הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים

11.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51909

⸱

20 באוקטובר 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Inselspital, University of Bern, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Basel, 3Department of Biology, University of Fribourg

במאמר זה

סיכום

במסמך זה אנו מדגימים כימות של דה ברשתית והתחדשות והשפעתה על תפקוד ראייה באמצעות -nitrosourea N -methyl- N בדג הזברה המבוגר. מספרי קולטי אור אובדן של חדות ראייה והירידה היו במעקב על ידי התפשטות בשכבת הגרעין הפנימית. התחדשות מורפולוגית ופונקציונלית מלאה התרחשה 30 ימים לאחר הטיפול הראשוני.

תקציר

מחלות רשתית ניווניות, רטיניטיס פיגמנטוזה למשל, עם וכתוצאה מכך חשבון נזק קולטי אור עבור רוב אובדן הראייה בעולם התעשייתי. מודלים של בעלי החיים הם בעלי חשיבות מכרעת ללימודי מחלות כגון. בהקשר זה רעלן קולטי האור ספציפי -nitrosourea N -methyl- N (MNU) כבר בשימוש נרחב במכרסמים כדי לגרום פרמקולוגית ניוון רשתית. בעבר, הקמנו מודל מושרה MNU רשתית ניוון בדג הזברה, עוד מערכת מודל פופולרית במחקר חזותי.

הבדל מרתק ליונקים הוא נוירוגנזה המתמשכת ברשתית דג הזברה מבוגרת והתחדשותו לאחר פגיעה. כדי לכמת תצפית זו יש לנו עובדי מדידות חדות ראייה בדג הזברה המבוגר. וכך, רפלקס optokinetic שימש למעקב שינויים תפקודיים בדגים שאינם מורדמים. זה היה בתוספת היסטולוגיה, כמו גם staini immunohistochemicalng לאפופטוזיס (TUNEL) וההתפשטות (PCNA) כדי לתאם שינויים מורפולוגיים פיתוח.

לסיכום, אפופטוזיס של קולטני אור מתרחש שלושה ימים לאחר טיפול MNU, אשר מלווה ירידה ניכרת של תאים בשכבה החיצונית הגרעינית (ONL). לאחר מכן, התפשטות של תאים בשכבת הגרעין הפנימי (INL) וONL הוא ציין. בזאת, אנו מגלים שלא רק היסטולוגית אך מלאים גם התחדשות תפקודית מתרחשת על פני מסלול של 30 ימים זמן. עכשיו אנחנו ממחישים את השיטות לכמת ומעקב דה דג הזברה רשתית והתחדשות באמצעות MNU בוידאו בפורמט.

מבוא

חזון הוא התחושה חיונית ביותר לאדם ויש לו ירידת הערך שלה השפעה חברתית וכלכלית גבוהה. בעולם המפותח, מחלות ניווניות ברשתית הן הסיבה המובילה לאיבוד ראייה ועיוורון בקרב אנשים מבוגרים 1. הסיבה למרבית המחלות רשתית ניווניות מובנת רק בחלקו ופתרונות טיפוליים כדי להחזיר את החזון אבוד הם מאוד מוגבלים. רטיניטיס פיגמנטוזה הוא דוגמא אופיינית למחלה ניוונית של רשתית עם אובדן קולטי אור העיקרי 2-3. N -methyl- -nitrosourea N (MNU) גורם לניוון רשתית ולכן בשימוש נרחב במכרסמים מודל מחלות עם מוות של תאי קולטי אור עיקריים 4. זה סוכן אלקילציה ומוביל לגידולים שפירים וממאירים, אשר מופיעים בדרך כלל מספר חודשים לאחר החשיפה 5-7. בנוסף, הוא גורם למוות של תאי קולטי אור ספציפיים בתוך תקופת תצפית לטווח קצר. וכך, אובדן structu שכבת הרשתיתמחדש ודילול רשתית משמעותי נצפה באופן תלוי ריכוז. תאי גליה רשתית הופעלו, אך לא חלה שינויים באפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נמצאו. אפופטוזיס הקשורות במתח reticulum (ER) endoplasmic נראה המסלול העיקרי של פעולת MNU ברשתית 8.

