הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52022

⸱

20 באוקטובר 2014

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

במאמר זה

סיכום

ניתן להשיג מניפולציה של ביטוי גנים טמפורלי בהתמיינות תאי גזע עובריים (ESCs) באמצעות מערכות גנים הניתנות להשראה. עם זאת, יצירת קווי תאים אלה היא יקרה וגוזלת זמן. פרוטוקול זה משיג ביטוי מהיר של טרנסגן בהתמיינות תאים שמקורם ב-ES וניתוח לאחר מכן של התמיינות המטופויאטית במורד הזרם.

תקציר

תאי גזע עובריים (ESCs) הם מודל יוצא מן הכלל להבהרת המנגנונים המולקולריים של התמיינות תאית. הם שימושיים במיוחד לחקירת התפתחות תאי אב המטופויאטיים מוקדמים (HPC). ניתן לתמרן את ביטוי הגנים ב-ESCs על ידי מספר טכניקות המאפשרות לקבוע את תפקידן של מולקולות בודדות בהתפתחות. קושי אחד הוא שלביטוי של גנים ספציפיים יש לעתים קרובות השפעות פנוטיפיות שונות התלויות בביטוי הזמן שלהם. ניתן לעקוף בעיה זו על ידי יצירת תאי גזע עובריים המבטאים באופן אינדוקטיבי גן מעניין באמצעות טכנולוגיה כגון מערכת הטרנסגנים המושרה על ידי דוקסיציקלין. עם זאת, יצירת קווי תאים מושרים אלה היא יקרה וגוזלת זמן. מתוארת כאן שיטה לפירוק גופים עובריים שמקורם ב-ESC (EBs) לתרחיפים של תאים בודדים, הדבקה רטרו-ויראלית של תרחיפי התאים, ולאחר מכן רפורמה של ה-EBs על ידי טיפה תלויה. התמיינות במורד הזרם מוערכת לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה. באמצעות פרוטוקול זה, הוכח כי ביטוי אקסוגני של גן microRNA בתחילת התמיינות ESC חוסם יצירת HPC. עם זאת, כאשר הוא מתבטא בתאים שמקורם ב-EB לאחר ייצור מזודרם מתהווה, גן המיקרו-RNA משפר את ההתמיינות ההמטופויאטית. שיטה זו שימושית לחקירת תפקידם של גנים לאחר גזירת רקמת שכבת נבט ספציפית.

מבוא

תאי גזע עובריים של עכברים (ESCs) הם פלוריפוטנטיים, נשארים לא ממוינים ומתחדשים מעצמם בנוכחות גורם מעכב לוקמיה ציטוקינים (LIF)1. עם נסיגת LIF הם יתמיינו באופן ספונטני למבנים תלת מימדיים (3D) הנקראים גופים עובריים (EBs)2. ארכיטקטורת התלת מימד מאפשרת פיתוח של שלוש שכבות הנבט אקטודרם, אנדודרם ומזודרם, אשר לאחר מכן מולידים רקמות בוגרות מסוג3. תאי גזע עובריים הם מודל יוצא דופן להבהרת המנגנונים המולקולריים של התמיינות תאית, במיוחד חקירת התפתחותם של תאי אב המטופויאטיים מוקדמים (HPCs)4.

ניתן לתפעל את ביטוי הגנים ב-ESCs על ידי מספר טכניקות המאפשרות קביעת תפקיד למולקולות בודדות בהתפתחות. אחת הטכניקות הנפוצות ביותר היא שימוש ברקומבינציה הומולוגית ליצירת קווי ESC, חסרי גן מעניין5,6. ישנן גם מספר טכניקות ששימשו לביטוי יתר של גנים. הטכניקה הראשונה ששימשה לשינוי ביטוי גנים ב-ESCs הייתה להדביק אותם ברטרו-וירוסים רקומביננטיים7,8. עם זאת, הגן המעניין מושתק לעתים קרובות כאשר ה-ESCs מתמיינים לסוגי תאים אב ובוגרים. השימוש ב-lentiviruses הצליח להגביל את ההשתקה של גנים המתבטאים באופן ויראלי9. וקטורים נגיפיים אחרים המשמשים לביטוי יתר כוללים אדנו-וירוס ווירוס הקשור לאדנו10. בנוסף, טכניקות טרנספקציה סטנדרטיות להצגת פלסמידים ביטוי ביציבות נמצאות בשימוש נרחב לביטוי טרנסגנים ESC11. קושי אחד במערכות אלה הוא שלעתים קרובות לביטוי של גן ספציפי יש השפעות שונות בהתאם לביטוי הזמן שלו. לדוגמה, חלבון Smad1 משפיע על התפתחות התאים ההמטופויאטיים באופן שונה בשלבים שונים של התפתחות EB12,13.

