הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

18.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51964

⸱

16 בפברואר 2015

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

המונח אנסטאזיס מתייחס לתופעה שבה תאים גוססים הופכים תהליך התאבדות של תאים בשלב מאוחר, מתקנים את עצמם ובסופו של דבר שורדים. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לאיתור ומעקב אחר תאים שעוברים אנסטאזיס.

תקציר

Anastasis (יווני עבור "עולה לחיים") מתייחס להתאוששות של תאים מתים. לפני תאים אלה להתאושש, הם עברו דרך מחסומים חשובים של אפופטוזיס, כוללים פיצול של המיטוכונדריה, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום לcytosol, הפעלה של caspases, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ"א, פיצול גרעיני, blebbing קרום פלזמה, התכווצות תא, חשיפת תא שטח של phosphatidylserine, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. Anastasis יכול להתרחש כאשר גירויים אפופטוטיים יוסרו לפני המוות, ובכך מאפשרים לתאים למות כדי להפוך אפופטוזיס ומנגנוני מוות פוטנציאלי אחרים. לכן, Anastasis מופיע לערב תהליכי ריפוי פיסיולוגיים שיכול גם לקיים תאים פגומים בצורה בלתי הולמת. הפונקציות והמנגנונים של Anastasis עדיין אינן ברורות, הקשו בחלקו על ידי הכלים מוגבלים לאיתור אירועי עבר לאחר ההתאוששות של תאים בריאים לכאורה. אסטרטגיות כדי לזהות anastasis יאפשר מחקרים של המנגנונים הפיסיולוגיים, סכנות של תאים מתים בפתולוגיה מחלה, ורפויים פוטנציאליים לווסת Anastasis. כאן אנו מתארים אסטרטגיות יעילות באמצעות מיקרוסקופ תא חי וbiosensor caspase יונקים לזיהוי ומעקב Anastasis בתאי יונקים.

מבוא

אפופטוזיס (יווני "נופל למוות") הנחה הוא בדרך כלל להיות תהליך חד-כיווני המסתיים בתא התאבדות 1-7. הפרעה גנטית של תוצאות גני פרו-מוות בהישרדותם של תאים נוספים שאחרת היה מתים בכל בעלי חיים, כוללים תאים שכבר יזמו את 8,9 מסלול אפופטוזיס. באופן דומה, מניפולציות גנטיות מאפשרות לתאי יונקים בריאים באופן מלאכותי להציג "לאכול אותי" אותות או שיאבדו את הדביקות למטריצת החוץ תאית שלהם כדי להינצל ממוות על ידי phagocytosis כל תא או entosis, בהתאמה 10,11. עם זאת, אנחנו ואחרים הראינו כי ללא תאי מניפולציה גנטית נורמלים בריאים יונקים ושורות תאים יכולים גם להתאושש מהמוקדמים של אפופטוזיס 12-15 שלבים. שימוש בכלים כדי לעקוב אחר תאים בודדים, יש לנו הפגנו נוסף התאוששות מהשלבים מאוחרים של אפופטוזיס 12,13, לאחר התאים עברו מחסומים חשובים שאופייניly לסמן את "נקודת אל-חזור" 2-6. מחסומים אלה של אפופטוזיס שלב מאוחר כוללים שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום C, הפעלה של caspases, פיצול גרעיני, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. אנחנו אימצנו מילה יוונית מתחם "Anastasis", שפירושו "עולה לחיים", כדי לתאר את המהפך הזה של אפופטוזיס על סף מות תא 2-6.

אלא אם כן את תהליך גסיסה-ההתאוששות כולו נצפה על ידי הדמיה תא חי, הוא מאתגר להבחין בין תאים שעברו Anastasis מהתאים שמעולם לא חוו אירועים אפופטוטיים. עשרות שנים של עבודה חשפו כי תכונות מורפולוגיות של התאבדות תאים על ידי אפופטוזיס מונעות על ידי אירועים ביוכימיים ומולקולריים אבולוציונית שמורה 16-19. אירועים אלה לקדם הרס עצמי של תאים כדי לווסת תהליכים התפתחותיים וhomoeostatic באורגניזמים חד תאיים ורבים תאיים על ידי ביטול פגום או דתאי angerous 16-19. בעוד תאים אפופטוטיים ניתן להבחין בקלות על ידי גילויים מורפולוגיים, ביוכימי ומולקולריים אחידים של אפופטוזיס 1,5,6,16,20, כרגע אין סמן ידוע ספציפי לAnastasis 12,13. חשוב לציין, תאים שעברו Anastasis נראים תאים נורמלים בריאים, ותאים שפשוט להתחיל היפוך אפופטוזיס מופיע תאים מתים אפופטוטיים כ12,13. לפיכך, יש צורך בכלים חדשים לקבוע בודאות כי תא ששרד נתון חווה בעבר תהליכים אפופטוטיים פעילים.

