Method Article

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

DOI:

10.3791/52009

⸱

October 28th, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Division of Hematology, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology, The Children's Hospital of Philadelphia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מהדם היקפי באמצעות אסטרטגית תכנות מחדש episome מבוסס ומעכבי היסטון deacetylase.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מדגים פרוטוקול ליעילות יצירת תאים ללא אינטגרציה אנושית הנגרם גזע pluripotent (iPSCs) מהדם היקפי באמצעות פלסמידים episomal וdeacetylase היסטון מעכבים (HDAC). היתרונות של גישה זו כוללים: (1) השימוש בכמות מינימאלית של דם היקפי כחומר מקור; (2) nonintegrating וקטורי תכנות מחדש; שיטה חסכונית ליצירת iPSCs החופשי וקטור (3); transfection יחיד (4); ו- (5) השימוש במולקולות קטנות כדי להקל על תכנות מחדש אפיגנטיים. בקצרה, תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) מבודדים מדגימות לקיחת דם שגרתיות ולאחר מכן בתרבית גורמי גדילה מוגדרת להניב אוכלוסיית תא אב כדורית אדומה שגשוג מאוד כי להפליא ניתן לתכנות מחדש. Nonintegrating, פלסמידים episomal nontransmissible להביע Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, וסיכת ראש קצרה RNA p53 (SH) הם introduCED לerythroblasts נגזר באמצעות nucleofection יחיד. Cotransfection של episome שמבטא משופר חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) מאפשר זיהוי קל של תאי transfected. פלסמיד כפול מחסרת נפרד להביע אפשטיין-באר אנטיגן הגרעיני 1 (EBNA1) הוא גם הוסיף לתערובת התגובה לביטוי מוגבר של חלבוני episomal. אז תאי transfected הם מצופים על שכבת פיברובלסטים עכבר המוקרן עובריים (iMEFs) לתכנות מחדש המשיך. ברגע שהמושבות כמו-iPSC מופיעות בכ-עשרה ימים לאחר nucleofection, מעכבי HDAC מתווספים למדיום כדי להקל על שיפוץ אפיגנטיים. מצאנו כי הכללת מעכבי HDAC באופן שגרתי מגבירה את הדור של מושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא על ידי 2 קיפול. ברגע שמושבות iPSC להציג מורפולוגיה טיפוסית של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC), הם מועברים בעדינות לצלחות אישיות מצופות iMEF רקמת תרבות לצמיחה והתרחבות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSCs נגזרים מרקמות סומטיות באמצעות ביטוי חוץ-רחמי של מספר מינימלי של גני pluripotency. טכניקה זו הייתה בתחילה הודגמה על ידי התמרה retroviral של פיברובלסטים אנושיים עם Oct4, Sox2, KLF4, וcMYC, אשר באות לידי ביטוי ביותר במדינת pluripotent 1. זמנית הביעו "גורמי תכנות מחדש" אלה לשנות את פרופיל הביטוי של תא המטרה אפיגנטיים נוף והגן דומה לתאי גזע עובריים אנושיים 2. לאחר שנוצר, iPSCs יכול להיות מובחן פוטנציאלי לכל סוג רקמה לחקירה נוספת. כך, יש להם הבטחה לשימוש ברפואת רגנרטיבית, דוגמנות מחלה, ויישומי ריפוי גנטי. עם זאת, לשבש את הגנום עם וירוסי שילוב יש את הפוטנציאל לשנות את ביטוי הגנים אנדוגני, פנוטיפ הסלולר השפעה, וסופו של דבר מטה את תוצאות מדעיות. יתר על כן, אינטגרציה נגיפית אקראית יכולה להוביל לדואר סלולארי מזיקffects, כולל האפשרות לשינוי ממאיר 3 מחדש או ביטוי של הגנים המושתלים שעור 4. יישומים קליניים בעתיד ידרשו דור iPSC-שילוב שאינו.