ניתן לעקוף בעיה זו על ידי יצירת תאי גזע עובריים המבטאים באופן אינדוקטיבי גן מעניין. המערכת הנפוצה ביותר לביטוי טרנסגנים באופן אינדוקטיבי ב-ESCs משתמשת באופרון העמידות לטטרציקלין מ-E. Coli (Escherichia coli). פותחו מספר מערכות טטרציקלין שונות. אחת האסטרטגיות הפופולריות יותר פותחה על ידי Kyba ועמיתיו14. הם יצרו קו ESC (Ainv15), שבו הגן הטרנס-אקטיבי של טטרציקלין ההפוך מוכנס ללוקוס ROSA26 הפעיל באופן מכונן. אלמנט תגובת טטרציקלין (TRE), אתר LoxP במורד הזרם (לוקוס של X-over P1 מבקטריופאג' P1), וקלטת ניאומיצין ללא מקדם הוכנסו ללוקוס HPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) על כרומוזום X. באמצעות גישת רקומבינציה של CRE, ניתן להחדיר גן מעניין יחד עם מקדם אוקריוטי כדי להניע את הביטוי של גן העמידות לניאו-מיצין לאתר LoxP. ESCs ממוקדים כהלכה מבודדים על ידי בחירת G418. לאחר מכן יש לבדוק את השיבוטים הממוקדים הללו לביטוי השראת דוקסיציקלין (או טטרציקלין) של הטרנסגן. גישה זו יצרה בהצלחה קווי ESC המבטאים באופן אינדוקטיבי את HoxB4, Stat5, SCLו-Smad7 14-17. עם זאת, יצירת קווי תאים מושרים אלה גוזלת זמן. מתוארת כאן שיטה לפירוק גופים עובריים שמקורם ב-ESC (EBs) לתרחיפים של תאים בודדים, להדביק רטרו-ויראלית את תרחיפי התאים בימים שונים של התפתחות, ולאחר מכן לתקן את ה-EBs על ידי טיפה תלויה. התמיינות במורד הזרם מוערכת מאוחר יותר על ידי ציטומטריית זרימה. במאמר זה מוצגת דוגמה לאופן שבו ביטוי miRNA בתאים שמקורם ב-EB משפיע על התמיינות המטופויאטית. שיטה זו שימושית לחקירת תפקידם של גנים לאחר גזירת רקמת שכבת נבט ספציפית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

.1 Embryoid גוף גיבוש (EB)