אפופטוזיס מקובל להניח כמפל בלתי הפיך, כי זה הוא תהליך הרס מהיר ומסיבי. למרות שזה יכול לקחת דקות לימים לכמה תאים ליזום אפופטוזיס, פעם המיטוכונדריה שיחררה גורמי apoptogenic כגון ציטוכרום C לתוך cytosol 21,22, ניתן להפעיל caspases תוך 5 דקות 23,24, ואחריו cytoplasmic ועיבוי גרעיני בתוך 10 דקות 25-27, ותא מוות זמן קצר לאחר מכן 25-27. caspases הופעל לתזמר אפופטוזיס על ידי ביקוע וinactivating רכיבים מבניים ותפקודיים מפתח לצורך ההריסה הסלולרית 2,28, כגון מעכבי endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases גם להפעיל גורמים פרו-אפופטוטיים, כגון BID חבר BCL-2 משפחה, אשר translocates למיטוכונדריה כדי לקדם את שחרורו של המיטוכונדריה של ציטוכרום C 31,32. פעילות caspase גם תוצאות חשיפת תא שטח של phosphatidylserine כאות "לאכול אותי" לקידום בליעה למות תאים על ידי מקרופאגים או תאי שכנים דרך phagocytosis 33. יתר על כן, אירועים אפופטוטיים להבהיר המיטוכונדריה מתפקדת, שיבוש ביו-אנרגיה תאית ו34,35,36 חילוף חומרים. כך, התאוששות מהרס כזה נראה באופן אינטואיטיבי סבירה.

בניגוד למקורי מצפהations, תאים יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים אפילו בשלב מאוחר. על ידי ברציפות ניטור הגורל למות תאים בתרבית, צפינו הפיכות של אפופטוזיס בשלב מאוחר בטווח של תאים ראשוניים ושורות תאים 12,13. הסרת גירוי המוות אפשרה התאוששות מהתכונות הגלויות של אפופטוזיס, כגון פיצול המיטוכונדריה, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ"א, blebbing קרום פלזמה, חשיפה של phosphatidylserine פני תא, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום, הפעלת caspase, פיצול גרעיני, התכווצות תא, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. תצפיות אלה מעלות שאלות לא פתורות לגבי פונקציות, השלכות, והמנגנונים של Anastasis. כדי לענות על שאלות אלה, תנאי הוא לזהות באופן אמין תאים שעברו Anastasis. כאן אנו מתארים שיטות מיקרוסקופיה חיות וbiosensor caspase לגילוי תאים שהתהפכו אפופטוזיס שלב מאוחר וה בעברen שרד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תאים להדמיה של תא חי