יש לנו לאחרונה הצגתי MNU כמודל כימי כדי לגרום לניוון קולטי אור בדג הזברה 9. , בין שאר, דג הזברה (Danio rerio) הפכה להיות חשובה במחקר חזותי בגלל הדמיון של מערכת הראייה שלה לזה של בעלי חוליות אחרות 10. הרשתית החיצונית מכילה קולטני האור, שניתן לקבץ לארבעה סוגים שונים קונוס עם רגישויות שיא באולטרה הסגול, קצר, בינוני, ואורך גל של הספקטרום הנראה לעין ארוכה וסוג קולטי אור מוט אחד. בשכבת הגרעין הפנימית (INL), גופי התא של הפרעה דו קוטבית, וinterneurons אופקיים, amacrine נמצאים, כמו well כסומה התא של תאי גליה מולר. בשכבת plexiform החיצוני (OPL) הקשרים סינפטיים בין קולטני אור והרשתית הפנימית נוצרים, ואילו שכבת התא הקרובה ביותר לעדשה היא שכבת תא גנגליון (GC), שרכיבים יוצר אקסונים ארוכים המרכיבים את עצב הראייה ומערכת הראייה . קשרים סינפטיים בין תאי הגנגליון והתאים בשכבת הגרעין הפנימי נוצרים בשכבה הפנימית plexiform (IPL) 11. הרשתית נמצאת מחוץ לרשתית נוירו ומקיפה מגזרים חיצוניים קולטי האור עם microvilli הפסגה ארוך 12. יתר על כן, דג הזברה הוא משובי ומסוגלים להצמיח מחדש מוח פצוע, רשתית, חוט השדרה, לב ורקמות אחרות 13 מאוד. כאשר נזק לרשתית מתרחשת, תאים בINL, אשר נחשבו לתאי מולר, מופעלים ויש להם הפוטנציאל להתמיין לסוגי תאים ברשתית שונים. בנוסף, הם גם ליצור אבות מוט, אשר ממוקמים בONL. כך אחרurce שמספק את הרשתית של דג הזברה מבוגרת עם תאים חדשים הוא האזור השולי הריסים. יש צורך במקור זה כדי להשיג צפיפות קבועה של קולטני אור מוט בעין דג הזברה גדלה ברציפות 14.

מודל MNU יכול לשמש כגישת ניוון / התחדשות פשוטה לשחזור לרקמת רשתית. בשל דמיון מסוים של תהליכים ביולוגיים בדג זברה ובבני אדם זה יכול לפתוח את הדלתות כדי לזהות מסלולים מעורבים מוות של תאים ולהקרין תרופות נוירו פוטנציאליות. בהתבסס על מחקר קודם מהקבוצה שלנו, אנחנו עכשיו להמחיש את השיטות של מודל דג הזברה-Induced MNU זו של דה ברשתית והתחדשות כתוצאה מכך לרבות שינויים פונקציונליים עם פי מעבדה קטעי וידאו 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים דבקו בהצהרה לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים וחזון מחקר של האגודה לחקר חזון אופתלמולוגיה (ארוו).

.1 בעלי חיים

  1. לשמור על דג הזברה wild-type (Danio rerio) של זן AB (אורגון) בגילים שבין 6-12 חודשים בתנאים סטנדרטיים במים עם טמפרטורה של 26.5 מעלות צלזיוס ו14/10 שעה מחזור אור / 15 כהה.
  2. פעל בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים של המוסדות המעורבים לניסויים בבעלי החיים לאחר שאושר על ידי לשכת הווטרינרית המחוזית.

.2 MNU טיפול

  1. הכן מים המכילים חומר יבש 150 מ"ג / L של -nitrosourea -methyl- N N (MNU). זהירות! MNU הוא רעיל; עלול לגרום לסרטן, נזק גנטי תורשתי או לפגיעה בעובר.
  2. דגירה דג הזברה במים המכילים MNU ל60 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. יש לשטוף את דג הזברה במהירות עםמים וטריים לשים את הדגים לאקווריום חדש בלי MNU. לשמור על דגים בתנאים סטנדרטיים כל עוד רצוי לניסויים.

