בכתב יד זה מוצגות טכניקות ניסיוניות, כולל הכנת דם, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח קצב ליזה, לבחינת ההבדלים המורפולוגיים בין מבני קרישים נורמליים וחריגים עקב מצבים חולים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טכניקות ניסיוניות והדמיה לבחינת מבני פיברין קריש בבריאה והחולה הברית
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיברין הוא חלבון מטריצה חוץ-תאי האחראי על שמירה על השלמות המבנית של קרישי הדם. מחקרים רבים נעשו על פיברין בשנים האחרונות כדי לכלול חקירה של סינתזה, מבנה-תפקוד וליזיס של קרישי דם. עם זאת, עדיין יש הרבה לא ידוע על המאפיינים המורפולוגיים והמבניים של קרישי דם הנובעים מחולים עם מחלה. במחקר זה מוצגות טכניקות ניסיוניות המאפשרות לבחון הבדלים מורפולוגיים של מבני קרישים חריגים עקב מצבים חולניים כגון סוכרת ואנמיה חרמשית. המחקר שלנו מתמקד בהכנה והערכה של קרישי פיברין על מנת להעריך הבדלים מורפולוגיים באמצעות מבחנים ניסיוניים שונים ומיקרוסקופיה קונפוקלית. בנוסף, מתוארת גם שיטה המאפשרת חישוב רציף בזמן אמת של שיעורי הליזיס בקרישי פיברין. הטכניקות המתוארות כאן חשובות לחוקרים ולרופאים המבקשים להבהיר פתולוגיות פקקתיות נלוות כגון אוטם שריר הלב, מחלת לב איסכמית ושבץ מוחי בחולים עם סוכרת או מחלת תאי חרמש.
מבוא
פגיעה ברירית האנדותל של כלי דם לתיקון דרך התגובה לעצרת הדם, או היווצרות של קריש דם. כאשר דם מחלחל לתוך מטריצת החוץ תאית, גורמי רקמה להפעיל טסיות דם בזרם הדם המאפשרים חניכה של מפל הקרישה. המרכיב המכני המפתח של תהליך ריפוי זה הוא מטריצת הפיברין, מורכבת מסיבי הפיברין שאלסטיות גבוהה, ויכול לקיים כוחות גדולים 1-4. חוקרים רבים חקרו את מבנה המערך, ותפקוד של הפיברין בהרחבה בעשורים האחרונים 5-13.
יש חולים במחלות כגון סוכרת וחרמשית סיכון מוגבר לפתח סיבוכים טרומבוטיים כגון אוטם שריר לב, מחלת לב איסכמית, ומלטף 14-19. מעל 2 מיליון אנשים שאו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול הבא פועל לפי ההנחיות שנקבעו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) בג'ורג'יה טק.
איסוף דם 1. והליך בידוד תאי דם אדום
- לאסוף 40-120 מיליליטר של דם מתורמים ב 10 מיליליטר צינורות Vacutainer heparinized. התחל PBMC בידוד (תאי דם היקפיים mononucleated) בתוך 4 שעות של אוסף. במהלך תקופה זו, לשמור על דם בRT.
הערה: O / אחסון N של דם בRT או ב 4 ° C אינה מומלץ כזה יגרום לתשואת PBMC נמוכה יותר. - לדלל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Confocal ניתוח מיקרוסקופית של מבני קריש פיברין Glycated
תמונות מיקרוסקופיה confocal של קרישים נורמלים וGlycated מוצגות באיור 3. ניתוח מיקרוסקופיה Confocal של קרישים נורמלים וGlycated מגלה כי קרישי Glycated הם צפופים עם נקבוביות קטנות יותר מהקרישים נורמלים עם או בלי התוספת של FXIIIa במהלך פילמור קריש. באיור 3 א ו3B, יש ריכוז נמוך הפיברין שיצר מבנה פחות צפוף מאשר קרישי Glycated עם .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי לקבל נתונים משמעותיים על המבנה של מנגנוני קרישה במצבי מחלה, חשוב לבודד את הגורמים מעורבים בקרישה כדי לקבוע את ההשפעות של החלבונים ותאים בתנאים אלה. פרוטוקול זה פותח לצורך חקירת המבנה של קריש הפיברין במדינות סוכרת וSCD במבחנה.
זה הכרחי כדי להבין את המנגנונים מעורבים בהיווצרות הפיברין ופירוק פיברין במצבי מחלה שכן תנאים השתנו לגרום hypercoagulation, atherothrombosis, וCVD. מתמונות confocal שהתקבלו בניסו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות למעבדת לאם בג'ורג'יה טק על דיונים מועילים רבים בפיתוח מבחני הניסוי. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר K01HL115486 ועל ידי מענק חדשן חדש 1DP2OD007433-01 ממשרד מנהל המכונים הלאומיים לבריאות. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (פוליסכריד הידרופילי) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 מ"ל שפופרות ואקום הפריניות | BD Biosciences | 366643 | |
| מעבדות מחקר אנזימי | פיברינוגן אנושיים | N/A | |
| בדיקות מולקולריות | מצומדות פיברינוגן אנושיות | F13191 | |
| 0.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה מדורג | פישר סיינטיפיק | 05-408-120 | |
| אבקת גלוקוז | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | מעבדות מחקר אנזימים | N/A | |
| VIS מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 מ"מ Tris | Lonza | S50-642 | |
| סידן כלורי (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD פתרון תיוג תאים | Life Technologies | L7781 | |
| מעבדות מחקר אנזימי | פלסמין | N/A | |
| נתרן כלורי (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| תוכנת מידול סטטיסטי | IBM | SPSS סטטיסטיקה 22 |
מקורות
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