  1. כדי להקל על זיהוי של שינויים מורפולוגיים, לבחור תאים חסיד כגון הלה (קרצינומה של צוואר רחם אנושי) תאים שהם שטוחים על פני המצע לדמיין שינוי של קרום הפלזמה ואברונים תוך-תאיים טוב יותר.
    הערה: ביטול אפופטוזיס נצפה בתאים שונים של היונקים 12,13, כוללים תאי עכבר עיקרי כבד, מקרופאגים עכבר העיקריים, cardiomyocytes עכברוש העיקרי, וגם תא קווים כגון תאים אנושיים כליות עוברי HEK-293T, COS האפיתל כליות קופים ירוקים אפריקאי -7 תאים, HL-1 תאי שריר לב עכבר, עכבר fibroblasts NIH 3T3, חמוס (Mustela putoris furo) תאי CRL1656 המוח, תאי A375 סרטן העור אנושיים, תאי CRL1973 סרטן אשכים אנושיים, תאי H446 אדם קטנים סרטן ריאות תא, סרטן הכבד אנושי תאי HepG2, תאי סרטן השד אנושיים MCF7, תאי סרטן הערמונית אנושיים PC3, ותאי SH-SY5Y נוירובלסטומה אנושיים.
  2. coverslips זכוכית קדם שטיפת כלים תרבית תאי תחתית זכוכית עם אתנול מוחלט לניקוי ועיקור.
    הערה 1: שימוש במנות תחתית כוס מומלץ להתערבות ההפרש לעומת זאת באיכות גבוהה מיקרוסקופיה (DIC), וconfocal ההגדלה גבוה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי העלית (ראה דיון).
    הערה 2: להגדלה גבוהה (40X, 60 / 63X או 100X יעדים ופתחים מספריים גבוהים 1.3 או 1.4), שימוש בצלחות תרבית תאים עם תחתית דקה זכוכית (מ"מ 0.085-.16 עובי) מספקת כבר לא עובדים מרחקי הדמיה (ראה פרוטוקול 3 ).
  3. בהתאם לסוג התא, תרבות מנות תחתית כוס עשויות לדרוש ציפוי עם פולי-ד-ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר), קולגן (פתרון 0.01% ב0.01 M חומצה אצטית) ו / או פיברונקטין (5 מיקרוגרם / מיליליטר) לפני הזריעה תאים.
    הערה: אופטימיזציה של הסוג והריכוז של סוכן ציפוי נדרשת לשורות תאים שונות. תאים הלה יכול לדבוק ישירות על זכוכית ללא ציפוי. עם זאת, חלק מתאים, such כמו HL-1 תאי שריר לב עכבר, לא יכול לדבוק ישירות למשטחי זכוכית, אך דורשים פרוטוקולי תרבות וציפוי ספציפיים 37.
  4. זרע ~ 2-3 x 10 5 תאים על תרבות מנות 35 מ"מ זכוכית מצופה מראש-תא תחתון ולדגור על צלזיוס 37 מעלות (° C) עם 5% CO 2 ליום כדי להשיג confluency 80%.
    הערה 1: תנאים אופטימליים של צפיפות תאים, זמן דגירה, ומצב התרבות יכולים להשתנות בהתאם לסוג התא. confluency הסלולרי יכול להשפיע על התגובה של תאים אפופטוטיים (ראה פרוטוקול 2). בconfluency הגבוה, תאים יכולים להיות פחות רגישים לאותו ריכוזים של גירויים אפופטוטיים.
    הערה 2: הימנע על תאים ומחוברות, כצפיפות תאים גבוהה יכולה לטשטש שינויים מורפולוגיים של תאים בודדים ואברונים.

2. יישום והסרה של תאים אפופטוטיים גירויים

  1. זמן קצר לפני השימוש, מראש לערבב סוכן גרימת אפופטוזיס-עם 37 מעלות מדיום תרבות תא C. אתנול (3.6-4.5כרך% / כרך) שימש כinducer אפופטוזיס בהפגנה הנוכחית.
    הערה 1: נתונים שפורסמו ושלא פורסמו שלנו מראים כי תאים גם יכולים להפוך אפופטוזיס שמופעל על ידי 12,13 גירויים אפופטוטיים אחר, כגון sulfoxide דימתיל (DMSO, 8% / כרך כרך למשך 24 שעות), staurosporine (STS, 0.5 מיקרומטר ל 1 שעה), וטקסול (1 מיקרומטר לשעה 12). אופטימיזציה של מינון לאפופטוזיס מפעילה נדרש עבור סוגים שונים של תאים שונים כדי להשיג את המינון המינימאלי שיכול לגרום לרוב התאים באוכלוסייה לעבור אפופטוזיס.
    הערה 2: Pre-ערבוב סוכנים וישכנע אפופטוזיס עם מדיום תרבית תאים חשוב להימנע מחשיפה אחידה של התאים אפופטוטיים לגירויים.
  2. תמונה קבוצתית של תאי בריאות בצלחת תרבית תאים לפני יישום סוכן גרימת אפופטוזיס-להקים מורפולוגיות בסיסיות.
  3. הסר את המדיום המקורי מצלחת תרבית תאים, ולאחר מכן להחיל 2 מיליליטר סוכן גרימת אפופטוזיס-מעורבב מראש של למנה ללעורר תאים עוברים אפופטוזיס. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2 (או תנאי תרבות נורמלים אחרים).
  4. לאחר דגירה, להתבונן התאים על ידי אור, עלית הקרינה או confocal כדי לפקח על ההתקדמות של תכונות אפופטוטיים.
    (ראה פרוטוקולים 3 ו -4) תאים עוברים אפופטוזיס יציגו סימני ההיכר מורפולוגיות, ביוכימי ומולקולרי של אפופטוזיס שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ וחיישנים ביולוגיים המבוסס על הקרינה: הערה 1.
    הערה 2: זמן דגירה של תאים עם מעוררי אפופטוזיס שונים תשתנה, בהתאם לסוג תא, תנאי תא (כגון confluency ומעמד תזונתי), והמנה של גירוי מוות מיושמת. ייתכן שתהיה צורך טיטרציה זהירה.
  5. כאשר תאים להציג סימני ההיכר של אפופטוזיס, להסיר סוכן גרימת אפופטוזיס-ידי שטיפת התאים פעם אחת עם חמה (37 מעלות צלזיוס, טמפרטורה או תרבות הנורמלית אחרת) תרבית תאים בינונית טריות.
    הערה 1: ככל שתאים אפופטוטיים מחוברים באופן רופף יותרצלחת התרבות, חשוב להדביק ולהסיר בינוניים בעדינות כך שהתאים לא נשטפו.
    ניתן לשחזר תאים תלויים בשידור חי מsupernatant על ידי צנטריפוגה העדינה (מינימום 160 XG ל1) והוסיפו בחזרה לצלחת התרבות: הערה 2.
  6. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 2 מיליליטר / 35 צלחת מ"מ של תרבית תאים בינונית טריות ב 5% CO 2. לחלופין, בינוני שימוש מותנה (מדיום תרבות תא ללא נאסף מהתאים בריאים) כדי לשפר עוד יותר את ההישרדות של תאים אפופטוטיים.
    הערה: כביסה ותאי דוגרים עם מדיום חדש יאפשרו רוב התאים להפוך אפופטוזיס מושרה אתנול לאחר חשיפת אתנול 12,13. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלב זה כביסה כאשר תאים נחשפים לגירויים אפופטוטיים אחרים (ראה דיון).

