מאמר שיטה

טכניקות ניסיוניות והדמיה לבחינת מבני פיברין קריש בבריאה והחולה הברית

DOI:

10.3791/52019

⸱

1 באפריל 2015

 ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכתב יד זה מוצגות טכניקות ניסיוניות, כולל הכנת דם, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח קצב ליזה, לבחינת ההבדלים המורפולוגיים בין מבני קרישים נורמליים וחריגים עקב מצבים חולים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברין הוא חלבון מטריצה חוץ-תאי האחראי על שמירה על השלמות המבנית של קרישי הדם. מחקרים רבים נעשו על פיברין בשנים האחרונות כדי לכלול חקירה של סינתזה, מבנה-תפקוד וליזיס של קרישי דם. עם זאת, עדיין יש הרבה לא ידוע על המאפיינים המורפולוגיים והמבניים של קרישי דם הנובעים מחולים עם מחלה. במחקר זה מוצגות טכניקות ניסיוניות המאפשרות לבחון הבדלים מורפולוגיים של מבני קרישים חריגים עקב מצבים חולניים כגון סוכרת ואנמיה חרמשית. המחקר שלנו מתמקד בהכנה והערכה של קרישי פיברין על מנת להעריך הבדלים מורפולוגיים באמצעות מבחנים ניסיוניים שונים ומיקרוסקופיה קונפוקלית. בנוסף, מתוארת גם שיטה המאפשרת חישוב רציף בזמן אמת של שיעורי הליזיס בקרישי פיברין. הטכניקות המתוארות כאן חשובות לחוקרים ולרופאים המבקשים להבהיר פתולוגיות פקקתיות נלוות כגון אוטם שריר הלב, מחלת לב איסכמית ושבץ מוחי בחולים עם סוכרת או מחלת תאי חרמש.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעה ברירית האנדותל של כלי דם לתיקון דרך התגובה לעצרת הדם, או היווצרות של קריש דם. כאשר דם מחלחל לתוך מטריצת החוץ תאית, גורמי רקמה להפעיל טסיות דם בזרם הדם המאפשרים חניכה של מפל הקרישה. המרכיב המכני המפתח של תהליך ריפוי זה הוא מטריצת הפיברין, מורכבת מסיבי הפיברין שאלסטיות גבוהה, ויכול לקיים כוחות גדולים 1-4. חוקרים רבים חקרו את מבנה המערך, ותפקוד של הפיברין בהרחבה בעשורים האחרונים 5-13.

יש חולים במחלות כגון סוכרת וחרמשית סיכון מוגבר לפתח סיבוכים טרומבוטיים כגון אוטם שריר לב, מחלת לב איסכמית, ומלטף 14-19. מעל 2 מיליון אנשים שאובחנו לאחרונה עם סוכרת בכל שנה בארצות הברית. ישנם שני סוגים של סוכרת: הסוג I, שבוגוף לא מצליח לייצר כמות מספקת של אינסולין, וסוג השני, שבו הגוף הופך עמיד לאינסולין. בקרב חולי סוכרת, מחלות לב וכלי דם (CVD) היא הסיבה ל- 80% מהתחלואה והתמותה הקשורים במחלה 20,21.

מחלה מגל תא (SCD) היא הפרעה גנטית המשפיעה על דם יותר מ -100,000 אנשים בארצות הברית 22. SCD הוא מחלה נקודה-מוטציה שגורמת לתאי דם אדומים להפוך בצורה חצי סהר, מה שהקשה על התאים לעבור בכלי דם הדם 23. שתי מדינות מחלה אלה מגבירים את הסיכוי לפתח תנאי atherothrombotic בגוף. אחת הסיבות לכך היא תוצאה של מבנה הפיברין שינה ותפקוד במצבים חולים 14,24-26.

