הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51915

⸱

14 בנובמבר 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Perkin Elmer Inc., 2Henry M. Jackson Foundation, 3The Geneva Foundation, 4ORISE, 5Frederick National Laboratory for Cancer Research, 6Division of Molecular and Translational Sciences, US Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 7DoD Biotechnology High Performance Computing Software Applications Institute (BHSAI), Telemedicine and Advanced Technology Research Center (TATRC), US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC)

במאמר זה

סיכום

בוטולינום נוירוטוקסין הוא אחד הרעלנים החזקים ביותר מבין גורמי האיום הביולוגי מקטגוריה A, אך טיפול לאחר חשיפה אינו זמין. גישת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה היא מתודולוגיה רבת עוצמה לזיהוי מעכבים חדשים מכיוון שהיא מאפשרת סריקה רב-פרמטרית באמצעות נוירונים מוטוריים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, המטרה העיקרית של רעלן זה.

תקציר

חלבון הקשור לסינפטוזומלי-25 (SNAP-25) הוא מרכיב של קומפלקס קולטן חלבון החיבור NSF (SNARE) המסיס החיוני לשחרור נוירוטרנסמיטר סינפטי. בוטולינום נוירוטוקסין סרוטיפ A (BoNT/A) הוא מטאלופרוטיאז אבץ החוסם אקסוציטוזיס של נוירוטרנסמיטר על ידי פיצול רכיב SNAP-25 של קומפלקס SNARE. נכון לעכשיו אין תרופות מורשות לטיפול בהרעלת BoNT/A לאחר הפנמת הרעלן על ידי נוירונים מוטוריים. הפיתוח של אמצעים טיפוליים יעילים נגד שיכרון BoNT/A הוגבל, בין היתר בשל היעדר בדיקות חזקות בתפוקה גבוהה לסינון ספריות מולקולות קטנות. כאן אנו מתארים בדיקת הדמיה בעלת תוכן גבוה (HCI) עם תועלת לזיהוי מעכבי BoNT/A. מאמצי האופטימיזציה הראשוניים התמקדו בשיפור יכולת השחזור של תוצאות בין לוחות על פני ניסויים מרובים ובלתי תלויים. אוטומציה של צביעה חיסונית, רכישת תמונה וניתוח תמונה נמצאו כמגבירים את עקביות הבדיקה וממזערים את השונות תוך מתן אפשרות להערכה רב-פרמטרית של תרכובות ניסיוניות במערכת נוירונים מוטוריים של עכבר.

מבוא

טוקסין החיידק Clostridium מייצר רעל עצב טוקסין, אחד מהרעלים הביולוגיים החזקים ביותר הידוע לאדם 1. ישנם 7 קפסיד bont מובהקים (בונט / AG). בונט / A-גאל לגרום שיתוק בצומת העצבית-שהרירית בשל proteolysis המורכבת מלכודת 2,3. proteolysis המלכודת מונעת איחוי שלפוחית-קרום מוליך עצבי, ולכן לוקים הנוירוטרנסמיטר exocytosis 4. יעד המלכודת הספציפי תלוי בסרוטיפ bont המסוים המעורב בתהליך שכרות. בונט / וונט / E תדבק SNAP-25 ואילו דבק בונט / C שני SNAP-25 וsyntaxin 5. Synaptobrevin ידבק קפסיד הנותרים (המכונה גם חלבון הקרום קשור-שלפוחיות (נצלנית). בונט / נבחר לפיתוח assay כפי שהוא אחראי לשיעור גבוה של בוטוליזם באופן טבעי ויש לו משך הזמן הארוך ביותר של פעולה 6. פיתוח של מולקולה קטנה תרופות נגד ונט / היא מטרה עיקרית לתכנית גילוי תרופות ו נצלה שיטות המבוסס על יעד מסורתיים לזהות מעכבי proteolytic האתר פעילים 7, 8-10. עם זאת, היצירה של מעכבי אתר פעילים עם פעילות קשת רחבה נגד קפסיד מרובה ויעילות לאחר החשיפה צפויה להיות מאתגרת.