3. מיקרוסקופית של תא חי

  1. אנו ממליצים על שימוש במיקרוסקופ הפוכה confocal או עלית הקרינה עם בקרה סביבתית (37 ° C,5% CO 2) למיקרוסקופיה תאי חיים.
    הערה: אפשר גם לתמונת התאים באמצעות מיקרוסקופים זקופים עם מטרת טבילה במים. טובלים את המטרה ישירות לתוך מדיום תרבות תאי תמונה. עם זאת, תאים יכולים להיות נמחצו על ידי מטרת הטבילה בהתמקדות.
  2. טרום חם מיקרוסקופ (כגון תא סביבתי שליטה, חממת שלב, ודוד אובייקטיבי) לפחות 2 שעות לפני ההדמיה.
    הערה: זה מאפשר רכיבי מיקרוסקופ כדי להגיע תרמו-שיווי משקל, כך שהוא יכול למנוע את הסחיפה של מיקוד ושינוי של מישור xy עקב ההתרחבות והתכווצות התרמית של הרכיבים.
  3. מניחים צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ של תאים בתרבית (ראה פרוטוקול 1) על הבמה של מיקרוסקופ הפוך וללכוד תמונות תא באמצעות מטרת התכנית-Apochromat 40X או 63X עם צמצם מספרי (NA) 1.3 או 1.4 הדמיה תאים מ תחתית הצלחת דרך coverslips זכוכית.
    הערה: הימנע מהחלה מעל 2 מיליליטר של מדיום35 צלחת תחתית זכוכית מ"מ, כמשקלו של המדיום יכול לגרום עקמומיות של תחתית הכוס, ולכן קשה לתדמית תחום תאים באותו מישור המוקד.
  4. שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס או הטמפרטורה הרגילה המתאימה במהלך תהליך ההדמיה כולו.
    הערה: התהליך של אפופטוזיס, וסביר להניח ההיפוך של אפופטוזיס, תלויה בפעילות האנזימטית רגישה לטמפרטורה. לכן, שמירה על תאים על 37 מעלות צלזיוס (למשל עם במה מיקרוסקופ חממה עליונה) היא חשובה לאורך כל הניסוי. טמפרטורה ירדה יכולה להאט את התגובה אפופטוטיים והתאוששות התגובה לאחר הסרת הגירוי אפופטוטיים.
  5. השתמש במכשיר לחות או להניח נייר שקוף (ראה חומרים) על צלחת התרבות כדי לצמצם את אובדן מים על ידי אידוי מהמדיום.
    הערה: נייר הכסף יכול לשבש את הקוטביות של אור למיקרוסקופיה DIC. שחזור קוטביות על ידי התאמת המקטב בנתיב האור.
  6. לשמור על pH בתרבית תאים בינוני (pH 6.8 -7.3) על ידי דוגרים ב 5% CO 2 עם חדר בקרה סביבתי על המיקרוסקופ.
    הערה: תחזוקת pH במדיום התרבות יכול להיות מושגת גם על ידי הוספת חיץ HEPES, או על ידי שימוש במדיום -independent מסחרי CO 2 (ראה חומרים). תנאים אופטימליים יכולים להשתנות בהתאם לסוג התא.
  7. למזער הקרינה / לייזר (עוצמת אור עירור) חשיפה לתאים במהלך תהליך ההדמיה, כדי למנוע phototoxicity על ידי הפחתת עוצמת הקרינה לרמה הנמוכה ביותר הנדרש כדי להשיג תמונות באיכות גבוהות של תא / מבני subcellular או biosensors הביע (פרטים בפרוטוקול 4).

