צלחת / FACS 96 היטב). צנטריפוגה ב XG 600 עבור 10 דקות עם נמוך / לא בלם. הסר supernatant ותאי resuspend.
6. דגירה התאים עם הקוקטייל של נוגדני סמן פני השטח, בהיקף כולל של 100 μl. חשוב: ייעל ולכייל כל תזרים cytometry פנל לפני לדגום מכתים. דגירה תאים עבור 30 דקות בחושך ב 4 ° C.
7. חזור על שלב 4.5. אם מכתים בצלחת, תאי העברה 96 היטב לצינור FACS ולדלל את נפח סופי של μl 750 של FACS לשטוף מכיל paraformaldehyde 1% (PFA) (או CytoFix, בדילול מלא 1 ב 4). המשך לרכישת נתונים על cytometer זרימה.

5. איסוף והכנה של צוואר הרחם בנרתיק שטיפה (CVL)

1. לפני cytobrush דגימה, להשתמש במזרק כדי לשטוף endocervix עם 2 מיליליטר של PBS סטרילי ולשאוב את שטיפה מfornix האחורי.
2. לאסוף את דגימת שטיפת aspirated לתוך צינור בז 15 מיליליטר ולשמור על קרח / על 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.
3. צנטריפוגה מדגם ב XG 400 במשך 7 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר.
4. שיתוףllect supernatant, aliquot המדגם לתוך 1 מיליליטר או 500 aliquots μl, ולאחסן ב -70 ° C. Aliquots יכולים להיות מופשרים לELISA או ניתוח מערך חרוז של חלבוני CVL, אך להימנע מהקפאה / הפשרה מחזורים מרובים.
5. אם תרצה, resuspend את הכדור של פסולת הסלולר בRNA מאוחר יותר כדי למדוד ביטוי RNA על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן.

6. רכישת נתונים

1. להכין סט של צינורות פיצוי התואם את פנל הנוגדנים. הפעל את צינורות הפיצוי להתאים חפיפה ספקטרלית. הפעל את הדגימות על כל זרימת ססגוניות cytometer שמוגדר עבור הנוגדנים מצומדות fluorochrome בשימוש בלוח.
2. לרכוש מדגם PBMC הראשון כדי להתאים קדימה פיזור (FSC) וצד פיזור מתח (SSC) על מנת לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים. נסה לשמור אותם ב100 על כל ציר בקנה מידה ליניארי. פועל שליטת PBMC יקל באופן משמעותי כדי למצוא את אוכלוסיית הלימפוציטים CMC.
3. סף FSC עבור דגימות CMC ייתכן שיהיה הצורך מוגבר בהשוואה לדגימות PBMC בשל למרוח את ציר SSC בערכי FSC נמוכים.
4. מערבולת בצינור אחד לפני הרכישה. לרכוש את כל הצינור על מנת למקסם את מספר אירועי שער הלימפוציטים שנאספו. לנטר את המכונה בזהירות כדי למנוע סתימה.
5. לייצא את הנתונים לתכנית ניתוח התזרים cytometric כגון FlowJo.

7. Gating אסטרטגיה

1. בחר צד פיזור קדימה גבוה (FSC-H) / אזור קדימה פיזור הצד (FSC-) כדי לקבוע את אוכלוסיית הגופייה.
2. בחר זמן לעומת סמן פלואורסצנטי (כמו בדוגמא של FITC) כדי לשלוט על האיכות של הרכישה. שינוי בקצב זרימה עשוי להציג את הממצאים בנתונים. תכלול כל אזור שמראה פער בקצב זרימה.
3. לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים בעלילת SSC-A/FSC-A. השתמש בשליטת PBMC כדי להקל על זיהוי. שים לב שאוכלוסיית הלימפוציטים CMC לא יכולה להיות ברורה כמו שליטת PBMC.
4. השער בSSC-A/viability לצבוע להוציא תאים מתים מהתאים חיים. תאים מתים שאינו יכולים לשלב באופן ספציפי הנוגדנים, אשר יציגו ממצאים.
5. שער בSSC-A/CD3 לזהות את אוכלוסיית תאי T. מהשער הזה, לזהות את האוכלוסיות מסוג CD4 + ו CD8 +.

תוצאות

זרימת multiparameter cytometry הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח את פנוטיפים ופונקציות של תת תא ברקמות uncharacterized בעבר. ניתוח של דגימות CMC יכול להניב מידע על שני הלימפוציטים ואוכלוסיות מונוציטים עם אסטרטגיות gating מתאימות.

אסטרטגית gating נציג CMC, בהשוואה לפרופיל PBMC מתאים, מוצגת באיור 2. FSC-לעומת עלילת FSC-H מאפשר ההרחקה של כפילויות תא, אשר נפוצו מאוד בדגימות CMC לעומת PBMC, גם לאחר הסינון

דיון

לאור פערים הגדולים בידע בנוגע לחסינות בדרכי המין הנשית (FGT), ניתוח פנוטיפי של CMCs יכול לספק מגוון רחב של תובנות אוכלוסיות לימפוציטים מרובות בצוואר הרחם. בשילוב עם ניתוח proteomic ומדידות עומס נגיפיים בשטיפת צוואר הרחם, חסינות לזיהומים המועברים במגע מיני (STI) של ופתוגנים אחרים יכולה להיות גזור באוכלוסיות שונות.

שיקולים טכניים - CMCs: הבידוד והצביעה מוצלחת של דגימות CMC יכולים להיות מאתגרים. אופ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100 μ מסננת תאים m לצינור בז 50 מ"ל BD		352360	עיבוד CMC
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	עיבוד CMC
סרום בקר עוברי	טכנולוגיית חיים	16000044	עיבוד CMC
Fungizone	Life	15290-018	עיבוד CMC
פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא	P4333-20 מ"ל	עיבוד CMC
50 מ"ל צינור פלקון	פישר	14-959-49A	עיבוד CMC
בנק דם חד פעמי העברה פיפטה	פישר	13-711-6M	עיבוד CMC
ציטומברשת פלוס	קופר כירורגי	C0121	CMC דגימה
מגרד צוואר רחם חד פעמי	מהיר רפואי	2183	CMC דגימה
15 מ"ל צינור פלקון	פישר	14-959-70c	עיבוד CVL
צינור 1.5 מ"ל Eppendorf	Fisher	05-402-18	אחסון CVL
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים ניתנת לתיקון	Invitrogen	מגיב ציטומטריה זרימה	שונה
מאגר קיבוע (4% PFA)	BD	554655	Flow Cytometry regeant
עכבר IgG	Sigma	I8765	Flow Cytometry regeant