לכן יש לנו יישמתי גישה חדשנית, פנוטיפי תרופת גילוי שמשתמשת במחשוף בונט SNAP-25 כנקודת סיום פונקציונלית לזהות מולקולות קטנות שיכול לחסום שיכרון הנוירון מוטורי בתיווך בונט. SNAP-25 נדרש לשחרור הנוירוטרנסמיטר, כהשפלה של SNAP-25 הוא חיזוי של שיתוק וקטלני in vivo. לדוגמא, הקרנה מבוססת תאים עלולה להוביל לגילוי של מאפננים חדשים של גורמים הסלולר אחראים לאיון רעלן או עיכוב של מסלולי רעלן בתוך תאים ממוקדים. גורם חשוב בהתפתחות assay פנוטיפי הוא הבחירה של מודלים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. Wדואר ואחרים תארו את הנוירונים עכבר גזע עוברי (ES) שמקורן בתאים מנוע כי לשחזר את האופי החיסוני של תאי עצב מוטוריים ראשוניים, ובכלל זה הביטוי של SNAP-25 11- 13. חשוב לציין, המערכות הסלולריות אלה רגישות מאוד לונט / שיכרון ולהפגין מחשוף תלוי-מינון של SNAP-25 בתגובה לגידול בריכוזי של רעלן 11,12. הנוירונים המוטוריים המובחן גם הם מיוצרים בכמויות שמספיקות לניתוח מבוסס צלחת תפוקה גבוהה ואפשרו את העיצוב של מערך של מבחני סלולריים.

Assay פנוטיפי הוא שיטת immunofluorescence ניצול שני נוגדנים שונים לכמת מחשוף של באורך מלא בא לידי ביטוי באופן אנדוגני SNAP-25 במהלך ונט / שיכרון של תרבות הנוירון מוטורי עכבר. מסוף carboxyl ונט / נוגדן מחשוף רגיש (BACS) שמכיר באורך מלא רק SNAP-25 מאפשר ההערכה של bont proteolysis תיווך / של SNAP-25ביטוי במנוע עכבר נוירונים 10. תרשים סכמטי של assay HCI מתואר באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תאי הגזע העובריים של עכבר צלחת 20,000 הבדיל (MES) / גם ב96 צלחות ליזין מצופה פולי-D היטב ולשמור בתקשורת בידול מסוף הנוירון מוטורי 5-7 ימים.

מנהל 1. מתחם ושיכרון בונט /

לבצע את כל העבודה הבאה במתחם BSL2 על מנת לעמוד בהנחיות ה- CDC / NIH.