  1. ג'לטין-להסתגל ESCs שנשמר על fibroblasts עובר עכבר (MEFs). ESCs מעבר 3 פעמים בצלחת תרבית רקמת 6 היטב מצופים בג'לטין 0.1% להסיר MEFs.
    1. לגדל תאים בתקשורת תחזוקת ESC עם LIF כדי לשמור על התאים שלא עברו התמיינות (טבלה 1). להפוך תאים בטוחים לא יעלו על מפגש 80%. השתמש במעבר נמוך (10 או פחות מעברים לאחר הסרת מMEFs) תאים לבידול.
  2. ביום שלפני ESCs בתרבית לבידול EB, מעבר תאים כך שהם יעמדו על כ 50-70% ומחוברות למחרת. המשך culturing תאים בינוני תחזוקת ESC כדי לשמור על pluripotency תא.
  3. ביום הבידול, תקשורת תחזוקה לשאוב ESC ולשטוף עם 1 מ"ל בופר פוספט (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, ו11.9 מ"מ חיץ פוספט, pH 7.4) לכל טוב של צלחת 6 היטב.
    1. הוסף 200 μl של tryps 0.25%ב/ EDTA היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
    2. להשבית טריפסין / EDTA עם 800 μl של תקשורת בידול. Pipet למעלה ולמטה בpipet סרולוגיות 2 מ"ל עם קצה p200 לשבור-up תאים לתוך השעיה תא בודדת. ודא שקצה p200 ישתלב בנוחות בסופו של הדבר כל כך התקשורת לא עולה בין pipet וממשק קצה.
    3. Pipet כ 5-10 פעמים למעלה ולמטה. יש להיזהר שלא ליצור בועות בpipetting.
  4. העברת תאי צינור חרוטי 15 מ"ל. להעלות את עוצמת הקול ל10 מ"ל עם PBS. צנטריפוגה ב315 XG למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. הסר supernatant. שטוף פעמיים עם 5 מ"ל PBS להסיר תקשורת שנותרה מכילה LIF. צנטריפוגה כמו בשלב 1.4 לכל שטיפה.
    1. Resuspend תא גלולה הסופי ב2 מ"ל של תקשורת בידול (טבלה 2).
  6. ספירת תאים עם דלפק hemocytometer או תא וצלחת 6,000-10,000 תאים / מ"ל ​​בצלחת פטרי 10 סנטימטר(התרבות שאינן רקמות שטופלה).
    1. לקבוע את התאים / מ"ל ​​המדויק באופן אמפירי עבור כל קו ESC. להשתמש בצלחות פטרי סטרילית משמשות בדרך כלל לעבודה בקטריאלי או צלחות היענות נמוכות.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר בידול, EBS צריך טופס תחומים שנותרו בהשעיה מבלי לצרף לצלחת. לבדוק כמה מותגים של צלחות למצוא את אלה עם הדבקות לפחות.
    2. דגירה ESCs ההבחנה בתרבית רקמת חממה 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
מגיב המניה ריכוז סופי נפח חברה מספר קטלוגי
DMEM 1x 410 מ"ל S igma / אולדריץ D5796
FBS (ES הוקרן) 100% 15% 75 מ"ל Hyclone SH30070.03E
שאינם חיוני חומצות אמינו 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 11140
L-גלוטמין 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 35,050
Penncillin / סטרפטומיצין 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 15070
β-mercaptoethanol 14.3 M 114 מיקרומטר 4 μl סיגמא / אולדריץ M3148
לוקמיה מעכבת פקטור (LIF) 10 7 יחידות / מ"ל 1,000 יחידות / מ"ל 50 μl Millipore ESG1107
ontent "> טבלת 1: ESC תחזוקת מדיה.

מגיב המניה ריכוז סופי נפח חברה מספר קטלוגי
DMEM 1x 410 מ"ל סיגמא / אולדריץ D5796
FBS (משתמש מוקרן לבידול אופטימלי) 100% 15% 75 מ"ל Hyclone SH30070.03E
שאינם חיוני חומצות אמינו 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 11140
L-גלוטמין 100x 1x 5 מ"ל החיים TECHNOLOחיס 35,050
Penncillin / סטרפטומיצין 100x 1x 5 מ"ל חיים טכנולוגיים 15070
β-mercaptoethanol 14.3 M 114 מיקרומטר 4 μl סיגמא / אולדריץ M3148

טבלה 2: מדיה בידול.

2 תאי EB הכנה לוירוס זיהום

  1. בשלב הרצוי של פיתוח (בין היום 2 ויום 3), להעביר את EBS מצלחת פטרי 10 סנטימטר לצינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף את הצלחת עם 5 מ"ל PBS ולהוסיף לשטוף את צינור חרוטי.
  2. גלולה EBS ב315 XG בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. שוטף את תאי EB עם 5 מ"ל PBS.
  3. הוסף 1 מ"ל של תמיסה מופשרת ניתוק תא (מפרקי חלבונים המכילים אנזימי collagenolytic) ולמקם את הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס (או חממה) עבור 30 דקות עם OCCתסיסה asional (ממצליף או vortexing אור).
  4. הוסף 1 מ"ל של תקשורת בידול. Pipet למעלה ולמטה עם pipet 2 מ"ל עם קצה pipet p200. מניחים את הצינור באמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים שוב ל30-60 דקות.
  5. ספין למטה התאים ב 315 XG למשך 5 דקות ולשטוף את התאים עם PBS.

זיהום .3 וירוס

  1. Resuspend התאים 1.5 מ"ל של תקשורת בידול. מעבירים את ההשעיה התא לצלחת תרבות שאינה רקמה 6 היטב שטופלה.
  2. הכן את רטרווירוס על ידי טכניקות סטנדרטיים מבעוד מועד. להוסיף 5 עד 100 μl של supernatant הנגיפי לתאים בהתאם לכייל נגיף. אל תוסיף polybrene כדי לשפר את הזיהום כמו זה מעכב את הרפורמה הבאה של EBS.
  3. Spinoculate תאים עם וירוס על ידי צנטריפוגה ב2,120 XG ל90 דקות בטמפרטורת חדר.