בשתי הסוכרת ומחלות חרמשית, יש hypercoagulation ופעילות hypofibrinolysis שגורמת atherothrombosis ומחלות לב וכלי דם (CVD), בהשוואה למטופלים בריאים 17,27,28. זה ידוע שhypofibrinolysis מקדם התקדמות טרשת עורקים ומולידה אירועים איסכמיים חוזרים בחולים עם מחלת לב כלילית מוקדמת 29. בכתב היד הנוכחית, החוקרים בחנו את התפקיד של תכונות פיזיות הפיברין בהגדרה המסוימת הזה. מבני קריש הפיברין בחולים שאינם חולים מורכבים מסיבים דקים, נקבוביות גדול, ו14,24 בדרך כלל פחות צפופים. הנקבוביות המוגברת וקרישי פיברין פחות צפופים בנבדקים בריאים נמצאו כדי להקל על פירוק פיברין 16. בתנאי hyperthrombotic כגון מחלת סוכרת תא ומגל, יש עלייה בייצור פיברינוגן, גורמת לריכוז פיברינוגן להגדיל מהרמות נורמליות של 2.5 מ"ג / מיליליטר בחולים בריאים 30-33. קרישי פיברין נוצרו בחולי סוכרת נמצאו להיות פחות נקבובי, נוקשה יותר, יש יותר נקודות סניף, וצפוף יותר בהשוואה למי שאינו dia הבריא,חולי betic 14,24,33-35. מבנה הפיברין שינה הוא תוצאה של מנגנוני glycation המתרחשים בחלבונים מעורבים בהיווצרות קריש דם. glycation Nonenzymatic (בלתי הפיך) מתרחש כאשר מולקולות גלוקוז להיקשר לשאריות ליזין על מולקולת פיברינוגן, אשר מעכבת XIIIa האנושי גורם (FXIIIa) משאריות גלוטמין וליזין cross-linking כראוי 33,36,37.

הניתוח המבני של רשתות הפיברין נחקר בהרחבה לאחרונה. בפרט, חוקרים נצלו את מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזור 3D של רשתות הפיברין 38, חקרו כיצד תאים שני תאי intravascular (אנדותל) וextravascular (fibroblasts ושריר חלק) משפיעים על מבנה הפיברין 39, viscoelastic מנוצלת וניתוח ספקטרלי לנתח מבני הפיברין 40, ו מתאמים מפותחים בין מבנה ליפין ותכונות מכאניות באמצעות ניסוי וחישובי גישות 41 . המוקד של המחקר הנוכחי היה לגבש מבני קריש בתנאים פקקת תא סוכרת ומגל מדומים ולהשתמש במיקרוסקופ confocal לבחינת המבנה ותפקוד של קרישים במדינות נגועות. קרישי פיברין נוצרו מפיברינוגן האנושי, תרומבין האנושי, וFXIIIa. קרישים היו lysed באמצעות פלסמין. כדי לדמות תנאים סוכרתיים, ריכוז מוגבר של פיברינוגן הודגרה בפתרון גלוקוז כדי לגרום במבחנת glycation פיברינוגן. כדי לדמות תנאי קרישת מחלה חרמשית, ריכוזי פיברינוגן מוגברים היו מעורבים עם המטוקריט חרמשית שנאסף מחולים כפי שנעשה בעבר על ידי הקבוצה שלנו 42. שיטות אלה שמשו לבדיקת המבנה והפונקציות מעורבות בהיווצרות קריש הפיברין ופירוק פיברין בתנאים חולים, כמו גם את המנגנונים שגורמים לCVD. בהתבסס על מידע נוכחי על מחלות אלו, מבני קריש הפיברין Glycated היו צפופים יותר עם פחותnd נקבוביות קטן יותר. קרישי פיברין עם תאי דם אדומים של חולי אנמיה חרמשית (RBCs) היו גם צפופים ומוצגים אגרגציה של תאי הדם האדומים ואשכולות הפיברין מגובבים. זוהי תופעה מבוססת היטב כי כבר נקבעה בעבר 43. כמו כן, החוקרים שיערו כי שיעור הפירוק פיברין יהיה נמוך באופן משמעותי בקרישי פיברין Glycated עם ובלי פלסמין המופחת בהשוואה ליפין בריא, נורמלי. התוצאות הראו כי לקרישי פיברין Glycated, תוצאות שיעור תמוגה שונות באופן משמעותי נצפו רק בתנאים של ריכוז פלסמין מופחת. טכניקה ניסויית זו של שימוש במיקרוסקופ confocal מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות הדמיה אחרות, כי התאים והחלבונים להישאר במדינה האם שלהם, המאפשרת הלכידה וידאו של פעילות הקרישה בזמן אמת. שיטה זו של קרישה סינטטי התרמה היא גם זולה יותר ויעילה יותר זמן מאשר קבלת דגימות מטופל וסינון בודדחלבונים ואנזימים. יתר על כן, על ידי שימוש בחלבונים ואנזימים מופרדים לסנתז קרישים, קרישים היו סטנדרטיים, כך שלא היה שונות בין דגימות כתוצאה מחלבונים אחרים בפלזמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הפרוטוקול הבא פועל לפי ההנחיות שנקבעו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) בג'ורג'יה טק.