.3 מדידת חדות ראייה

  1. להפעיל את מערכת optomotor, לבחור 'בדיקה' מהתפריט ולהגדיר את האפשרויות ל" מדרגות פשוטות "," חדות (תדר) "ו16" אקראיים / נפרדים ".
  2. התקן בקבוק עירוי מלא ב500 מ"ל מים על 1 מ 'מעל מערכת optomotor.
  3. הנח דג הזברה אחד בחדר הבדיקה ולחבר אותו לבקבוק העירוי. מניחים את חדר הבדיקה במערכת optomotor.
  4. התחל את המדידה ולבחון את תנועות עיניים בזמן אמת על מסך המחשב. וכך, תגובה חיובית ("כן") מוגדרת כקפיצות האלה ברציפות בכיוון הנכון, ואילו תשובה שלילית ("לא") מייצג תנועות עיניים אקראיות דומות לאלה שנצפו עם תחנהשבכות האר"י. אם העיניים של תערוכת דג הזברה שלוש או יותר תגובות optokinetic שלאחר מכן (OKR), לחץ על 'כן'; אם לא, לחץ על 'לא'.
  5. חלץ את חדות הראייה, שחושב על ידי התוכנה על ידי קביעת הסף של התדר המרחבי של גירוי optokinetic, תחת "תוצאות" בתפריט.

.4 היסטולוגיה

  1. להרדים את דג הזברה על ידי מנת יתר של אתיל methanesulfonate 3-aminobenzoate (200-300 מ"ג / ליטר) וenucleate העיניים.
  2. לתקן את כל העיניים בparaformaldehyde 4% (PFA) שבנאגר מלוח פוספט (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 12 ולאחר מכן מייבשים את הדגימות בסדרת אלכוהול מדורגת.
  3. להטביע את הדגימות בפרפין, לחתוך 5 מיקרומטר סעיפים דרך ראש עצב הראייה (ONH) ולעגן אותן בשקופיות זכוכית.
  4. כתם חלקי פרפין deparaffized עם hemalum למשך 4 דקות וטובלים את השקופיות פעמיים במים מזוקקים ואחריו 0.2% ACI הידרוכלוריתאמוניה ד ו0.8%. כתם החלקים עם eosin במשך 3 דקות לאחר הפיתוח של הכתמת hemalum במים ברז לדקות לפחות 10. (H & E).
  5. להטביע את השקופיות מיובשים בהרכבה בינונית ולבחון את השקופיות מתחת למיקרוסקופ האור.

.5 אימונוהיסטוכימיה

  1. transferase deoxynucleotidyl מסוף תיוג סוף dUTP ניק (TUNEL)
    1. דגירה סעיפי deparaffinized עם 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteinase K בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. שטוף את החלקים שלוש פעמים עם טריס שנאגרו מלוח (TBS) במשך 5 דקות כל אחד.
    2. דגירה הסעיפים בתערובת 50 μl תגובת TUNEL (10% פתרון תיוג ו90% פתרון אנזים) בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לשטוף שלוש פעמים עם כפות במשך 5 דקות כל אחד.
    3. הר השקופיות עם ההרכבה בינונית המכיל DAPI ולבחון את השקופיות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. הגרעיני Antigen מכתים תא מתרבים (PCNA)
    1. מרתיחים את חלקי deparaffinized במאגר אחזור אנטיגן (טריס-EDTA 0.05 + Tween% 20, pH 9.0) במשך 3 דקות ולשטוף שלוש פעמים עם כפות במשך 5 דקות כל אחד. לחסום עם 100 μl פתרון החסימה (TBS + 10% + 1% אלבומין בסרום שור העז הנורמלי בסרום, pH7.6) בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
    2. כתם עם נוגדנים ראשוניים אנטי PCNA בדילול 1: 200 בתא humidified על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף שלוש פעמים עם כפות + Tween 20 ל5 דקות כל אחד.
    3. לסיים את זיהוי עם הנוגדנים משני המתאימים בדילול 1: 500 בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
    4. הר השקופיות עם ההרכבה בינונית המכיל DAPI ולבחון את השקופיות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חדות ראייה:

