מאמר שיטה

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

DOI:

10.3791/52021

⸱

6 בנובמבר 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית חזקה לכימות השיעור היחסי של פרוטאוליזה על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום. קריאת הבדיקה היא קצב גידול השמרים בתרבית נוזלית, התלוי ברמות התאיות של חלבון מדווח הכולל אות פירוק המותך לסמן מטבולי חיוני.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פירוק חלבונים על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) הוא מנגנון רגולציה עיקרי להומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. הגישה סטנדרטית לקביעת פירוק חלבונים תאיים מסתמכת על מבחני ביוכימיים לבעקבות קינטיקה של ירידת חלבון. שיטות כאלה הן לעתים קרובות מייגע וגוזלים זמן ולכן לא ניתן לניסויים שמטרתם להעריך את מצעים מרובים ותנאי השפלה. כחלופה, מבחני מבוססי צמיחת תאים פותחו, שהם, בפורמט קונבנציונלי, מבחני נקודת סיום שלהם שלא ניתן לקבוע כמותית שינויים יחסי ברמות חלבון.

כאן אנו מתארים שיטה שבנאמנות קובעת שינויים בשערי פירוק חלבונים על ידי צימודם לקינטיקה תא צמיחת שמרים. השיטה מבוססת על מערכת בחירה הוקמה בי auxotrophy אורציל של URA3 -deleted תאי שמרים הוא חולץ על ידי חלבון כתב הביע באופן אקסוגני, מורכב מהיתוך בין גן URA3 החיוני ומכריע השפלה (degron). חלבון הכתב מתוכנן כך ששיעור הסינתזה שלה הוא קבוע בזמן שקצב הפירוק שלה נקבע על ידי degron. כצמיחת תאים במדיום אורציל הלקוי היא פרופורציונלית לרמות היחסית של URA3, קינטיקה הצמיחה הן תלויה לחלוטין בפירוק חלבוני כתב.

שיטה זו מדויקת מודדת שינויים בקינטיקה פירוק חלבונים תוך-התאית. זה היה מוחל על: (א) הערכת התרומה היחסית של גורמי conjugating היוביקוויטין ידועים proteolysis (ב) E2 מבנה-תפקוד אנזים conjugating מנתח (ג) זיהוי ואפיון של degrons רומן. יישום של המערכת מבוססת URA3 degron- מתעלה תחום פירוק החלבונים, כפי שהוא יכול גם להיות מותאם לשינויי ניטור של רמות חלבון הקשורים לפונקציות של מסלולים סלולריים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת השפלה יוביקוויטין-פרוטאזום היא מכונה רגולטורים גדולה, שהיה מעורבת בשמירה על הומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. UPS תחילה conjugates מולקולות יוביקוויטין מרובים לחלבון מטרה לאחר שחלבון פולי-יוביקוויטין מתויג הוא מושפל על ידי הפרוטאזום 26s. ברוב המקרים, שיעור הגבלת צעד להשפלת יוביקוויטין תיווך הוא ubiquitylation מצע, בתיווכו של E2 ו- E3 conjugating אנזימי ligating אנזימים (Ligases E3) 1. כתוצאה מכך, יציבות תאית של חלבונים ספציפיים משקפת את הרגישות שלהם ליוביקוויטין-נטיה ואת הפעילות של אנזימי ubiquitylation המקור שלהם.

ligases E3 הם מרכיבי הכרת המצ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבות 1. תא

  1. להפוך את התאים המתאימים auxotrophic שמרים, כגון Try467 (טבלה 2), עם פלסמיד המכיל (א) URA3 -degron היתוך ו- (ב) סמן חילוף חומרים נוסף לבחירת פלסמיד ותחזוקה.
    הערה: דוגמא של פלסמיד המתאים היא YDpK-MET25p-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV) זה פלסמיד אינטגרטיבי שמרים המכיל חלבון היתוך הכולל Deg1 - degron נגזר משמרי השעתוק. גורם Mat2 17, epitope FLAG - לגילוי על ידי immunoblotting, Vma12 - חלבון ER יציב, וURA3 15,18 (איור 3 א). (רא....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חוקר את תפקידם של אנזימים של מסלול Doa10 בהשפלתו של מצע כתב

כדי לבדוק את תקפותה של שיטת GiLS זה היה בהשוואה לassay השפלה מסורתית. ניסוי זה מעריך את תרומתו היחסית של רכיבים של ER-הקרום מקומי Doa10 E3-האנזים מורכב 20,21 לזילות של מצע כתב בקרת איכות חלבון Deg1- VU (איור 3 א). פלסמיד Deg1- VU שולב תאים מסוג בר או לתאים חסרי הגן לאנזים conjugating.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים assay המבוסס על צמיחת תאים לקביעת תעריפי פירוק חלבונים יחסית, המכונה "קינטיקה צמיחה בתרבות נוזלית בתנאי סלקטיבי '(GiLS). יש assay GiLS מספר יתרונות: זה פשוט להגדיר, רכישת נתונים וניתוח הוא פשוט וזה מאוד מודולרי. כתוצאה מכך, יכול להיות מיושם GiLS בו-זמנית לדוגמאות רבות בפורמט ידידותי למשתמש רב גם צלחת שיכול להיות מותאם לאוטומציה ליישומי תפוקה גבוהות. והכי חשוב, GiLS מספק נתונים לשחזור ביותר, כמותי וחזקים וגמיש יותר ממבחנים מבוסס צמיחה אגר-צלחת שיבחרו לצמיחה .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר יובל רייס ולד"ר ויליאם ברויאר על הביקורת על כתב היד ולעומרי אלפסי על עזרתו בפיתוח מבחן המסך Ura3-GFP. אנו מודים גם לד"ר מ. הוכסטרסר ולד"ר ר. קולקה על פלסמידים וזנים. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה הישראלית למדעים (מענק 786/08) ועל ידי הקרן המדעית הדו-לאומית ארה"ב-ישראל (מענק 2011253).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בסיס חנקן שמרים Difco ללא חומצות אמינו ואמוניום גופרתיBD Biosciences233520לגידול שמרים על מדיה מינימלית SD.  חומצות האמינו שיסופקו הן: ארגינין, היסטידין, איזולאוצין, לאוצין, ליזין, מתיונין, פנילאלנין, תראונין, טריפטופן
אמוניום סולפטסיגמא - AldrichA4418
גלוקוזסיגמא - Aldrich16325
אדניןסיגמא - AldrichA8626
UracilSigma - AldrichU0750
חומצות האמינוהגבוהות ביותר טוהר זמין 
צלחות 96 בארותNunc167008ניתן להשתמש בכל מותג תואם אחר
Cyclohexamide Sigma - AldrichC7698עובד conc. 0.5 מ"ג/מ"ל
סדרת Infinite 200 PROTecanלדגירת שמרים ומדידות OD600. ניתן להשתמש בכל קורא תואם אחר הנשלט על ידי זמנים.
MDTcalcתוכנה ניסיונית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  2. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Reporter URA3E2

מאמרים קשורים