איסוף דם 1. והליך בידוד תאי דם אדום

  1. לאסוף 40-120 מיליליטר של דם מתורמים ב 10 מיליליטר צינורות Vacutainer heparinized. התחל PBMC בידוד (תאי דם היקפיים mononucleated) בתוך 4 שעות של אוסף. במהלך תקופה זו, לשמור על דם בRT.
    הערה: O / אחסון N של דם בRT או ב 4 ° C אינה מומלץ כזה יגרום לתשואת PBMC נמוכה יותר.
  2. לדלל דם כל 1: 1 בPBS סטרילי קר כקרח (4 ° C).
  3. פיפטה 10 מיליליטר של פוליסכריד הידרופילי קר כקרח לתוך צינור ריק, סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. בעדינות להעביר כל דם מדולל על גבי פוליסכריד הידרופילי.
  4. השתמש פיפטה 25 מיליליטר בהגדרה איטית ודם טפטפת לאורך הצד של הצינור באיטיות רבה. ודא שהדם אינו מעורבב עם saccharide לפני centrifugation כי פוליסכריד הידרופילי הוא רעיל לתאים ואחרת, תשואת PBMC תהיה נמוכה יותר.
  5. דגימות דם צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 400 XG ב 4 מעלות צלזיוס. אם זמין, להפחית את מהירות הבלם של צנטריפוגות למחצית המרבית להפרדה טובה יותר לאחר צנטריפוגה.
  6. לשאוב את חלק פלזמה / טסיות דם של דגימת דם centrifuged. בזהירות לשאוב את שכבת פוליסכריד הידרופילי ישירות מעל שכבת RBC ארוזה.
  7. לאסוף 8-10 מיליליטר של תאי דם אדומים ארוזים ולדלל 1: 1 עם 0.9% מלוחים NaCl לא סטרילי.

2. מבני קריש Confocal מיקרוסקופית הערכת Glycated (קרישי סוכרתיים סימולציה)

  1. להפשיר פיברינוגן האדם והמצומד פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescently על 37 מעלות צלזיוס.
  2. פיפטה הבאה ל0.5 מיליליטר סיים צינור microcentrifuge.
    1. לקרישי פיברינוגן הבריאים, נורמלים, לערבב פיברינוגן אדם עם 10% פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescentlyהמצומד בחיץ 50 מ"מ טריס / 100 מ"מ NaCl בריכוז של 5 מ"ג / מיליליטר.
    2. לפיברינוגן Glycated באופן מלאכותי (כדי לדמות קרישים סוכרתיים), דגירה פיברינוגן אדם ו -10% המצומד פיברינוגן fluorescently שכותרתו בפתרון 5 מ"מ של גלוקוז מומס ב-50 מ"מ טריס / 100 מ"מ NaCl לריכוז של 6.8 מ"ג / מיליליטר וכתוצאה מכך.
  3. לכסות את צינורות מיקרו צנטריפוגות באמצעות חומר אטום כדי להימנע מחשיפה לאור. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  4. הפוך תא בשקופית מיקרוסקופ זכוכית על ידי ההדבקה בדבק דק על 2 צדדים של השקופית.
  5. לאחר תקופת הדגירה 48 שעות, להכין חומרים כימיים להיווצרות הפיברין ידי הפשרת FXIIIa ותרומבין אלפא האנושי בRT.
  6. לדלל FXIIIa 80 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2.
  7. לדלל תרומבין 4 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2.
    1. לקרישים רגילים, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 2.5 מ 'g / ml, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl.
    2. לקרישים Glycated, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 3.4 מ"ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl.
  8. מייד פיפטה 30 μl של פתרון הפיברין לתוך התא שהוקם על ידי הדבק.
  9. מניחים 22 מ"מ כיסוי הזכוכית להחליק x 22 מ"מ עם עובי של 0.15 מ"מ על גבי 2 שכבות של דבק. חותם את הצדדים הפתוחים עם דבק ברור כדי למנוע קריש הפיברין מהתייבשות. ודא שהדבק אינו אינטראקציה עם קריש הפיברין.
  10. לאפשר לקרישי פיברין לפלמר ב21-23 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לפני ההדמיה confocal.
  11. קח תמונות מיקרוסקופיה confocal של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal עם עדשת השמן M27 40X / 1.30 עם לייזר ארגון 488 ננומטר.

