גירוי optogenetic של עצב השמיעה

סיכום

שתלי שבלול (CIS) לאפשר שמיעה על ידי גירוי חשמלי ישיר של עצב השמיעה. עם זאת, תדירות עניה ורזולוציה עוצמה מגבילה את איכות שמיעה עם מדינות חבר העמים. כאן אנו מתארים גירוי optogenetic של עצב השמיעה בעכברים כאסטרטגיה חלופית למחקר שמיעתי ופיתוח CIS עתיד.

תקציר

גירוי חשמלי ישיר של תאי עצב הגנגליון ספירלה (SGNs) על ידי שתלי שבלול (CIS) מאפשר הבנת דיבור פתוחה ברוב המכריע של נושאים חירשים מושתלים ^{1 6.} יחד עם זאת, קידוד קול עם חבר העמים הנוכחיים יש תדר עני ורזולוציה עוצמה בשל התפשטות נוכחית רחבה מכל מגע אלקטרודה הפעלת מספר רב של SGNs לאורך ציר tonotopic של השבלול ^{7- 9.} גירוי אופטי מוצע כחלופה לגירוי חשמלי שמבטיחה מרחבית יותר מרותק הפעלה של SGNs ו, ומכאן, ברזולוציה תדר גבוהה יותר של קידוד. בשנים האחרונות, תאורת אינפרא אדום ישירה של השבלול נעשתה שימוש כדי לעורר תגובות בעצב השמיעה ^10. אף על פי כן היא דורשת אנרגיות גבוהות יותר מאשר גירוי חשמלי ^10,11 ועדיין אי ודאות לגבי המנגנון הבסיסי ^12. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על optogenetics כדי לעורר SGNsעם אור כחול בעצימות נמוכות, תוך שימוש בעכברים מהונדסים עם ביטוי עצבי של channelrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ או ביטוי וירוס בתיווך של לתפוס ChR2-גרסת ^14. אנחנו השתמשנו מייקר דיודות פולטות אור (μLEDs) ולייזרים בשילוב סיבים כדי לעורר SGNs ChR2 להביע דרך פתח קטן מלאכותי (cochleostomy) או החלון העגול. אנו assayed התשובות על פי הקלטות קרקפת של פוטנציאלי אור עורר (תגובת optogenetic השמיעתית בגזע המוח: oABR) או על ידי הקלטות microelectrode מהמסלול השמיעתי והשוו אותם עם גירוי אקוסטי והחשמלי.

מבוא

על פי ארגון הבריאות העולמי, 360 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים מאובדן שמיעה. בנושאים חירשים, גירוי חשמלי ישיר של SGNs על ידי חבר העמים לאפשר הבנת דיבור פתוחה ברובם ^1,2,4,5. למרות שחבר עמים כבר מושתלים בלמעלה מ -200,000 בני אדם, ולכן להיות neuroprosthesis המוצלח ביותר, קידוד קול מונע על ידי שתלי השבלול הנוכחיים הוא מוגבל. חבר העמים מבוססים על גירוי חשמלי על ידי מספר מסוים של אלקטרודות שבו כל אחד מפעיל אזור tonotopic של עצב השמיעה ובכך עוקף את איבר החישה מתפקד של קורטי שבשבלול האוזן. מאזיני שמיעה נורמלים יכולים להפלות יותר מ 2,000 תדרים, אך חבר העמים של היום להשתמש רק עד 12-22 ערוצי תדר ^4. זאת בשל זרימה נוכחית נפוצה מכל אלקטרודה מגרה ^7,9, הפעלה מספר רב של SGNs המייצגים תדרי קול שונים ^8,15. זההגבלה ניתן לשפר באמצעות גירוי קוטבי אבל על חשבון צריכת חשמל גבוה יותר ^16,17. הטווח הדינמי התפוקה שלהם לעוצמת קול הוא גם מוגבל, בדרך כלל מתחת ל6-20 dB ^4,18. מסיבות אלה, תדירות שיפור ורזולוציה עוצמה הן מטרות חשובות להגדלת ביצועים של CI לשיפור זיהוי דיבור בסביבה רועשת, הבנת הפרוזודיה ותפיסת מוסיקה.