4. אסטרטגיות לAnastasis זיהוי ומעקב במהלך ולאחר אירועים אפופטוטיים

  1. blebbing פלזמה קרום, עיבוי cytoplasmic, התכווצות תא והיווצרות גוף אפופטוטיים (ראה איורים 1 א - C, E).
    1. בצע diffe תא חי זמן לשגותלעומת זאת rential התערבות (DIC) או מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לעקוב אחר קבוצה של תאי בריאות ולהתבונן המורפולוגיה הנייד שלהם (ראה פרוטוקול 3 למיקרוסקופיה תא חי, וראה דיון).
      הערה 1: להפחית את עוצמת מקור אור להדמית חוזה דסק"ש / שלב, כדי למנוע phototoxicity לתאים.
      הערה 2: אם דסק"ש ומיקרוסקופ לעומת השלב אינו זמינים, להשתמש CellTracker להכתים את cytosol להתוות את המורפולוגיה של תאי חיים עבור מיקרוסקופיה confocal או עלית הקרינה ולפקח על המורפולוגיה של התאים.
    2. החל גירוי מוות של תאים כדי לעורר תאים עוברים אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2 ליישום וההסרה של גירויים אפופטוטיים).
    3. שים לב לסימני היכר תאים שטופלו מורפולוגיים של אפופטוזיס כגון blebbing פלזמה קרום, עיבוי cytoplasmic, התכווצות תא והיווצרות גוף אפופטוטיים (איורים 1 א, 1 ב, 1 ג, 1E).
    4. לשטוף את גירויי מוות, ותאים מחדש אספקה ​​עם מדיום חדש כאשר התאים displaסימני ההיכר מורפולוגיות y של אפופטוזיס.
      הערה 1: החל גירוי מוות של תאים או שינוי מדיום תרבית תאים על הבמה מיקרוסקופ במהלך הדמיה תא חי זמן לשגות יכול להיות מושגת על ידי שימוש בתא תרבית תאי זלוף, או יכול להתבצע ישירות על צלחת תרבית תאים על ידי pipetting בזהירות בלי לגעת הצלחת, במרווחים בין ההדמיה.
      הערה 2: מערכות פיצוי להיסחף מוקד השתמש כדי למנוע מחוץ לפוקוס של התאים עקב אובדן תרמו-שיווי משקל של מערכת מיקרוסקופ לאחר שינוי מדיום תרבית תאים (ראה דיון).
    5. הזמן לשגות הדמיה רציפה כדי לעקוב אחר גורלם של תאים המציגים סימני ההיכר של אפופטוזיס. תאים שיכולים להפוך אפופטוזיס לתקן את הנזק ולהחזיר את נורמלי מורפולוגיה שטוחה (איורים 1 א, 1 ב, 1 ג, 1E).
  2. פיצול מיטוכונדריאלי, DNA / עיבוי הכרומטין, ופיצול גרעיני (ראה 1D דמויות, 1F, 1G).
    1. כדי להמחיש mitochondריה, תאי כתם עם 50 ננומטר צבע MitoTracker אדום / אדום עמוק / ירוק-ניאון, ובו זמנית להכתים את הגרעין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר של 33342 צבע גרעיני הכחול Hoechst במדיום התרבות במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
      הערה 1: להפחית את הריכוז של צבעים ומשך הדגירה, כדי למנוע cytotoxicity ולהפחית הקרינה רקע כאשר צורך. לייעל את התנאים מכתים לקבל אות טובה יחס רעש עם הכמות המינימלית של צבע ודגירת זמן לצביעה.
      הערה 2: השתמשו בכתמי ניאון למיטוכונדריה כגון MitoTracker האדום CMXRos, MitoTracker Deep Red FM, או MitoTracker הירוק FM, שלא ידלפו החוצה מן המיטוכונדריה באפופטוזיס. זה מאפשר הדמיה מורפולוגיה של המיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס וAnastasis. ראה חומרים וציוד לשולחן פרטים על הכתמים האלה.
    2. שמור את התאים מוכתמים בחושך כדי למנוע photobleaching.
    3. להסיר את הכתם עודף על ידי שטיפת התאים3 פעמים עם 37 מעלות פוספט-חיץ C פתרון או בינוני תרבית תאים טריות (PBS), עם דגירה 1 דקות במדיום החדש בין כל שטיפה, ולאחר מכן דגירה נוספת במדיום החדש עבור 20 דקות לפני השטיפה הסופית כדי לאפשר מוגזם כתמים כדי לצאת מהתאים כדי להפחית את רקע אות שאינה ספציפי להדמיה.
      הערה: לקצר דגירה פעמים עם מדיום סלולארי לאחר הצביעה עלולה לגרום רקע גבוה להדמיה.
    4. לבצע בזמן אמת confocal תא חי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי העלית לתאים בריאים תמונה לפני גיוס אפופטוטיים מוחל (ראה פרוטוקול 3 למיקרוסקופיה תא החי).
      הערה: תאים בריאים להציג המיטוכונדריה צינורי וגרעינים עגולים ברוב סוגי תאים (1D דמויות, 1F, 1G).
    5. לעורר תאים עוברים אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2 ליישום וההסרה של גירויים אפופטוטיים לתאים).
    6. המשך זמן לשגות מיקרוסקופי תא חי להתבונן שינויים בmorpholog המיטוכונדריה והגרעיניIES מייד לאחר גירוי המוות מוחל על התאים. שים לב תאים להציג סימני ההיכר של אפופטוזיס כגון פיצול המיטוכונדריה ונפיחות, עיבוי הכרומטין ופיצול גרעיני, בניגוד לתאים הבריאים בו מוצגות המיטוכונדריה צינורי וגרעינים עגולים.
    7. כאשר תאים להציג סימני ההיכר של אפופטוזיס, לשטוף ולספק תאים עם מדיום חדש, ולהמשיך זמן לשגות הדמיה כדי לעקוב אחר גורלם של תאים. תאים שלהפוך אפופטוזיס להחזיר המיטוכונדריה נורמלית ומורפולוגיה גרעינית (1D דמויות, 1F, 1G).
      הערה: בצע מיקרוסקופיה DIC במקביל כאשר ניתן לקבל מידע נוסף על גישה לשלבים של אפופטוזיס על ידי התבוננות השינויים של מורפולוגיה של תאים באותה הקבוצה של תאים (ראה פרוטוקול 4.1 למיקרוסקופיה DIC).
  3. איתור של שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום C תוך שימוש בתאים ביציבות להביע היתוך -GFP ציטוכרום C יחסי ציבורotein (ראה איור 2).
    1. תאי כתם יציבות להביע ציטוכרום C -GFP 23,24 עם MitoTracker האדום לתייג המיטוכונדריה תא מקוטבת (ראה צעדים 4.2.1 ל4.2.3 עבור מכתים המיטוכונדריה תא חי).
    2. בצע מיקרוסקופיה confocal התא חי או עלית הקרינה בזמן אמת כדי לעקוב אחר תאים בריאים (פרטים בפרוטוקול 3 להדמית תא חי).
      הערה: אות -GFP ציטוכרום C localizes בעיקר במיטוכונדריה של תאים בריאים (2A דמויות i, 2B).
    3. לעורר תאים עוברים אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2 ליישום וההסרה של גירויים אפופטוטיים לתאים). המשך מיקרוסקופיה זמן לשגות להתבונן טרנסלוקציה של -GFP ג ציטוכרום מן המיטוכונדריה לcytosol (איורים 2Aii-iii, 2B).
      הערה: שחרור מיטוכונדריאלי של ציטוכרום C לתוך cytosol הוא סמן של permeabilization קרום החיצוני של המיטוכונדריה (MOMP)4, שלב קריטי באפופטוזיס המיטוכונדריה תלויה 21,22
    4. כאשר תאים להציג את אות -GFP ציטוכרום C בציטופלסמה, להסיר את גירוי המוות של תאים, ותאי אספקה ​​עם מדיום חדש (ראו פרוטוקול 2). המשך זמן לשגות הדמיה כדי לעקוב אחר גורלם של תאים עם GFP cytosolic.
      הערה: תאים שלהפוך אפופטוזיס להחזיר מורפולוגיה של תאים נורמלים, ולהפחית את אות -GFP cytosolic ציטוכרום C ככל הנראה דרך השפלה או טרנסלוקציה חזרה למיטוכונדריה (איורים 2Aiv-vii, 2B).
    5. צלם תמונות דסק"ש במקביל לקבלת מידע נוסף לגישה השלבים של אפופטוזיס על ידי התבוננות שינויים במורפולוגיה תא בתאים בודדים או קבוצה של תאים (ראה פרוטוקול 4.1 למיקרוסקופיה DIC).
  4. זיהוי של פעילות caspase באמצעות biosensor caspase (ראה איור 3)
    1. תאי Transfect עם biosensor caspase NES-DEVD-YFP-NLS ל16 עד 24 שעות לפני העמדתם לגירוי אפופטוטיים 13.