3. Confocal מיקרוסקופית הערכת קרישי פיברין מכילים RBCs מחולי אנמיה חרמשית

  1. להפשיר פיברינוגן האדם והמצומד פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescently על 37 מעלות צלזיוס.
  2. פיפטה הבאה ל0.5 מיליליטר סיים צינור microcentrifuge.
    1. לקריש הפיברין הבריא, נורמלי, לערבב פיברינוגן אדם עם 10% המצומד פיברינוגן האדם שכותרתו fluorescently בחיץ mM NaCl 50 מ"מ טריס / 100 בריכוז של 5 מ"ג / מיליליטר.
    2. לקרישים המכילים SCD RBCs, לערבב פיברינוגן אדם ו -10% המצומד פיברינוגן האדם שכותרתו fluorescently ב-50 מ"מ טריס / 100 מ"מ NaCl כך שהריכוז של פיברינוגן וכתוצאה מכך הוא 10 מ"ג / מיליליטר.
  3. תווית RBCs המבודד (הן נורמליות ואלה מחולי אנמיה חרמשית שהתקבלו מפרוטוקול בידוד RBC) באמצעות פתרון תא תיוג.
    1. להשעות תאים בצפיפות של 1 x 10 6 לכל מיליליטר בכל מדיום תרבות סרום ללא בחר.
    2. הוסף 5 μl / מיליליטר של ההשעיה התא לפתרון תא תיוג. מערבבים היטב על ידי pipetting העדין בעדינות.
    4. צנטריפוגה צינורות השעיה שכותרתו ב 1500 סל"ד במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    5. הסר את supernatant ועדינות מחדש להשעות את התאים 37 ° C בינוני.
    6. חזור על תהליך השטיפה (3.3.4 ו3.3.5) עוד פעמיים.
  4. לדלל FXIIIa 80 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2.
  5. לדלל תרומבין 4 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2.
    1. לקרישים רגילים, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 2.5 מ"ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl.
    2. לקרישים המכילים SCD RBCs, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 5 מ"ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl.
  6. פיפטה 10 μl של RBCs שכותרתו לפתרון הפיברין. פיפטה 30 μl של הפיברין עם RBCs על משטח הזכוכית מיקרוסקופ (ראה להחליק הכנה לGLקרישי ycated).
  7. לאפשר ליפין לפלמר ב21-23 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לפני ההדמיה confocal.
  8. קח תמונות confocal של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal, ולנצל לייזרי עירור עם אורכי גל של 488 ננומטר 633 ננומטר ולהלהיב את הפיברין שכותרתו fluorescently וRBCs.