אפשרות אחרת כדי לעורר את עצב השמיעה היא גירוי אופטי. אור יכול להיות ממוקד במקום נוח למקד אוכלוסיית SGN קטנה, מבטיח כליאת מרחבית טובה יותר, להגדיל את הרזולוציה בתדר וגם הרחבת טווח דינמי, וכתוצאה מכך רזולוציה עוצמה טובה יותר. ואכן, גירוי שבלול עם אור אינפרא אדום הראה רזולוציה תדר מצוינת במודלים של בעלי חיים ^10,11,19. חסרון אחד של גירוי מסוג זה הוא שהיא דורשת אנרגיות גבוהות יותר מאשר גירוי חשמלי ^{10,11. יתר על כן, חששות לגבי יכולתה של השיטה כדי לעורר ישירות נוירונים שמיעתיים הועלו 12,20.}

כחלופה לגירוי אינפרא אדום, אנחנו מעסיקים optogenetics כדי להבהיר SGNs רגיש לאור. Optogenetics היא גישה חדשנית המשלבת טכניקות גנטיות ואופטיות להלא פולשני ובמיוחד לשלוט תאים עם דיוק גבוה זמני (ביקורות ^{21- 23).} השיטה כיום הנפוצה ביותר בשימוש מעסיקה הביטוי של גן חיידקי channelrhodopsin 2 (ChR2) של Chlamydomonas reinhardtii וגרסותיהם, קידוד ערוץ קטיון מגודרת אור ^24. ChR2 הוא חלבון 7-הטרנסממברני סליל ש, כאשר transduced לתוך הנוירונים ומופעלים על ידי אור הכחול, פועל ערוץ קטיון כהלא סלקטיבי, ובכך depolarizing התאים ^{24- 27.} ChR2 התאפיין גם ^{ביום 31 ב24,28-} וריאנטים רבים פותחו כדי לשנות actioספקטרום n, תכונות gating וחדירות ^32,33. מטרת העבודה שלנו היא להקים optogenetics שבלול להפעלה של מסלול השמיעה. נציין כי גישת optogenetic כדי לעורר את עצב השמיעה דורשת מניפולציה גנטית של הגנגליון הספירלה לביטוי של channelrhodopsin. עבודה עם עכברים וחולדות מאפשרת שימוש בבעלי החיים מהונדסים זמינים ^13,34,35, המספקים ביטוי של channelrhodopsin עם שונות קטנות לאורך ציר tonotopic ועל פני בעלי חיים ^36. שילוב אללים מותנים ³⁷ עם Cre-קווים מתאימים מספק לביטוי תא ספציפי. העברת גנים לתוך הגנגליון הספירלה של בעלי חיים אחרים, דורשת שימוש בוירוס כגון וירוס adeno הקשורים שהיא גישה סטנדרטית בoptogenetics ³⁸ ושאנחנו הראו לעבוד גם בעכברים ^36. מניפולציה וביטוי של גנים מושתלים של קידוד חלבונים זרים סיכוני דוב לתופעות לוואי כגון אימונוגלובולינ גנטיתגובות ne ו / או הפצה, מצב התפשר ואפילו למוות של תאי מניפולציות גנטיים. לצורך הדגמה זו אנו משתמשים בעכברים מהונדסים מבטא ChR2 בנוירונים הגנגליון ספירלה תחת promotor Thy-1 ¹³ כדי לעורר את המסלול השמיעתי אופטי. נציין, כי גרסאות channelrhodopsin אחרות יכולות לשמש לאותה המטרה כפי שהראינו באמצעות העברת וירוס בתיווך של לתפוס גרסת ¹⁴ לSGNs ^39.

בעוד optogenetics שבלול דורש מניפולציה גנטית, היא מציעה כוונון מולקולרי לגירוי SGN מותאם והבטחות השתפרו תדר ורזולוציה עוצמה בהשוואה לגירוי חשמלי. גירוי optogenetic של מסלול השמיעה הוא רלוונטי ביותר לדיון מחקר. לדוגמא, היא מבטיחה התקדמות במחקרים של עידון הפעילות תלויה של tonotopy במהלך פיתוח, בניתוח של הדרישה לשילוב של רוח רפאים בlocalizat קוליון ועל מידת האינטראקציה בין תחזיות מביא תדר ספציפי במערכת השמיעה המרכזית.