Episomes, שהם מולקולות הדנ"א בכרומוזומים מעגליים נוספות, מציע אסטרטגיה ליצירת iPSCs חסכוני, ללא אינטגרציה 5. השילוב של וקטורי episomal מוצגים בטבלה 1 להביע את תכנות מחדש של גורמי Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, וLIN28A. פלסמיד pCXLE_hOCT3 / 4 shp53-F מכיל גם p53 shRNA לדיכוי זמני של TP53 כדי לשפר את תכנות מחדש של תאי 6. וקטור pCXWB-EBNA1 חסר השכפול מקדם הגברה של גורמי תכנות מחדש ויעילות תכנות מחדש מוגברת על ידי מתן עלייה זמנית בביטוי EBNA1 7. פלסמיד pCXLE_EGFP ניתן להוסיף לתערובת nucleofection לצורך Determining יעילות transfection או ליישומי מיון תא. למעט CXWB-EBNA1 p, פלסמידים episomal שימוש בפרוטוקול זה מכילים את מקור נגיף אפשטיין-באר בשכפול נגיף וגן EBNA1, אשר מתווך שכפול וחלוקת episome במהלך חלוקת התא המארח 8. Episomes באופן ספונטני לאיבוד עם התרחבות iPSC רצוף 7. Subcloning ואפיון של iPSCs עם אובדן וקטור episomal, שניתן להסיק מאובדן של ביטוי eGFP, יכולים להוביל ללחלוטין iPSCs החופשי אינטגרציה ליישומים קליניים בעתיד.

טבוע בתהליך של דור iPSC הוא דיכוי של גנים ספציפיים שושלת והפעלה מחדש של גנים הקשורים pluripotency. רגולציה של ביטוי גנים מתרחשת במספר הרמות בתוך הגרעין, ובכלל זה שינויים ב- DNA והכרומטין כדי לאפשר גורמי שעתוק, רצפי דנ"א רגולציה, וגישה RNA פולימראז למקדגנים. עיצוב מחדש של הנוף ההתווצרותי באמצעות שינויי הכרומטין הגלובליים הוא מרכיב מרכזי מחדש ביטוי של התכנית הגנטית pluripotency. שינוי הכרומטין ספציפי שהוא חשוב בויסות של ביטוי גנים הוא acetylation של ההיסטונים בשאריות ליזין מסוימים, המאפשר גישה ליעד גנים באמצעות מתח נמוך יותר של סליל היסטון-DNA. מעכבי HDAC הם מולקולות קטנות אשר הוכחו כדי לשפר את תכנות מחדש iPSC וhESC התחדשות עצמית 9,10, ככל הנראה בשל תמיכה מדינת acetylated 11. הפרוטוקול המתואר להלן, שהותאם מפרסום קודם באמצעות lentiviruses שילוב 12, מספק שיטת צעד-אחר-צעד לדור iPSC מותאם מepisomes באמצעות דם היקפי ומעכבי HDAC. ריכוזי מעכב HDAC משמשים כאן הם חצי מאלה המתוארים על ידי ור, et al 9., והובלתי באופן שגרתי לעלייה של 2 לקפל במושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא על תקןפרוטוקולי תכנות מחדש episomal ללא מעכבי HDAC. רמה זו של תכנות מחדש היא באחידות עם היעילות שאנו רואים עם שיטות lentiviral. שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו ביעילות שנוצר iPSC מאנשים זקנים כמו 87 שנים של גיל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב הסכמה מדעת, כפי שאושר על ידי ועדות הביקורת המוסדית של המרכז לחקר סרטן פרד האצ'ינסון והילדים "בית החולים של פילדלפיה של, התקבל מחולים לפני איסוף דגימות דם היקפיים. כל ההנחיות מוסדיות נצפו. כל הניסויים בבעלי החיים, כולל דור MEF ו היווצרות תפלצת אושרה על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים.