  1. הכן 10 פתרונות מניות מ"מ של כל מתחם ספרייה ב100% DMSO בפוליפרופילן 96 צלחות גם. השתמש במניית 10 מ"מ להכין צלחת דילול ביניים שהיא פי 10 גדולים יותר מריכוז ההקרנה הרצויה. הכן 100 צלחת ביניים אום על ידי מחלק 10 מניות מ"מ לתוך צלחת 96-היטב ולדלל אותו ל -100 UM באמצעות תקשורת ותרבות. להפריש 10 μl של התרכובות על 90 μl של תקשורת על התאים 11. תבדוק את התרכובות בשעה 10 בריכוז סופי אום ולהבטיח את האחוז הסופי של DMSO אינו עולה על 0.5%.
  2. לבצע את כל ההרבעהies שעושה שימוש בתאים חיים ורעלן פעיל ברמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים. החלף את המדיה הישנה ב96-גם צלחות עם 80 μl של תקשורת בידול מסוף הטרי באמצעות פיפטה במדריך 12 ערוץ. לבצע שאיפה ולוותר צעדים על ידי שורות כדי למנוע חשיפה של התאים ללא תקשורת לאוויר הסביבה.
  3. Pretreat תאים עם תרכובות שלפני היישום של רעלן על ידי תוספת של 10 μl של 10x תרכובות מצלחת המקור באמצעות פיפטה 12 ערוץ, ואחריו ערבוב על ידי שאיפה (פעמיים). לכל צלחת 96-היטב, לטפל בשני טורים של 6 בארות עם 10x DMSO המדולל בתקשורת כדי לשרת גבוהה כאות ובקרת אות נמוכה. הטור ללא טיפול בונט מציג את הרמה הגבוהה ביותר של האורך המלא SNAP-25 (שליטת אות גבוהה). פנק את הטור השני עם bont לבד (ללא כל תרכובות) כשליטת אות הנמוכה. השתמש שליטה נמוכה כדי לבחון את היעילות של המחשוף בונט של SNAP-25 וזיהוי שלה עם נוגדן BACS (איור 2).
  4. דגירה תאים עם תרכובות למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO 2 בתרבית תאי החממה.
  5. הכן עצבי טוקסין מ1 מ"ג / מיליליטר במקור מסחרי פוספט שנאגרו מלוח (PBS) למניות 10x סופיות עובדות על ידי דילול עם תקשורת בידול מסוף.
  6. ליזום שיכרון על ידי הוספת 10 μl של 10x בונט / המניה לתוך בארות המיועדות לבקרת טיפול ואות נמוכה בעזרת פיפטה רבה (איור 2). פנק את הבארות יועדו כגבוהה שליטה עם תקשורת לבד.
  7. לטהר את כל כלי הפלסטיק חד-פעמים ואחרות שבאים במגע עם בונט / במהלך המחקר על ידי טבילה בתמיסת היפוכלוריט 0.825% במים לפחות 20 דקות. לבצע את כל ההליכים בארונות בטיחות ביולוגיים ולטהר אזורי עבודה לפני ואחרי ניסויים עם 5% חומר ניקוי חיטוי חומרי ניקוי כגון פתרון MicroChem.
  8. תווית הצלחות ברורה כדי לציין את הרעל וincubצלחות אכלו טופלו בnM 1 / L בונט / 4 שעה על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO 2 באינקובטור תרבית תאים. להציג שילוט מתאים כדי ליידע עמיתים שהרעל נמצא בשימוש במעבדה.
  9. התחנה בונט / מחשוף פרוטאוליטים על ידי קיבעון מתנול. הסר מדיה המכילה רעלן ותרכובות מכל טוב עם פיפטה רבה וזורקים בפתרון אקונומיקה 10%. להוסיף מתנול הקרח הקר (100 μl) ישירות לכל טוב.
  10. דגירה צלחות במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT) על מנת לאפשר קיבוע להתרחש.
  11. לאחר קיבוע, להתמודד בבטחה עם ריאגנטים המושלכים (נחשב מנוטרל) עם פרוטוקולי 1 רמת בטיחות ביולוגית וזורקים בהתאם.
  12. בטל מתנול ולהשתמש של PBS 100 μl לשטוף את התאים ורעננותם לפני immunostaining. בצע שני שוטף PBS נוסף.
  13. לאחר השטיפה של הדבר, לעזוב את PBS בבארות, צלחות חותם עם סרט דבק microplate ולאחסן ב 4 ° C עד לניתוח. צלחות חנות ב 4 ° C FOr כמה ימים.

2. Immunostaining

הליך immunostaining הוא, פעולה רב שלבי עבודה אינטנסיבית הכוללת מחזורים חוזרים ונשנים מגיב לוותר / לשאוב ושטיפת צלחת נרחבת שעלולות להוביל להקדמה האפשרית של השתנות intraplate וinterplate משמעותיות. גישה חצי אוטומטי מוחלת לחסוך את הזמן של אנשי מעבדה, להגדיל את תפוקת assay, ולמזער immunostaining שונות.