.4 ההתמיינות תאי EB נגועות ויראלי בטיפות תליה

  1. הוסף 2 מ"ל של תקשורת בידול היטב בכל infected EB השעיה תא.
  2. Pipet 3.5 מ"ל של השעיה תא EB נגועה לתוך מאגר מגיב סטרילי לmultipipettors. השתמש בmultipipettor לpipet 15-20 שורות של שמונה 20 μl טיפות על המכסה ההפוך של 15 סנטימטר צלחת פטרי.
  3. הוסף 10 מ"ל של PBS או מים סטריליים למחצית התחתונה של צלחת פטרי. ואז להפוך את המכסה עם הטיפות ומקום לצלחת פטרי. ודא שהטיפין תלויות במהופך ממכסה עם PBS או מים מתחת כדי לשמור על התא humidified.
  4. מניחים את הכלים בתרבית רקמת חממת 37 מעלות צלזיוס עם .5.0% CO 2.
  5. לאחר 2 ימים, לאסוף EBS נוצר בתליית טיפות על ידי היפוך מיכסה וכביסה עם 4.5 מ"ל של תקשורת בידול.
    1. תקשורת העברה וEBS לצלחת פטרי תרבות 10 סנטימטר שאינה רקמה חדשה. שטוף את המכסה פעם נוספת עם 3 מ"ל של תקשורת בידול והעברה לצלחת 10 סנטימטר.
  6. קציר תאים לניתוח על ידי cytometry זרימה לאחר כולל של 8תרבות ימים החל מהעברה הראשונית של תאים לתקשורת בידול (-LIF).

.5 תאי הכנה לניתוח תזרים Cytometer

  1. העבר את התאים לצינור חרוטי 15 מ"ל עם 10 מ"ל pipet. לשטוף את הצלחת עם 5 מ"ל PBS ולהעביר לאותו צינור חרוטי.
  2. תאים גלולה ב315 x גרם. לשטוף כדורים עם 10 מ"ל PBS.
  3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תא מופשרת ומניח את הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כאשר מדי פעם תסיסה. לצורך זיהוי של כמה אנטיגנים פני תא, טריפסין מקומם, ניתן להשתמש.
  4. הוסף 1 מ"ל תקשורת בידול וpipet למעלה ולמטה עם pipet 2 מ"ל. השתמש בקצה p200 לסוף pipet כדי לעזור לשבור-up מתעכל EB לתוך השעיה תא בודדת.
    1. מניחים את הצינור באמבטית 37 מעלות צלזיוס מים שוב ל60 דקות על מנת שחלבוני הקרום נפרד למחזר אל פני השטח התא.
  5. גלולה תאים ב315 XG למשך 5 דקות.
  6. שטוף את wi התאים0.1% V ה שור הסרום אלבומין חלק (BSA) שהוכן בPBS (PBS / BSA) ודגירת התאים עם ספציפי מתויג fluorescently נוגדנים.

.6 ניתוח cytometry זרימה לאבות המטופואטיות

  1. הנח 10 6 תאים EB נגזרים במ"מ 5 מ"ל 12 x 75 עגול צינור תחתון. לכוונון זרימת cytometer הגדרות פיצוי, להשתמש חרוזים פיצוי בהתאם להוראות יצרן.
  2. תאים גלולה ב315 x גרם. יוצקים את supernatant וגלול גלולים בפתרון PBS / BSA שייר בצינור.
  3. לאיתור ESC HPCs, דגירה התאים עם נוגדני ניאון שכותרתו: אנטי עכבר CD41-PE (R-Phycoerytherin) ו-APC אנטי עכבר CD117 (cKit) / Cy7 (Allophycocyanin Cyanine 7).
    1. לדלל נוגדני 1: 100 בPBS / BSA. הוספה של נוגדן מדולל 100 μl לכל דגימה. לקבוע את הדילול הנכון של נוגדן עבור כל ספק, שיבוט, והרבה או נוגדן. לקבוע דילול אופטימלי לתיוג תאים בנפרד.
  4. דגירה דגימות על קרח בחושך במשך 30 דקות.
  5. הוסף 2 מ"ל תאי PBS / BSA וגלול ב315 XG למשך 5 דקות.
  6. לשאוב supernatant וגלול גלול ב300 μl של PBS או אחר חיץ איזוטוני.
  7. תאי סינון resuspended דרך כובע מסננת תא (0.35 מיקרומטר) כדי להסיר אגרגטים תא גדולים.
  8. לנתח תאים על cytometer זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקרים אלה gelatinized RW4 (נגזר מזן עכבר 129X1 / SVJ) ESCs היו בשימוש. EBS היו מבודד ב3 ימים של בידול. לקבלת התוצאות הטובות ביותר EBS צריך להיות (איור 1 א ', ב') כדורי ולא חסיד. לאחר spinoculation עם וירוס שיתוף להביע GFP סמן פלואורסצנטי יחד עם גן של עניין, EBS היו רפורמה בשיטת הטיפה התלויה. EBS היו רפורמה בהצלחה מהשעיות תא שהוכנו מ2.0, 2.5, ו3.0 יום EBS. עם זאת, EBS לא ניתן היה רפורמה מהשעיות תא שהוכנו מהיום 4.0 EBS. Chimerism של EBS בין תאים נגועים ולא נגועים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאמור לעיל, השיבוטים ESC שinducibly להביע גן של עניין יכולים להיות שנוצרו תוך שימוש במערכות דוקסיציקלין, לעומת זאת, הדור של שורות אלה הוא הזמן רב ועבודה אינטנסיבית. שתואר בפרוטוקול זה הוא שיטה להביע את הגן של עניין בהשעית תא בודד שהוכנה מESC נגזרת EBS. לאחר מכן תאים נגועים אלה רפורמה לEBS בתליית טיפה לבחון בידול שלאחר מכן. בדוגמא (איור 3), שהוא מופיע ביטוי זה של אשכול mirn23a משפר את התפתחות hematopoietic כאשר הביעו ביום 3 של בידול. בשלב זה הפיתוח של רקמת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אי לנו אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פיילוט ומענקי היתכנות ממרכז בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה (IUSM) למצוינות בהמטולוגיה מולקולרית (NIDDK, 5P30DK090948). מימון נוסף ניתן על ידי מענק שיפור ביו-רפואי מ-IUSM. ברצוננו להודות לד"ר קארן קאודן דאל על ההערה על כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMSigma/AldrichD5796
β-מרקפטואתנולסיגמא/אולדריץ'M3148
FBS (מוקרן ES)HycloneSH30070.03E
FBS (מוגדר)HycloneSH30070.03
חומצות אמינו לא חיוניותLife Technologies11140
L-גלוטמיןחיים טכנולוגיות35050
Penn/StrepLife Technologies15070
Trypsin/EDTALife Technologies25200
LIF ESGROMillipore
MilliporeSCR006
Trypsin/EDTALife Technologies25200
לוחות תרבית רקמות פלקון 6- וולפישר סיינטיפיק08-772-1B
פלקון צלחות לא מטופלות 6 בארותפישר סיינטיפיק08-772-49
צלחת פלקון פטרי 10 ס"מפישר סיינטיפיק08-757-100D
צלחת פלקון פטרי 15 ס"מפישר סיינטיפיק08-757-148
שפופרת פלקון 5 מ"לפישר סיינטיפיק14-959-11A
פלקון שפופרת 5 מ"ל עם כובע מסננת תאיםפישר סיינטיפיק08-771-23
מאגרים סטריליים לבניםסיינטיפיק111-0700
חולדה נגד עכבר CD41 מצומד PE133906
עכברוש נגד עכבר CD117 מצומדBiolegend105826
RW4 ESCsATCCCRL-12418
ESG1107-ACCUMAX ארה"ב

מקורות

  1. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  2. Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
  3. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  4. Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
  5. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
  6. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
  7. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
  8. Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
  9. Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
  10. Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
  12. Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
  13. Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
  14. Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
  15. Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
  16. Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
  17. Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
  18. Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
  19. Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
  20. Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
  21. Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
  22. Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
  23. Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
  24. Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
  25. Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
  26. Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תאי גזע עוברייםיצירת גופים עוברייםניתוח בציטומטריית זרימההכנת תרחיף תאיםשיטת טיפה תלויהצביעה בנוגדנים פלואורסצנטייםסממני CD41 ו-CD17רקמת שכבת נבט
זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.