הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

61.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52037

⸱

11 בנובמבר 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University, 2Center for Gene Therapy, Nationwide Children's Hospital Research Institute, Ohio State University

במאמר זה

סיכום

מודלים של בעלי חיים למחלות ילדים יכולים לחוות התפרצות מוקדמת והתקדמות מחלה אגרסיבית. מבחינה קלינית משלוח טיפול רלוונטי למודלים של עכברים צעירים יכול להיות קשה מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטת הזרקה תוך ורידית לא פולשנית לעכברים שזה עתה נולדו בתוך שני הימים לאחר הלידה הראשונה של חיים.

תקציר

הזרקה תוך ורידית היא אופן קליני רלוונטי כדי לספק תרופות. מכרסמים מבוגרים ובעלי חיים גדולים יותר, זריקות תוך-ורידית הן אפשריים מבחינה טכנית ושגרתיות. עם זאת, בחלק מדגמי העכבר יכול להיות התחלה מוקדמת של מחלה עם התקדמות מהירה שעושה ממשל של טיפולים פוטנציאליים קשה. הווריד הזמני (או פנים) הוא רק קדמי לניצן האוזן בעכברים והוא נראה בבירור ביומיים הראשונים שלאחר לידה בכל צד של הראש באמצעות מיקרוסקופ לנתח. במהלך חלון זה, הווריד הזמני יכול להיות מוזרק בנפחים של עד 50 μl. הזריקה היא בטוחה ונסבל היטב על ידי שני הגורים והסכרים. הליך הזרקה טיפוסי יושלם בתוך 1-2 דקות, לאחר שהגור חוזר לכלוב בבית. מהיום ליום שלאחר הלידה השלישי הווריד קשה לדמיין והליך ההזרקה הופך מבחינה טכנית לא אמין. טכניקה זו הייתה בשימוש למסירה של vect וירוס adeno הקשורים (AAV)ORS, אשר בתורו יכול לספק, ביטוי transgene יציב כמעט גוף-רחב לחייו של בעל החיים בהתאם לסרוטיפ הנגיפי נבחר.

מבוא

משלוח תרופות למערכת העצבים המרכזי (CNS) במודלים עכבריים למחלת ילדים עדיין מהווה אתגר. עכברים שמצבי מחלה שזה עתה נולדו מודל הם גוץ והתפתחותית בשלה, ולכן יכול להיות קשה להזריק ישירות במבנים מתאימים בתוך מערכת העצבים המרכזית. הזרקה תוך-של סוכנים טיפוליים היא שיטה לא פולשנית, נסבלת היטב כדי לספק תאים, תרופות, או וקטורים ויראליים לכל הגוף כולל מערכת העצבים המרכזית ו1-5 3,5-9 רשתית. פרסומים קודמים לתאר הזרקת פנים וריד זמנית באמצעות transilluminator 10,11, ללא מיקרוסקופ לנתיחה 11,12, או דורשים שני אנשים להזריק 10. טכניקת ההזרקה תוארה בפרוטוקול זה יש יתרון משום שאדם אחד יכול להזריק גורים, ומקור האור כדי לראות את הווריד הזמני לא נוגע בגור, ומבטל את הצורך בפלסטר או הקובץ המצורף של גור למשטח קבועכגון transilluminator 11. משלוח של סוג adeno הקשורים וקטור ויראלי 9 (AAV9) בעכברים מייצר ביטוי חזק בתאי עצב והאסטרוציטים ברחבי המוח וחוט השדרה (איור 1). משלוח תוך-של וקטורים ויראליים לוריד פנים הזמני השטחי נעשה שימוש באופן אמין במחקרים שונים בעכברים בילוד לטיפול בהפרעה עצבית-שרירית בילדים בעמוד השדרה שרירים ניוון (SMA) 2,4,13,14 וסופו של דבר הגדיל את תוחלת החיים של עכברים שטופלו.