  1. השתמש בתחנת עבודה אוטומטית מצויד בראש 96-היטב מסוגל להעביר נפחים של עד 250 μl ומשולב עם זרוע רובוטית תפסן לעבור מעבדתי למקומות שונים על הסיפון המודולרי (ראה חומרים וציוד) לפרוטוקול זה.
    1. הסיפון מודולרית נועד לארח סוגים שונים של מעבדתי ויכול לתמוך בעד 11 פריטים בכל זמן נתון. מטפל microplate האוטומטית מצויד במערה microplate מגזין כפול כדי להחזיק ולתפעל עד 50 צלחות בכל מחזור.
    2. תחנת העבודה האוטומטית ממוקמת בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II המיועד לציוד אוטומציה מעבדה כדי לספק לעקרות ובטיחות. עבור immunostaining האוטומטי, הסיפון מסודר כפי שמוצג באיור 3 כדי לאפשר גישה מגיב בהתאם לצורך וללא התערבות אדם.
  2. צלחות טרום עומס המכילות תאים קבועים למגזין הצלחת ומעביר לסיפון כנדרש לפעילות טיפול נוזלי. השתמש מצויד עם 250 טיפים μl ראש 96 פיפטה כדי לשאוב PBS מהבארות עד 10 μl. Permeabilize קרומים תאיים כדי להקל על נוגדן מחייב למטרות תאיות עם חיץ permeabilization (0.1% Triton-X 100). לוותר חיץ permeabilization (100 μl) לתוך זה גם לפני החזרת הצלחות למגזין האחסון השני של מערה microplate לדגירת 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT).
  3. הסר חוצץ permeabilization וPEשטיפת צלחת rform עם PBS (פעמיים) כפי שתוארה לעיל בשלב 1.13.
  4. לאחר השלב לשטוף האחרון, להסיר את PBS חיץ ולוותר של חיץ חסימה המכיל 1% בסרום סוס ו -0.1% Tween 20 בPBS 100 μl לכל microplates לפני החזרתן למגזין הצלחת 1 שעתי דגירה על RT.
  5. השתמש בשני נוגדנים ראשוניים לimmunostaining: נוגדן BACS אנטי עכבר הארנב polyclonal, לגילוי אורך מלא אנטי-III נוגדן טובולין SNAP-25 וחד שבטי עכבר לצורך זיהוי של תאי עצב (ראה חומרים וציוד). לאחר 60 דקות של דגירה, להסיר את חיץ החסימה ולוותר 50 μl של 4ug / מיליליטר של נוגדן BACS ו0.5 מיקרוגרם / מיליליטר של III-טובולין בחסימת מאגר לכל הצלחות.
  6. דגירה 1 שעות ב RT להסיר את הנוגדנים הראשוניים ולשטוף 3 פעמים עם PBS של 100 μl מכיל 0.05% Tween (PBST).
  7. השתמש IgG אנטי עכבר שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 647 לדמיין IgG -III טובולין ונגד הארנב מתויג עם אלקסה Fluor 568 לדמיין את נוגדן BACS. הכן שני הנוגדנים כדילול / מיליליטר 2 מיקרוגרם בחסימת מאגר ולוותר 50 μl של התערובת לתוך כל טוב.
    הערה: הנוגדנים משני שנבחרו לimmunostaining מסומנות עם fluorophores שונה ומאפשרת גילוי של אור הניאון נפלט באורכי גל שונים באמצעות ערוצים שונים בתוך הגלאי של Imager התוכן הגבוה.
  8. דגירה עבור שעה 1 ב RT. לשאוב את הנוגדנים משני ולשטוף 3 פעמים עם PBST של 100 μl.
  9. לאחר השטיפה של הדבר, להוסיף צבע של PBS המכיל Hoechst (32 מיקרומטר) 100 μl להכתים את ה- DNA לזיהוי גרעינים.
  10. לאטום את הצלחות עם סרט בלתי חדיר אור כדי להגן על fluorophores מphotobleaching. ניתן לאחסן צלחות ב 4   ° C במשך שבועות ללא אובדן משמעותי של אות.

3. הדמיה

הערה: בצע רכישת תמונה באמצעות תוכן גבוה ההדמיה SysTEM (ראה חומרים וציוד).