פרוטוקול

כל הניסויים שהוצגו בעבודה זו נערכו עם הסטנדרטים האתיים שהוגדרו על ידי החוק הגרמני להגנה על חיות מעבדה. לוח אוניברסיטת גטינגן לרווחת בעלי החיים והמשרד לרווחת בעלי החיים של מדינת סקסוניה התחתונה אישרו את הניסויים.

.1 הכנת μLED-ממריץ

1. לμLEDs, להכין μLED-ממריץ ראשון. השתמש בנוריות כחולות עם 200 ידי 200 מיקרומטר משטח פעיל (μLED, לראות לוח חומרים).
2. חוטי הלחמה לμLED. לאחר מכן, לתמצת μLED וחיבורים באמצעות דבק אפוקסי. השאר את לילה המכשיר כדי לאפשר ריפוי אפוקסי.
3. ליציבות מכאנית ובידוד חשמלי לנתב את החוטים דרך נימי זכוכית דקות, להשתמש נימי ורוסיליקט קוטר חיצוני 1 מ"מ ולאטום את הצומת עם אפוקסי (1D איור) באופן שהנימים יכולות להיות מותקנות על מניפולטור מכאני.
   הערה: Tכאן היא תחלופה של מה שהופך את הקפסולה עבה מספיק כדי לקבל בידוד חשמלי טוב (הימנעות חפצי גירוי), אבל דקה מספיק כדי לתת LED לנוע בחופשיות בתוך הבולה ולאתר אותו על cochleostomy. זה תרגול טוב כדי להכין LED יותר מפעם אחת.
4. כדי לאשר את הבידוד חשמלי טוב, להכין ראשון צלחת פטרי עם 0.9% NaCl ו3 חוטי נחושת לטבול הסתיימו חשופים לתוך הנוזל. זה משמש כדי לדמות חיה עם אלקטרודות ABR. לחבר את החוטים לABR-המגבר ומשם לאוסצילוסקופ.
5. ואז, לחבר את LED לממריץ ולטבול אותו לתוך התמיסה עד שהוא מכוסה לחלוטין. כונן LED עם קטניות (ראה שלב 3.1.1) בשעה הנוכחית המרבי המוותרות לזמן רב יותר מאשר 20 דקות ולבדוק חפצי גירוי. אם הם מופיעים, לבטל את LED ולנסות אחד חדש.

2 נוהל כירורגי

1. השתמש 4-10 עכברי בן שבוע מהונדסים מבטא ChR2 תחת אמרגן Thy1.2 (קו 9ובואנג et al. ^13). כדי לתפעל את בעלי החיים ולבצע את הניתוח, תמיד להשתמש בכלים כירורגיים נקיים ומזוהים היטב.
2. הרדימי חיות עם זריקת ip של תערובת של אורתן (1.32 מ"ג / קילוגרם), xylazine (5 מ"ג / קילוגרם), ו0.1 מיקרוגרם / g עצירות מדוללת ב0.9% פתרון NaCl סטרילי ולמקם את העכבר על גבי צלחת חימום לשמירה על גוף טמפרטורה על 37 C °. עם מינון זה, הרדמה בדרך כלל נמשך לכל פרוטוקול הניסוי.
   1. החל 10 דקות לאחר בדיקת אינדוקציה הרדמה ראשונית לסימנים של עוררות על ידי רפלקס נסיגת כפה. במקרה של תנועות, להחיל מנות אחזקה של אורתן (.66 מ"ג / קילוגרם) ועצירות (0.05 מיקרוגרם / g) בדילול מלא ב0.9% פתרון NaCl סטרילי (בלי Xylazine). שוב לבדוק את רפלקס נסיגת הכפה ולהמשיך רק אם רפלקס נעדר.
3. לגלח בזהירות את אזור retroauricular בהכנה של החתך. השתמש retroauricularלהתקרב כדי להגיע לבולה (חלל אוזן התיכון המכיל אוויר).
   1. עם מלקחיים מיקרו לנתח בזהירות ו / או להסיר חלק משרירי הצוואר, למשל, platysma, sternocleidomastoid, וscalenes.
   2. מצא ולחשוף את הבולה (איור 1 א). זהה את הבולה כמבנה גרמי עם צורה כדורית אופיינית עם טבעת על פני השטח הבולה המציינת את הכניסה של עור התוף (איור 1 א). לעשות חור עם קצה מחט אינסולין ממש מתחת טבעת זו. להתחיל שם, להסיר את העצם שמכסה את הבולה עם Rongeur קנס (gnawer) או microforceps באופן כזה שpromontorium של השבלול נחשף (איור 1).
4. לcochleostomy, בעדינות לגלח את הכמוסה הגרמית כדי לפתוח חלון קטן (cochleostomy: ~ 500-800 מיקרומטר), מקפיד להשאיר על כנה את המבוך הקרומי (איור 1). בצע cochleostomy על השבלול השנילהפוך כפי שהוא רחוק מספיק מעורק stapedial ומהשיא. פתיחת הקודקוד יכול לייצר קרע של השבלול כולל בר של modiolus.
5. לכניסת חלון עגולה של סיבים אופטיים או μLED-שתל להלמותו סקאלה, להגדיל את חלון הנישה העגולה בקפידה על ידי מגרד את הנישה הגרמית עם הקצה של סכין מנתחים חדים (מספר להב 11 הוא אפשרות טובה). השתמש תמיד בלהב או אזמל חדש. להיות מאוד זהיר לגבי עורק stapedial פועל קרוב מאוד לחלון העגול (איור 1).