1. הפרדת Ficoll של PBMCs והרחבת Erythroblasts - יום 0

  1. לדלל דם היקפי 1: 1 עם בופר פוספט של Dulbecco (DPBS). בתוך צינור קלקר מסביב לתחתית 15 מיליליטר, שכבה בזהירות 7 מיליליטר של דם מדולל על 3 מיליליטר של בטמפרטורת חדר Ficoll-Hypaque.
  2. צנטריפוגה המדגם ב 400 XG למשך 30 דקות.
  3. PBMCs תהיה התיישבו לממשק בין הפלזמה וFicoll-Hypaque, נתפס כשכבת לבנה מעונן. בעזרת פיפטה העברת סטרילי, לאסוף את PBמנחים לתוך צינור חרוטי אחד 15 מיליליטר. תביא את הנפח ל 10 מיליליטר באמצעות DPBS.
  4. באמצעות hemacytometer, לספור את PBMCs.
  5. פיפטה 2 × 10 6 PBMCs לתוך צינור נפרד 15 מיליליטר חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. ספין למטה תאים וההקפאה נותרו בריכוז של 2 × 10 6 מיליליטר / PBMCs ב -90% בסרום שור העובר (FBS) sulfoxide דימתיל / 10% (DMSO).
  6. הכן הרחבה בינונית: מדיום חופשי QBSF-60 בסרום (להגן מפני אור) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + חומצה אסקורבית (50 ng / ml) + גזע גורם תא (SCF, 50 ng / ml) + interleukin 3 (אִי- גורם 3, 10 ng / ml) + אריתרופויאטין (EPO, 2 U / ml) + אינסולין כמו צמיחה 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + דקסמתזון (1 מיקרומטר; להגן מפני אור; להפשיר aliquot טרי בכל אמצעי תקשורת לשנות).
  7. Resuspend 2 × 10 6 PBMCs 2 מיליליטר של הרחבה בינונית טריה ומקום לתוך אחד היטב צלחת תרבות 12 רקמות היטב דגירה בחממה humidified 37 ° C עם אווירה של 5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2.
  8. ביום 3 ויום 6, להחליף תקשורת.
    1. לאסוף את התאים ולשטוף היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60 כדי לאסוף את כל תאים שנותרו.
    2. צנטריפוגה ההשעיה תא XG ב 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant.
    3. Resuspend התאים 2 מיליליטר של מדיום הרחבה החדש ולהחזיר אותם לאותה הצלחת גם 12.

2. תאי תכנות מחדש על ידי nucleofection - יום 9

  1. פיפטה פלסמידים תכנות מחדש לתוך צינור סטרילי 1.5 מיליליטר אפנדורף (טבלת 1).
  2. מערבבים את פתרון nucleofection עם תוספת (שסופק על ידי יצרן) וטפטפתי לתוך צינור אפנדורף 1.5 מיליליטר סטרילי.
  3. פיפטה 2 מיליליטר של הרחבה בינונית ולאחת מצלחת גם 12 ומקום בחממה 37 מעלות צלזיוס humidified (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) לאיזון לפני הוספת תאים.
  4. אסוףתאים בתרבית ולשטוף היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60 לאיסוף תאים שנותרו.
  5. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant.
  6. לשטוף את התאים על ידי resuspending ב 5 מיליליטר של DPBS וצנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות.
  7. לשאוב supernatant.
  8. Resuspend התא גלולה בפתרון nucleofection + תוספת 100 μl, לטפל כדי למנוע בועות יצירה.
  9. פיפטה ההשעיה התא לתוך הצינור המכיל פלסמידים תכנות מחדש, פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת, ופיפטה המדגם לתוך החלק התחתון של קובט nucleofection.
  10. הנח את קובט לתוך מכשיר nucleofection ולהפעיל תכנית T-019.
  11. העברת הרחבת prewarmed בינונית (מצלחת equilibrating בשלב 2.3) 100 μl לקובט nucleofection.
  12. מייד לאסוף את כל מדגם והפקדה לתוך הבאר של הרחבה בינונית מחוממת מראש. הימנע מאיסוף הפסולת הלבנה, צף המתה התא.
  13. מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) לצמיחה.

3. תאי מזין ציפוי - יום 10 או 11

  1. ביום 10, תאים מזינים צלחת.
    1. צלחת מעיל אחד 6 גם תרבית רקמה עם ג'לטין.
      1. פיפטה 1 ג'לטין מ 'של 0.1% בנאגרו מלוח הפתרון של האנק (HBSS) לבאר כל הצלחת.
      2. מניחים את הצלחת 37 מעלות צלזיוס חממת humidified במשך לפחות 5 דקות.
      3. מייד לפני השימוש, לשאוב את פתרון ג'לטין מהצלחת.
    2. להפשיר בקבוקון אחד של 2 fibroblasts העוברי × 10 6 עכבר מוקרן ב3,000 cGy ל -10 מיליליטר של MEF מדיה prewarmed (הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%)).
    3. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant. Resuspend התאים 12 מיליליטר של MEF מדיה ופיפטה 2 מיליליטר in כדי היטב בכל 6 הצלחת גם ג'לטין מצופה. מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) עד ליום 12.

4. תאי ציפוי בתאים מזין ושינוי בינוני - יום 12

  1. לאסוף את תאי nucleofected לאחת צינור חרוטי 15 מ"ל ולאסוף את כל תאים שנותרו על ידי שטיפה היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60. צנטריפוגה המדגם XG ב 300 במשך 5 דקות.
  2. הכן תכנות מחדש בינוני: של Iscove השתנה בינוני של Dulbecco (IMDM) + FBS (10%) + L-גלוטמין שאינם בעלי חיים (1 מ"מ) + שאינו חיוני חומצות אמינו (NEAA, 1%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + β -mercaptoethanol (0.1 מ"מ) + גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, הוסיף טרי בהאכלה, 10 ng / ml) + חומצה אסקורבית (הוסיף טרי בהאכלה, 50 מיקרוגרם / מיליליטר).
  3. לשאוב supernatant וresuspend התאים 12 מיליליטר של תכנות מחדש בינוני. פיפטה 2 מיליליטר לכל טוב של ההשעיה התא לתוךצלחת 6 היטב של תאים מזינים (כפי שהוכן בסעיף 3). צנטריפוגה את הצלחת ב 50 XG למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
  4. מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) לצמיחה. לשנות את תכנות מחדש בינוני בכל יום אחר עד מושבות iPSC מתחילות להופיע (1-2 שבועות).
  5. הכן hESC בינוני: DMEM / F12 1: 1 + החלפת נוק סרום (20%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + NEAA (1%) + L-גלוטמין שאינם בעלי חיים (1 מ"מ) + פירובט נתרן (1%) + סודיום ביקרבונט (0.12%) + β-mercaptoethanol (0.1 מ"מ) + bFGF (הוסיף טרי בהאכלה, 10 ng / ml)
  6. הכן מעכבי HDAC: וטיראט נתרן (הוסיף טרי בהאכלה, 100 מיקרומטר), חומצת suberanilohydroxamic (סח"ה, הוסיפה טרי בהאכלה, 200 ננומטר). ברגע שמושבות iPSC מופיעות, להתחיל להאכיל את התאים עם מעכבי hESC בינוני + HDAC, שינוי בינוני בכל יום.
    הערה: בוטיראט נתרן הוא מולקולה קטנה שנספחה לצינורות פלסטיק, therefore לאחסן אותו בצינור זכוכית בורוסיליקט על 4 מעלות צלזיוס.