  1. מפרט של הגדרות Imager תוכן גבוהות:
    1. בחר סוג פלייט, פריסה, מספר תחומים, מטרה: גריינר u ברור, פורמט 96 גם, 16, 20X מים בהתאמה.
    2. ערוצים נבחרים: EX עירור גרעין: 405 ננומטר כערוץ 4; ציטופלסמה EX: 644 ננומטר כערוץ 2; EX אנטיגן הספציפי ערוץ נוגדן: 561 ננומטר כערוץ 3 וכוח עירור הגדרה של כל לייזר, ניסוי התקנה כמו 2 חשיפות, חשיפה 1 עם עירור אחד ב644 ננומטר, חשיפה 2 עם שני עירורים ב 405 ננומטר ו561 ננומטר. בחר binning כBin2.
    3. השתמש בבארות שליטה גבוהות לאופטימיזציה חשיפה בעוצמה המרבית כערוץ SNAP-25 ובארות שליטה נמוכות לעצמה מינימאלית.
    4. התאם את החשיפה, כך שהעצמה של כל ערוץ היא כמחצית מרמת הרוויה (2,000-2,500 יחידות יחסית).
    5. זהה את מטוס Z האופטימלי בערוץ מסכת תא באמצעות סקריפט תיקון דלתא. ראה Figure 5 לתוצאות לאחר immunostaining והדמיה. נתוני יצוא לשרת שבי תוכנת ניתוח תמונה המתגוררת.

4. ניתוח תמונה (איור 6)

הערה: השלבים הבאים מתארים יישום של אלגוריתמי תוכנת קולומבוס.

  1. בחר אלגוריתם מתאים למגזר האובייקטים העיקריים (גרעינים). במידת הצורך, להתאים את סף רקע ופרמטרים לעומת זאת. תוכנת קולומבוס מספקת 4 שיטות זיהוי גרעינים. בחר את השיטה שגרעיני קטע בצורה מדויקת על ידי בחינה ויזואלית בדיקת גרעינים מפולחים (בF שיטת 6 א igure M נבחר).
  2. בחר את אלגוריתם neurite (CSIRO neurite ניתוח 2) למגזר neurites אם נדרש, להתאים את הפרמטרים סף רקע ולעומת זאת להסרת רקע. ראה 6 ב איור לפרמטרים המשמשים לאיתור neurites.
  3. זהה את אזורי neurite (מגזרי neurite) basאד על אובייקטים משני (neurites) באמצעות הרחבת פיקסל -3 של ערוץ טובולין β-III (Alexa קמח 640) כמסכה (איור 6 ג).
  4. חישוב עוצמת ערוצי האות (SNAP-25, (Alexa קמח 568) לאזור neurites וערוץ β-III טובולין (איור 6 ד & 6-ה).
  5. בחר פרמטרים רצויים ליצוא, כגון אורך neurite, עוצמות ממוצעת של SNAP-25, טובולין β-III, מספר גרעינים, מספר קטע neurite, וכו '(6F איור).
  6. העברת צלחות ממלגזות צלחת באמצעות הרובוט והעומס לImager התוכן הגבוה לרכישת תמונה.

5. ניתוח נתונים:

כדי להעריך את חוסנו של assay נועד, לחשב את הפרמטרים הבאים מהניסוי מבוסס הצלחת.