הזרקה תוך-של עכברים בילוד המטרה גם ביעילות מערכת עצבים ההיקפית ואיברים היקפיים (איור 2). בעקבות הזרקה של AAV, התמרה של גרעיני שורש הגבי, כבד, לב, שריר שלד, ריאות, ומקלעת myenteric של המעי נצפתה 1,3,6,7,15. התמרה נרחבת של מערכת העצבים המרכזית והפריפריה גורמת שיטה זו של אידאל הזרקה לטיפול במחלות הדורשות ביטוי הגלובלי שלtransgene, כגון המחלות של מחלת גושה 16 ואחסון lysosomal האחר 17,18, מחלת באטן וlipofuscinoses ceroid העצבי קשור, 19 ותסמונת Bardet-Biedl, הפרעה רבה מערכתית גנטית עם הופעת תסמינים המתרחשים בילדות המוקדמת 20. גם הזרקה תוך-לעכברים בילוד צריכה להיחשב כשיטת חדשנית למחלות ילדים מערכתיות דוגמנות. טכניקה זו תורגמה למודלים של בעלי חיים גדולים יותר 5,21 והזרקה תוך-כבר קיים כשיטת קלינית מקובלת של מתן תרופות.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה, יעילה של אספקת סוכנים לעכברים בילוד דרך וריד הפנים זמניים השטחי, לא יאוחר מיום הזרקת 2. לאחר לידה יכולה להסתיים באחת, התאמן פרט ונסבל היטב על ידי שני הגורים והסכרים. גורים חווים מצוקה מינימאלית ולהתאושש במהירות. Importantly, זריקה מוצלחת תביא לאספקה ​​הגלובלית של הסוכן מנוהל. פרוטוקול זה מתאים למשלוח של וקטורים ויראליים, סוכנים או תאי תרופות לעכברים שזה עתה נולד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים המפורטים בפרוטוקול אושרו מכון לשימוש בבעלי חיים ובועדה לטיפול (IACUC) מאוניברסיטת מדינת אוהיו.

1. הכנת סביבת העבודה

  1. לאסוף קרח רטוב כדי להרדים את גורי העכבר, כלוב ריק להפריד את הסכר מההמלטה, מיקרוסקופ לנתח, מקור אור שיכול להיות ממוקם בזווית להזרקה (שימוש במקור אור ב° 90   זווית על הזריקה מטשטשת את הווריד), משטח נקי למקום חי להזרקה, צמר גפן, 3/10 מזרק אינסולין סמ"ק עם 3/8 "30 מחט G (אחד לכל חיה) ו -1% אוונס הכחול צבע ( עשה עם מי מלח פוספט שנאגרו פתרון (PBS)) לאימונים.
  2. הסר את הסכר לכלוב נפרד בעוד מניפולציה הגורים.

נוהל 2. הזרקה

  1. הנח גור אחד ישירות על הקרח הרטוב במשך 30-60 שניות כדי להרדים את החיה. אל תשאיר tהוא חיה על זמן רב מדי קרח בשל סיכון לסיבוכים הקשורים היפותרמיה כוללים פרפור חדרים, היפוקסיה רקמות וחמצת מטבולית.
    הערה: הניסיון שלנו הוא ש30-60 שניות היא מספיק כדי להאט את תנועות הגור כדי לאפשר להזרקה. אם נדרש הרדמה עמוקה יותר, שאיפה כגון isoflurane 1-2% עשויה להיות מתאימה.
  2. בעוד החיה על קרח, לטעון את המזרק עם 30 μl של צבע הכחול אוונס.
  3. כאשר בעלי החיים הוא בהרדמה מלאה, שאושר על ידי חוסר התנועה על הקרח בזמן שעדיין נושם, להעביר אותו מתחת למיקרוסקופ. להזרקה ימנית, ולהתמודד עם לועו של בעל החיים לצד ימין. הנח את האצבע שמאלה על הלוע וזנב האצבע אמצעית משמאל לניצן האוזן כך שניצן האוזן הוא בין האצבע ואמה (איור 1).
  4. לבחון רק קדמי לניצן האוזן לנימים שטחיות שזז כאשר העור הוא מניפולציה. נימים זה לא היעד, אולםזיהוי הוא חשוב לזיהוי וריד זמני. בשלב הבא, אתר וריד כהה, צללים נחותים הנימים שנשארה קבוע, ללא קשר לעמדת עור. הווריד הזמני מופיע צללים, פועל גב אל הגחון, והזנות לוריד הצוואר (איור 1).
  5. הזן את הווריד הזמני עם השיפוע עד המחט. אם הוכנס בצורה נכונה, ניתן להציג את זווית הטית המחט להתמלא בדם דרך העור. ואז לוחץ על המתג לאט ופתק לבן לווריד בצד של הפנים.
  6. לאפשר את המחט להישאר בווריד לשניות 10-15 הוסיפו כדי למנוע זרימה חוזרת של injectant.

3. לאחר הזרקה

  1. לאחר הזרקה נכונה, הגור צריך להפוך לכחול באופן כמעט מיידי. הסר את המחט ולהשתמש בכוח עדין ליישם מקלון צמר גפן לזריקה עד שקרישי הדם.
  2. צג הגור לסימני מצוקה. לאפשר דקות הגור 2-3 להתאושש ולחמם, recognize כאשר הגור הוא בהכרה, זקוף ומרגש, לפני ההחזרה לכלוב. גביע הגורים בידיים בכפפות של החוקר כדי לספק חום מתאים כדי לסייע בהחלמה במידת צורך. לחלופין, הנח כרית חימום מתחת לכלוב בבית כדי להקל על התחממות הגור מוזרק. בדרך כלל לאחר הזרקת צבע הכחול אוונס, להרדים גורים. אינו כולל צבע כאשר הזרקת חומר למבחן.
  3. הנח את הגור בחזרה לכלוב בבית ולהבטיח את הגור מצופה מצעים ו / או nestlet כדי להבטיח reacceptance על ידי הסכר.
  4. השתמש במזרק חדש וקלון צמר גפן לכל גור לשמור על סטריליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במהלך הזרקה נכונה, הווריד לרגע להפוך, או לחלוט ברורים. אם הזרקה לצבוע כל הגור צריך להפוך לכחול בתוך שניות. אם הזרקה לא תקינה התרחשה, לעתים קרובות יש בולוס תת עורי מרוכז בראש או בצוואר וinjectant עלול לדלוף מאתר ההזרקה. זריקות לא נכונה יכולות גם לגרום להופעה של שטפי דם בצוואר. גורים המקבלים זריקות תת עורית (כלומר ההזרקה לא נמסרה באופן מלא בווריד) חווים בדרך כלל אין תופעות לוואי שליליות ובאופן שיגרתי מגיבים לטיפול כמו העכברים שהוזרקו כהלכה לעשות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

משלוח תוך-סוכנים למערכת העצבים המרכזית או בכל הגוף קשה במודלים עכבריים יילודים של מחלה. הפרוטוקול המתואר הוא דרך מהירה, יחסית לא פולשנית לניהול לוריד פתרונות לעכברי יילודים עם דרישות ציוד מינימליות. למרות וריד הפנים הזמני ניתן לראות בעין בלתי מזוינת, ייתכן שיש לי זריקות דיוק רב יותר בשימוש במיקרוסקופ ומקור אור בסיבים אופטיים, במיוחד להזרקה בלתי מיומנת. יש זריקות תוך-בעכברים בילוד שיעור הצלחה גבוה 12, ואת הולכת AAV נצפתה בגורים מוקדמים, גם אם חלק מinjectant מנוהל תת עורי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות NINDS, FightSMA, ומשפחות של SMA לתמיכה כספית. SEGL נתמך על ידי מענק # הכשרת NINDS 5T32NS077984-02.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק אינסולין ThinproTerumoSS30M30093/10 סמ"ק, מחט 3/8 אינץ', 30 גרם, 1 לכל עכבר
צבע כחול אוונססיגמא-אולדריץ'E2129מדלל ל-1% עם 1x אפליקטורים עם קצה כותנה מלוח פוספט חוצץ
פישר סיינטיפיק23-400-101
מקור אור סיבים אופטייםפישר סיינטיפיק12-562-36
ניתוח מיקרוסקופ

מקורות

  1. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
  2. Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
  3. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
  4. Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
  5. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
  6. Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
  7. Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
  8. Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
  9. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  10. Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
  11. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
  12. Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
  13. Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
  14. Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
  15. Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
  16. Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
  17. Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
  18. Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
  19. Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
  20. Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
  21. Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
  22. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
  23. Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
  24. Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Temporal VeinAAVGFPEvans BluePostnatal Day
זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.