5. משובט בידוד iPSC

  1. ברגע שמושבות iPSC הם גדולות מספיק כדי להיות מבודדים (20-25 תאים), לאסוף אותם עם טפטפת P20.
  2. הכן מעכבי HDAC: וטיראט נתרן (הוסיף טרי בהאכלה, 100 מיקרומטר), סח"ה (הוסיף טרי בהאכלה, 200 ננומטר)
  3. הנח את המושבות מבודדות על iMEFs ב -35 מנות מ"מ בודדות המכילות מעכבי hESC בינוני + HDAC + תוספת שיבוט ושחזור.
  4. היום לאחר קטיף המושבות, לשנות את המדיום למעכבי hESC בינוני + HDAC.
  5. לשנות את המדיום כל יום עד מושבות iPSC מוכנות לpassaging.
  6. הסר מעכבי HDAC מהמדיום פעם אחת מושבות יתייצבו במעבר 2-3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלושה ימים לאחר nucleofection ולפני ציפוי תאי nucleofected על iMEFs, את היעילות של nucleofection המוצלח צריכה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לeGFP. איור 1 מציג ניסוי nucleofection טיפוסי עם כ 5-10% מאוכלוסיית התא הכוללת להביע eGFP.

מושבות iPSC תכנות מחדש יתחילו להופיע כשבועיים לאחר nucleofection. המושבות הן בדרך כלל עגולות עם גבולות מוגדרים היטב וניתן לזהות על ידי מורפולוגיה hESC אופיי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור דור iPSC מוצלח בעת שימוש בפרוטוקול זה, יש כמה אזהרות חשובות שיש לקחת בחשבון. בשלב התרחבות erythroblast, לוח הזמנים של שינוי התקשורת צריך להיות רק אחריו, כסטיות עלולות להוביל לגירוי לא יעיל של אוכלוסיית תא אב היעד ויעילות נמוכה יותר של דור iPSC. זה חשוב לעשות בינוני הרחבה חדשה עם dexamethasone הטרי עם כל שינוי תקשורת; ובינוני בסיס QBSF-60 ודקסמטזון צריכים להיות מוגן מפני אור במהלך האחסון. במהלך nucleofection, לשטוף DPBS הוא קריטי כדי להסיר מומסים עודף מהשעית התא שעלול לגרום לז...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות מענקי מ- NIH הבאים לתמיכה במחקר זה: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), וK12HL0806406 (SKS); וקרן JP מקארתי (AR).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PLUSFisher Scientific45-001-750יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
חנות DPBSLife Technologies14190-250ב-4 מעלות צלזיוס.
RPMI 1640Life Technologies11875-093חנות ב-4 מעלות צלזיוס.
סרום בקר עוברי (FBS)Life Technologiesחנות 10437028ב-20 מעלות; C עד הצורך. הפשרה, עליון, חנות ב -4 מעלות צלזיוס.
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-Aldrich154938יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
QBSF-60 בינוני ללא סרוםFisher Scientific50-983-234חנות ב -4 מעלות צלזיוס.
פניצילין/סטרפטומיציןLife Technologiesחנות 15140122ב-4 מעלות צלזיוס.
ערכת נוקלאופקטור קו תאים VLonzaVCA-1003חנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
תמיסת ג'לטין 2%Sigma-AldrichG1393חנות ב-4 מעלות; C, נוזל ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)Life Technologies14175-103חנות ב-4 מעלות צלזיוס.
Modified Eagle Medium (DMEM) LifeTechnologies11965-092ב-4 מעלות צלזיוס.
Medium Medium (IMDM)Life Technologies12440-061ב-4 מעלות
L-גלוטמין, 200 מ"מLife Technologies25030-081Aliquot, הקפאה ב-20 מעלות צלזיוס.
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 100XLife Technologies11140-050יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, הרחק מאור.
DMEM/Ham's F12, 1:1חנות פישר סיינטיפיקSH30023.02ב-4 מעלות צלזיוס.
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028Aliquot, הקפאה ב-20 & מעלות צלזיוס.
נתרן פירובט, 100 מ"מLife Technologies11360-070חנות ב-4 מעלות צלזיוס.
נתרן ביקרבונט, 7.5%Life Technologiesחנות 25080094ב-4 מעלות צלזיוס.
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)Life TechnologiesPHG0263הכינו מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-DPBS, להקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
נתרן בוטיראט Sigma-AldrichB5887-1Gהכינו מלאי 2000x (400 מ"מ) ב-DPBS, עליון, הקפאה ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
שיבוט תאי hES & תוסף התאוששותStemgent01-0014-500חנות ב-20 מעלות; C עד הצורך. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
מטריגל BD מוסמך ESCBD Biosciences35-4277מפשיר לילה על קרח ב-4 מעלות; C, מכניסים לצינורות מקוררים מראש באמצעות קצות פיפטה מקוררים מראש. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד הצורך. הפשרה ב-4 מעלות; ג, יש להשתמש מיד.
StemSpan SFEM STEMCELL Technologies9650Aliquot, הקפאה ב-20 מעלות צלזיוס.
חומצה אסקורבית, אבקתSigma-AldrichA4403-100MGהכינו מלאי של 5 מ"ג/מ"ל ב-DPBS, מסנן סטרילי, אחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
גורם תאי גזע אנושי רקומביננטי (SCF)R & D Systems255-SC-010Make 100 μ מלאי g/m ב-SFEM, aliquot, קפוא ב-20 °C. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
אינטרלוקין אנושי רקומביננטי 3 (IL-3)מו"פ & D Systems203-IL-010Make 100 μ מלאי גרם/מ"ל ב-SFEM, aliquot, להקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
אריתרופויטין (EPO)מו"פ & D Systems287-TC-500הכינו מלאי של 1000 U/ml ב-SFEM, להקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
גורם גדילה רקומביננטי דמוי אינסולין אנושי 1 (IGF-1)מו"פ & D Systems291-G1-200Make 100 μ מלאי גרם/מ"ל ב-SFEM, aliquot, להקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
&בטא;-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M7522הכינו מלאי פי 1000 (100 מ"מ) ב-DPBS.
דקסמתזוןסיגמא-אולדריץ'D4902-25MGהכינו מלאי פי 50 (50 μ M) ב-DPBS, מסנן סטרילי, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
SAHA (vorinostat)קיימן כימיקלים149647-78-9הכינו מלאי פי 2,000 (400 מ"מ) ב-DPBS, aliquot, הקפיאו ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
צלחת תרבית רקמות 12 בארפישר סיינטיפיק08-772-29
15 מ"ל צינור חרוטיSarstedt62553002
1.5 מ"ל צינור אפנדורףפישר סיינטיפיק05-408-129
6 צלחת תרבית רקמותבאר פישר סיינטיפיק08-772-1B
35 מ"מ צלחות תרבית tisue BDBiosciences353001
10 מ"ל פיפטות סרולוגיות חד פעמיותפישר סיינטיפיק13-675-20
5 מ"ל פיפטות סרולוגיות חד פעמיותפישר סיינטיפיק13-675-22
2 מ"ל פיפטות סרולוגיות חד פעמיותפישר סיינטיפיק13-675-17
20 μ l קצות פיפטה, קצות מחסוםGenessee24-404
פיפטות פסטר זכוכיתפישר סיינטיפיק13-678-20D
סיוע פיפטהפישר סיינטיפיק13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene27077
pCXLE-hSKAddgene27078
pCXLE-hULAddgene27080
pCXLE-EGFPAddgene27082
pCXWB-EBNA1Addgene37624
חנות של Dulbecco חנות של Iscove צלזיוס.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).
  3. Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).
  4. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  5. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  6. Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).
  7. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  8. Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).
  9. Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).
  10. Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).
  11. Azuara, V., et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).
  12. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).
  13. Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
  14. Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
  15. Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

iPS Cell GenerationEpisomal PlasmidsHDAC InhibitorsPeripheral Blood Mononuclear CellsErythrocyte Progenitor CellsNucleofectionMouse Embryonic FibroblastsIntegration Free iPSCsReprogramming MediumFluorescence Microscopy

Related Articles