4. Confocal מיקרוסקופית הערכת הפירוק פיברין המחירים במבני קריש Glycated

  1. חזור על פרוטוקול מיקרוסקופיה confocal של קרישי Glycated (פרוטוקול שלב 2) להערכת שיעור הפירוק פיברין בקרישי Glycated.
  2. לא לאטום את הקצוות של החדר עם דבק ברור. לאפשר לקרישי פיברין לפלמר עבור 1.5 שעות ב21-23 מעלות צלזיוס במארז אטום המכיל 250 מיליליטר של מים על מנת למנוע התייבשות.
  3. לאחר פילמור, להשיג תמונות של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal.
  4. פלסמין פיפטה לקצה הפתוח של החדר ולפזר את פלסמין דרך הקריש באמצעות פעולת נימים.
    1. לניסויי פירוק פיברין נורמלים וGlycated עם ריכוזים נורמלים, פיפטה 25 μl ב 200 מיקרוגרם / מיליליטר של פלסמין לתוך הפתח של החדר.
    2. לקרישים Glycated עם ריכוזים מופחתים, פיפטה 25 μl ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר לתוך הפתח של החדר.
  5. השתמש בתכונת זמן הסדרה (ראה איור 1) בתוכנת מיקרוסקופ confocal ללכוד צילומי וידאו של פלסמין lysing הקריש בזמן אמת.
    1. לחץ מצב רכישה ולאחר מכן בחר "סדרות עתיות." בחר את מספר המחזורים ואת מרווח זמן הקלטה.

5. חישוב המחירים הפירוק פיברין

  1. לקבוע את שיעור תמוגה ידי הגדרת אזור (2,500 מיקרומטר 2) וחישוב הזמן שחלף נדרש לפזר אזור קבוע של הקריש. לחשב את שיעור תמוגה באמצעות המשוואה הבאה (איור 2):
    figure-protocol-1

6. ניתוח סטטיסטי של המחירים הפירוק פיברין

  1. לנתח את נתוני תמוגה באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית. לבצע ניתוח שונה חד-כיווני ופוסט הוק מבחן Tukey-Kramer 44,45.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Confocal ניתוח מיקרוסקופית של מבני קריש פיברין Glycated

תמונות מיקרוסקופיה confocal של קרישים נורמלים וGlycated מוצגות באיור 3. ניתוח מיקרוסקופיה Confocal של קרישים נורמלים וGlycated מגלה כי קרישי Glycated הם צפופים עם נקבוביות קטנות יותר מהקרישים נורמלים עם או בלי התוספת של FXIIIa במהלך פילמור קריש. באיור 3 א ו3B, יש ריכוז נמוך הפיברין שיצר מבנה פחות צפוף מאשר קרישי Glycated עם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לקבל נתונים משמעותיים על המבנה של מנגנוני קרישה במצבי מחלה, חשוב לבודד את הגורמים מעורבים בקרישה כדי לקבוע את ההשפעות של החלבונים ותאים בתנאים אלה. פרוטוקול זה פותח לצורך חקירת המבנה של קריש הפיברין במדינות סוכרת וSCD במבחנה.

זה הכרחי כדי להבין את המנגנונים מעורבים בהיווצרות הפיברין ופירוק פיברין במצבי מחלה שכן תנאים השתנו לגרום hypercoagulation, atherothrombosis, וCVD. מתמונות confocal שהתקבלו בניסו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות למעבדת לאם בג'ורג'יה טק על דיונים מועילים רבים בפיתוח מבחני הניסוי. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר K01HL115486 ועל ידי מענק חדשן חדש 1DP2OD007433-01 ממשרד מנהל המכונים הלאומיים לבריאות. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (פוליסכריד הידרופילי)GE Healthcare45-001-749
10 מ"ל שפופרות ואקום הפריניותBD Biosciences366643
מעבדות מחקר אנזימיפיברינוגן אנושייםN/A
בדיקות מולקולריותמצומדות פיברינוגן אנושיותF13191
0.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה מדורגפישר סיינטיפיק05-408-120
אבקת גלוקוזLife Technologies15023-02
FXIIIaמעבדות מחקר אנזימיםN/A
VIS מיקרוסקופ קונפוקליZeiss LSM 510LSM 510
50 מ"מ TrisLonzaS50-642
סידן כלורי (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD פתרון תיוג תאיםLife TechnologiesL7781
מעבדות מחקר אנזימיפלסמיןN/A
נתרן כלורי (5 M NaCl)Life TechnologiesAM9759
תוכנת מידול סטטיסטיIBMSPSS סטטיסטיקה 22
Alexa Fluor 488

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781(2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212(1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים