ניתוח &quot;מטען מיפוי&quot; המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

Sylvia Neumann; George E. Campbell; Lukasz Szpankowski; Lawrence S.B. Goldstein; Sandra E. Encalada

doi:10.3791/52029

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח "מטען מיפוי" המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52029

⸱

30 באוקטובר 2014

Sylvia Neumann¹ , George E. Campbell^*¹ , Lukasz Szpankowski^*²^,³ , Lawrence S.B. Goldstein²^,⁴ , Sandra E. Encalada¹

¹Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, ³Department of Bioengineering, University of California San Diego, ⁴Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הובלה תוך-תאית של מטענים, כגון שלפוחיות או אברונים, מתבצעת על ידי חלבונים מוטוריים מולקולריים העוקבים אחר מיקרו-צינורות מקוטבים. פרוטוקול זה מתאר את המתאם בין כיווניות ההובלה של חלקיקי מטען בודדים הנעים בתוך נוירונים, לכמות היחסית והסוג של חלבונים מוטוריים קשורים.

תקציר

הבנת המנגנונים שבאמצעותם מנועים מולקולריים לתאם את פעילותם להובלת מטענים בּוּעִי בתוך הנוירונים דורשת ניתוח כמותי של עמותות מנוע / מטען ברמת השלפוחית אחת. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי כדי לתאם ("המפה") העמדה והכיווניות של תנועת מטענים בשידור חי לסכומי ההרכב ויחסיים של מנועים הקשורים לאותו מטען. "מיפוי מטענים" מורכב מהדמית חיה של מטענים שכותרתו fluorescently נעו באקסונים בתרבית על מכשירי microfluidic, ואחריו קיבעון כימי בזמן ההקלטה של תנועה חיות, ומכתים immunofluorescence שלאחר מכן (IF) של אותו האזורים axonal המדויקים עם נוגדנים כנגד מנועים. Colocalization בין מטענים ומנועים הקשורים בם נבחנים על ידי הקצאת עמדה תת פיקסלים קואורדינטות ערוצי מנוע ומטען, על ידי פונקציות גאוס הולמים לעקיפה-ליפונקציות נקודת התפשטות mited מייצגות מקורות נקודות ניאון פרט. תמונות מטען ומנוע קבועים לאחר מכן הן על גבי לחלקות של תנועת מטענים, ל" המפה "אותם למסלולים במעקב שלהם. כוחו של פרוטוקול זה הוא השילוב של חיה ואם הנתונים לרשום גם את הובלת מטענים בּוּעִי בתאים חיים ולקבוע את מנועים הקשורים למדויקת אותו שלפוחית אלה. טכניקה זו מתגברת על אתגרים קודמים שמשתמשים בשיטות ביוכימיות כדי לקבוע את הרכב המנוע הממוצע של אוכלוסיות שלפוחית תפזורת מטוהרות הטרוגנית, שיטות אלה לא חושפות יצירות על מטענים מרגשים אחד. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לניתוח של מסלולי תחבורה ו / או סחר אחרים בסוגי תאים אחרים, כדי לקשר בין התנועה של מבנים תאיים בודדים עם הרכב החלבון שלהם. מגבלות של פרוטוקול זה הן התפוקה נמוכה יחסית בשל יעילות transfection הנמוכה של תרביתנוירונים עיקרי ושדה מוגבל של תצוגה זמינה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. יישומים עתידיים יכולים לכלול את שיטות כדי להגדיל את מספר תאי העצב להביע מטענים שכותרתו fluorescently.

מבוא

תחבורה תאית היא קריטית בכל סוגי התאים לאספקת חלבונים, ממברנות, האברונים, ומולקולות איתות לתחומים תאיים שונים ^1. נוירונים הם מאוד מיוחדים תאים עם תחזיות ארוכות, מקוטבות שהאנושות תלויה בתחבורה תאית של מטענים חיוניים למסירה למרחקים ארוכים שלהם לmicrodomains axonal השונים. תחבורה זה מתווכת על ידי kinesins וdyneins - שתי משפחות גדולות של חלבוני מנוע מולקולריים - לאגד את זה למטענים ולעקוב אחר לאורך microtubules המקוטב בכיוונים אנטרוגרדית ומדרדר, בהתאמה. בעוד שתנועת מדרדר בעיקר בתיווכו של dynein, תנועה בכיוון אנטרוגרדית היא הקלה על ידי משפחה גדולה, פונקציונלי מגוונת של מנועים kinesin. כתוצאה מכך, תחבורת האנטרוגרד מטעני axon....