ניסיוני ההגדרה [תדר המרחבי: 0.042 חוגים / תואר (ג / ד); ניגודיות: 100%; מהירות סחיפה: 20 מעלות / שני (ד / src); בחזרה בהיקות אור: 152 cd / m 2] של מחקר זה אפשרה הערכת OKR של דג הזברה מבוגרת. משך הממוצע של מדידת VA היה על 5 - 10 דקות לכל דג הזברה, אשר נסבל ההליך היטב. חדות ראייה לפני חשיפת MNU היו .577 ± 0.014 מחזורים / תואר (ד / ג). איור 1 מציג את קורס חדות הראייה לאחר הייש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעבר, הקבוצה שלנו העבירה את מודל MNU של ניוון קולטי אור ממכרסמים למערכת דג הזברה 9. האירועים שלאחר מכן תוארו ואחריו לתקופה של עד 30 ימים. בפרק זמן זה ניוון רשתית מלא מורפולוגיים והתחדשות התרחשו לאחר הטיפול הראשוני. ראשית, היסטולוגיה מגלה תא מוט מופחת לספור מיום 3 בעם מינימום ביום .8 במקביל, מכתים TUNEL מזהה אפופטוזיס של קולטני אור מוט 3 ימים לאחר טיפול MNU. התחדשות מתחילה בINL ביום 3, עם מקסימום ביום .5 בONL, יכולים להיות שנצפו תאים מתרבים עד תום תקופת התצפית עם מקסימום...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים למוניקה קילכנמן, פדריקה ביסיניאני ואגתה דודה על הסיוע הטכני המצוין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתסיגמא-אולדריץ', בוקס, שוויץA6283
אמוניהסיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ2949930.80%
אלבומין בסרום בקר (BSA)סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ05470
Dako PenDako, Glostrup, DanmarkS2002
DAPI הרכבה בינוניתVector Labs, ברלינגיים, קליפורניה, ארה"בH-1200
EosinSigma-Aldrich, בוכס, שוויץ45260
אתנולסיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ2860100%, 96%, 70%
אתילנדיאמין-טטראצטי (EDTA)סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץED
אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאטסיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץE10521טריקאין
EukittSigma-Aldrich, Buchs, שוויץ3989
עז נגד ארנב Alexa 594Life Technologies, צוג, שוויץ A11012
עז סרום רגילDako, Glostrup, דנמרקX0907
חומצה הידרוכלוריתסיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ3203310.20%
במקום ערכת זיהוי מוות תאיםRoche Applied Sciences, רוטקרויץ, שוויץ11684795910ערכת TUNEL
תמיסת ההמאלום של מאיירMerck, דרמשטדט, גרמניה109249
Methylnitrosourea (MNU)Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץN4766
Toxic OptoMotryCerebralMechanics, לת'ברידג', AB, קנדהn.a.Paraformaldehyde
(PFA)Sigma-Aldrich, Buchs, שוויץP6148
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Sigma-Aldrich, Buchs, שוויץP5368
Proteinase KDako, Glostrup, DanmarkS3004
ארנב אנטי-PCNA סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, סנטה קרוז, ארה"בsc-33756
Superfrost Plus זכוכית שקופיותGehard Menzel GmbH, בראונשווייג, גרמניה10149870
Tris תמיסת מלח חוצצת (TBS)סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץP5912
בסיס TrizmaSigma-Aldrich, בוכס, שוויץT1503
Tween 20Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץP1379
קסילןסיגמה-אולדריץ', בוכס, שוויץ534056
דג זברה (Danio rerio) AB (אורגון) זןאוניברסיטת פריבורג, המחלקה לביולוגיהn.a.מתקן דגים משלו

מקורות

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
  3. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  4. Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
  5. Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
  6. Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
  7. Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
  8. Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
  9. Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
  10. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
  11. Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
  12. Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
  13. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  14. Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
  15. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
  16. Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10(2012).
  17. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
  18. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  19. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  20. Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
  21. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  22. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  23. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MNUPCNATUNEL
Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.