    2. להכתים את תרבויות transfected עם Hoechst 33342 לתייג גרעין תא (ראה צעדים 4.2.1 ל4.2.3 עבור מכתים גרעיני תא חי).
    3. בצע מיקרוסקופיה confocal התא חי או עלית הקרינה בזמן אמת כדי לעקוב אחר תאים בריאים (פרטים בפרוטוקול 3 להדמית תא חי).
      הערה: אות biosensor NES-DEVD-YFP-NLS localizes בעיקר בcytosol של תאים בריאים בשל האות הגרעינית יצוא (NES) (איורים 3 א, 3Bi ו3C, ראו דיון).
    4. לעורר תאים עוברים אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2 ליישום וההסרה של גירויים אפופטוטיים לתאים). המשך מיקרוסקופיה זמן לשגות להתבונן טרנסלוקציה הגרעינית של YFP.
      הערה: הפעלה של דבק caspases מוטיב DEVD בbiosensor caspase NES-DEVD-YFP-NLS, וכתוצאה מכך טרנסלוקציה YFP-NLS מcytosol לגרעין (האיורים 3 א, 3Bii-iv, ראה דיון).
    5. כאשר תאים להציג YFP הגרעיני, להסיר את הגירוי אפופטוטיים, ותאי אספקה ​​עם מדיום חדש (ראו פרוטוקול 2).
      הערה: תאים שלהפוך אפופטוזיס להחזיר מורפולוגיה של תאים נורמלים, אך נשמר האות הגרעינית YFP (איורים 3Bv-x, תאי 1 ו -2, ו3D).
    6. המשך זמן לשגות הדמיה כדי לעקוב אחר גורלם של תאים המציגים YFP הגרעיני.
      הערה: אות YFP הגרעינית תהפוך כמה שעות מושפלת לאחר התאים הפוכים אפופטוזיס (3B דמויות, vi-x, תא 1, ראה תוצאות ודיון) ככל הנראה באמצעות מנגנוני אישור תא נורמלים כגון השפלה פרוטאזום.
    7. צלם תמונות דסק"ש במקביל לקבלת מידע נוסף לגישה השלבים של אפופטוזיס על ידי התבוננות שינויים במורפולוגיה תא בתאים בודדים או קבוצה של תאים. (ראה פרוטוקול 4.1 למיקרוסקופיה DIC).
  5. חשיפה של phosphatidylserine פני תא (ראה איור 4)
    1. תאי זרע בGLהתחת coverslips להשיג 80% confluency תא (ראה 1 לפרוטוקול).
    2. Co-להכתים את התאים עם MitoTracker אדום-הניאון וכתם Hoechst 33342 כחול למיטוכונדריה וגרעינים, בהתאמה (ראה צעדים 4.2.1 ל4.2.3 להמיטוכונדריה תא חי והכתמה גרעינית).
    3. לעורר תאים עוברים אפופטוזיס באמצעות inducer אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2).
    4. החל V Annexin שכותרתו ניאון (ראה חומרים) להכתים תאים אפופטוטיים 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני הסרת inducer אפופטוזיס לזהות חשיפה של phosphatidylserine על פני השטח של תאים אפופטוטיים.
      הערה 1: תאים בריאים אינם מוכתמים עם Annexin V phosphatidylserine כי בדרך כלל מוחרם על-הפנימי העלון של קרום הפלזמה תא 38. תאים אפופטוטיים מגואלות V Annexin, אשר נקשר phosphatidylserine על פני תא (איורים 4 א ו -4 ב).
      הערה 2: V Annexin שכותרתו פלורסנט יכול להיות מיושם גם להכתים תאים אפופטוטיים IMMediately לאחר הסרת inducer אפופטוזיס, עם דגירה 10 דקות.
    5. הסר גירוי מוות של תאים, לשטוף את התאים המוכתמים עם PBS החם או בינוני טרי פעם אחת, ולאחר מכן לספק תאים עם מדיום חדש לשעה 2 ב 37 ° C עם 5% CO 2 (ראה פרוטוקול 2).
      הערה 1: תאים שהתהפכו אפופטוזיס להחזיר מורפולוגיה נורמלית ולשמור אות V Annexin שכותרתו fluorescently לאחר שהשיב את המורפולוגיה נורמלית (איורים 4 א, ​​ו -4).
      הערה 2: אות V Annexin פוחתת עם זמן בתאים התאוששו (ראה דיון).