  1. אות (S) לרקע (B): S B = עוצמת אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה) / אומר / שליטה אות נמוכה
  2. מקדמים שונה (CV) של אות ורקע (כדי למדוד את האחידות של האות הספציפית): קורות חיים = (סטיית תקן (/ ממוצע של מדגם SD)) * 100 (%), כדי לקבוע את השונות בטיפול נוזלי, ריאגנטים, וכו '
  3. אות לרעש: S = (ממוצע עוצמת האות - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / SD שליטה נמוכה
    1. לחשב הגורם "Z עם שיכרון מחצית מצלחת 96-היטב ושכרות מדומה של החצי השני. Z '= 1 - 3 * (SD שליטה אות גבוהה + SD שליטה אות נמוכה) / (ממוצע של שליטת אות גבוהה - ממוצע של שליטת אות נמוכה). לניתוח נוסף של נתוני ההקרנה, לנרמל חלק מפרמטרי הגלם העיקריים על בסיס צלחת כדי לאפשר השוואה בין לוחות ובין ימים השונים של ניסויים.
  4. אחוזים ממחשוף, המשקפים ירידה של האות הקשורים באורך מלא SNAP-25 זוהה על ידי נוגדן ספציפי (BACS):% מחשוף = 100% * (MEAעוצמת n שליטה אות גבוהה - עוצמת המדגם) / אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה.
  5. אחוזים מהעיכוב של מחשוף:% עיכוב = 100% * (עוצמת המדגם - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / (ממוצע עוצמת שליטת אות גבוהה - כלומר עוצמת שליטת אות נמוכה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נתונים מפקדים גבוהים ונמוכים יצרו שתי אוכלוסיות נפרדות עם ההבדל של שני חציונים עולה על 3 סטיות תקן (איור 7 א). המטרה של תהליך המיון היא למצוא תרכובות באוכלוסיית המדגם עם ערכים קרובים יותר לאוכלוסיית ביקורת חיובית, בהנחה של התפלגות נורמלית באוכלוסיית המדגם (איור 7 ב, (i)). נקודות נתונים, כי הם 3 סטיות תקן מעבר לממוצע נחשבות שונות סטטיסטית מהרעש וסווגו כ" להיט "פעיל (איור 7 ב (ב), תיבות אדומות). תרכובות המסווגים כ" להיטים "תהיה כפופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

העוצמה הגבוהה של עצבי טוקסין והקלות היחסית של חימושם הביאה סיווגם כקטגוריה (העדיפות הגבוהה ביותר) סוכני biothreat על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן. למרבה הצער, אין FDA אישר תרופה נגד שכרות בונט לאחר רעלן הופנם על ידי תאי העצב המוטוריים. כל מנגנון druggable שמקדם את ההחלמה עצבית משיכרון bont עלול להוביל לפיתוח טיפול פוטנציאלי להגנה הן על השירותים וציבוריים המזוינים נגד איום ביולוגי. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול assay HCI מפורט לסינון מעכבים של רעלים קטלניים כמו בונט /. הי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

קרישנה פ. קוטה הוא עובד של Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, המייצרת מכשירים ותוכנות המשמשות בכתב יד זה. התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של משרד הבריאות ושירותי האנוש של ארה"ב, משרד ההגנה של ארה"ב, משרד הצבא האמריקני או המוסדות והחברות הקשורים למחברים.

תודות

המימון ניתן על ידי המשרד המשותף למדע וטכנולוגיה - הסוכנות להפחתת איומי הגנה כימית ביולוגית (JSTO-CBD) תחת פרויקט נותן חסות מספר CCAR# CB3675 והמכונים הלאומיים לבריאות (1 R21 AI101387-01 ו-5 U01AI082051-05).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בוטולינום נוירוטוקסין A מטאביולוגיותNAללא מספר קטלוגי
לוחות מיקרוטיטרGreiner 655946פולי-D-ליזין 96 בארות צלחות
BACs נוגדןLampire ביולוגיNA
MicrochemNational 0255
מתנולתרמו סיינטיפיקA412-20
פורמלדהידתרמו סיינטיפיק28908
סרום סוסיםInvitrogen16050
PE JANUS MDT מיני תחנת עבודה אוטומטיתפרקין אלמרAJMDT01
אופרהפרקין אלמרOP-QEHS-01
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'9002-93-1
BIII נוגדן טובוליןR& D SystemsBAM1195
Tween 20SigmaP1379-1L
Hoechst 33342dye Invitrogen3570
Antimouse IgGInvitrogenA21236
אנטי ארנב IgGInvitrogenA10042
קולומבוס תוכנת ניתוח תמונהPerkin ElmerVer 2.4
SpotfirePerkin ElmerVer 5.5
Clorox bleachFisher Scientific18-861-284
מחסנית
פלטות

מקורות

  1. Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
  2. Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
  3. Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
  4. Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
  5. Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
  6. Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
  7. Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
  8. Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
  9. Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
  10. Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
  11. Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
  12. Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
  13. McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
  14. Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SNAP 25
Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.