.3 אופטי גירוי באמצעות שתי גישות

1. לגירוי transcochlear, μLEDs שימוש או סיב לייזר בשילוב.
   1. הר נימי ביצוע μLED על מניפולטור מכאני ובזהירות למקם את μLED על cochleostomy. השימוש oABR, שהושרו על ידי 3-10 גירוי ארוך אלפיות שני ממקור זרם (בדרך כלל 5-40 mA ב2.7 V) בשעה 1-5 הרץ, כאמצעי כדי לייעל את המיקום ואוientation של μLED.
   2. לגירוי לייזר, להשתמש בליזר 473 ננומטר רציף גל וסיבים אופטיים 250 מיקרומטר (ראה חומרים). זוג הסיבים האופטיים למקור לייזר כחול שבאופן אידיאלי מציע שליטה אנלוגית מהירה של כוח (אחר להשתמש מכשיר acousto אופטי או תריס מהיר להגדיר הגירוי האופטי). באמצעות micromanipulator, לאתר את קצה הסיב ישירות על גבי cochleostomy ולתקן אותה לשם בעזרת מלט (גירוי transcochlear) שיניים.
2. לגירוי intracochlear, להכניס את הסיבים דרך החלון העגול לתוך הלמותו סקאלה. לאחר מכן, השתמש 3-10 פעימות לייזר אלפיות של 10-30 mW (כוחו של פלט סיבים) בשעה 1-5 הרץ לעורר oABR. משרעת הגדולה של oABR מאפשרת הנסיין להתבונן oABR עורר על ידי גירויים יחידים באוסצילוסקופ לייעול העמדה והכיוון של הפולט (μLED או סיבים) באמצעות משרעת oABR כקריאה החוצה.
3. ברגע שoABR הטוב הושג, לתקן את הסיבים עם cyanoacrדבק ylate או מלט שיניים ולחכות עד שהדבק הוא מוצק.
   הערה: זה נורמלי לראות כמה נוזל שיוצא מהשבלול. עם זאת, כדי למנוע בעיות עם פילמור של המלט, מומלץ לייבש את האזור באמצעות פתילות כותנה משובחות.

.4 הקלטות של oABR

1. הכנס אלקטרודות מחט מתחת לפינה, על הקודקוד ועל הגב ליד הרגליים ולחבר אותם למגבר.
2. להגביר את פוטנציאל ההבדל בין הקודקוד ופטם מחטי subdermal. לדוגמא בשיעור של 50 kHz ומסנן (1-10,000 Hz). דמיין את פוטנציאל ההבדל באוסצילוסקופ באופן אידיאלי ליד הגדרת ההקלטה לייעול העמדה של ממריץ האופטי. השתמש במיצוע אות (50-1,000x) ולאחסן את הנתונים במחשב לניתוח במצב לא מקוון.