    6. תקן תאים בנקודות זמן שנבחרו עם paraformaldehyde 4% המכיל סוכרוז 8% ב1x PBS במשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת חדר, ולשטוף את התאים הקבועים עם PBS במשך 3 פעמים כדי להסיר paraformaldehyde לפני ההרכבה תאים בשקופיות זכוכית coverslips עם antifade mountant (ראה חומרים) למיקרוסקופיה confocal או עלית הקרינה ולבחון V Annexin בתאים לאחר הסרת inducer אפופטוזיס.
      הערה 1: סוכרוז במקבע משמרת מבנה קרום תא בקיבעון.
      הערה 2: אחסן את פתרון paraformaldehyde בחושך ב 4 ° C כדי למנוע השפלה.
      הערה 3: לחמם את פתרון paraformaldehyde לטמפרטורת חדר לפני היישום זה לתאים לקיבעון, כדי למנוע הלם קר לתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לחקור את ההיפוך של אפופטוזיס, תאים בתרבית רקמה חשופים ראשון לגירוי מוות כדי לעורר אפופטוזיס. כאשר התאים להציג סימני ההיכר של אפופטוזיס, מדיום תרבות הטרי מוחל אז לשטוף את הגירוי ולאחר מכן דגירה התאים המתים כדי לאפשר התאוששות (איור 1 א). כאן, שאלת המפתח שפונים היא כמה רחוק תאים בתרבית למות אדם יכולים להתקדם לאפופטוזיס ועדיין עוברים Anastasis. שאלה זו ניתן לענות בודאות על ידי ניטור רציף עם סמנים ביולוגיים לעקוב אחר גורל תא באמצעות השיטות מתוארות להלן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Anastasis מתייחס לתופעה שבה תאים שהופעלו מסלול המוות של תאים לאחר מכן להפוך את תהליך הגסיסה ולשרוד. הנה, יש לנו הראינו שהדמית תא חי יכולה לשמש כדי לאשר שאותם תאים בודדים למעשה יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים בשלב מאוחר, ולאחר מכן להמשיך ולשרוד ולהתרבות. הפרוטוקולים שלנו לתאר כמה תנאי טיפול ספציפי לסוג תא מותאם כדי לגרום לאפופטוזיס ולאפשר חלק גדול מהתאים לעבור ההיפוך של אפופטוזיס במעקב עם כמה סמנים ביולוגיים לאימות. בעניינים טכניים, מנות תחתית זכוכית שמשו לתאי תרבות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לכומר ד"ר ראלף Bohlmann וכומר ד"ר ג'יימס Voelz למציעים את המילה "Anastasis" כדי לתאר את ההיפוך של אפופטוזיס; דאגלס ר 'ירוק לתאים הלה ביציבות להביע ציטוכרום C -GFP; Charles M. רודין ואריק א גרדנר לH446 תאים; הת'ר כבש לסיוע בציור קריקטורה בווידאו; איי הואי Yeo לדיון חשוב של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי אדוארד Youde זיכרון מלגת סר (HLT), מלגת ד"ר וולטר Szeto הזיכרון (HLT), מענק פולברייט 007-2,009 (HLT), מלגת מדעי חיים קרן המחקר (HLT), NIH מעניק NS037402 (JMH) וNS083373 (JMH), וועדת מענקי אוניברסיטת הונג קונג AoE / B-07/99 (MCF). הו Lam טאנג הוא קרן עמית Shurl וקיי קורצ'י של מדעי החיים קרן המחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
LSM780 מיקרוסקופיה קונפוקליתCarl Zeiss
צלחת תרבות תחתונה מזכוכיתMatTek CorporationP35G-0-14-C
כת שקופה FoiCarl Zeiss000000-1116-084
CO2 עצמאיבינוני Life Technologies18045-088
CellTrackerLife TechnologiesC34552
Mitotracker אדום CMXRosLife TechnologiesM-7512
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399
נספח עם תווית פלואורסצנטית VBiovisionK201

מקורות

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680(2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הפיכת אפופטוזיסמיקרוסקופיה של תאים חייםביו-סנסור לקספאזצביעה מיטוכונדריאליתצביעה גרעיניתדימוי במרווחי זמן (Time-Lapse)גירוי למות תאיםהתאוששות מורפולוגיתשחרור ציטוכרום C
אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.