.5 הקלטות של פוטנציאלים אופטי עוררתי מקומי שדה

1. מניחים את החיה לתוך מסגרת stereotactic. שימוש באחוזי מלקחייםהעצרת למשוך את העור שמעל הגולגולת ולבצע חתך חציון עם מספריים הארכה בערך מבין העיניים לנקודה שבה שרירי הצוואר לצרף לגולגולת.
   1. לשקף את העור רוחבי. חותך את קרום העצם לאורך לאורך תפר sagittal ולהסיר אותו צידה בעדינות על ידי שפשוף עצם הגולגולת החשוף עם מקלון צמר גפן.
2. מקם לוחית מתכת מותאמת אישית על הגולגולת החשופה משאירה כ 1 מרחב מ"מ בין קצה הזנב של הצלחת ולמבדה. עם קוטר 0.7 מ"מ לקדוח בזהירות לקדוח חור לתוך העצם הקודקודית.
3. בעדינות לדפוק בבורג בקוטר 0.85 מ"מ - לשמש כהתייחסות לפוטנציאלים שנרשמו מcolliculus הנחות (IC) - מחזיק את הבורג עם מלקחיים עוד הבורג לא מהודק. להבטיח קשר טוב בין הבורג ודורה בלי לחדור למוח. מדביק את הבורג ולוחית המתכת על גבי הגולגולת עם דבק cyanoacrylate.
4. שחרר את nשרירי Eck בעדינות מהגולגולת. משוך את שרירי צוואר caudally למ"מ 1-2 בערך. זהה את הצומת של סינוס מעולה sagittal (SSS) וסינוס הרוחבי (TS). במידת צורך, להגביר את השקיפות של הגולגולת על ידי הרטבת העצם עם פתרון NaCl פיסיולוגי.
   1. זהה את IC בעכברים כשוכבים ישירות זנב לצומת SSS וTS. לאחר זיהוי של המיקום של IC לאט ובזהירות לבצע בערך בקידוח הארכה 0.5 מ"מ rostrally 1.5 מ"מ caudally לTS ובערך 3 מ"מ רוחבי.
   2. הימנע מכל פגיעה בSSS וTS כמו אלה ימנעו ניסוי מוצלח. כאן, לבדוק אם העצם החלול שהפך רפוי על ידי ברכות דוחפים אותו. שימוש במלקחיים לאט להרים את העצם.
5. עם מתאם מתאים לצרף מערך רב ערוצי וheadstage על micromanipulator. כדי למנוע הרס מערך הקלטה רבת ערוצים בעת ההכנסה לתוך IC, בזהירות להסיר את הדורהעם קצה מכופף של מחט מזרק קטנה מתחיל קרוב לקצה עצם.
   1. הסר את החיה מהמסגרת stereotaxic. לתקן את לוחית המתכת על הבר להישאר קיבעון stereotaxic. מקם את הבדיקה ההקלטה על IC ולהכניס אותו תחת שליטה מיקרוסקופית כאלה שברוב הערוץ העליון הוא רק גלוי על פני השטח.
6. להגביר את פוטנציאל ההבדל בין הערוצים הבודדים של מערך ההקלטה ובורג ההתייחסות בעצמות הקודקודית, מדגם בשיעור של 32 kHz, מסנן נמוך לעבור (300 הרץ) וחנות במחשב לניתוח במצב לא מקוון.
7. כל בעלי החיים צריכים להיות מורדמים באנושיות בסוף ההליך לפני התאוששות הרדמה בהתאם להנחיות המתת חסד רלוונטיות. שיטות מתאימות של המתת חסד עשויות לכלול נקע בצוואר הרחם או משאיפת CO _2.

תוצאות

Cochleostomy אופטימלי הוא קריטי ומגדיל את ההסתברות של ניסוי מוצלח. משמעות דבר היא החלון הוא רגיל, קטן, ואין שום פציעתם של מבני שבלול הפנימיים. לדוגמא, דימום מצביע על נזק של vascularis stria. דוגמא טובה מוצגת באיור 1 ב.

באמצעות עכברי ChR2-מהונדסים, ChR2 בא לידי הביטוי בSGNs בתוך שבלול האוזן (איור 1 ג). תאורת אור כחולה, או על ידי μLED או לייזר, מעוררת oABR הגדול, ש...

דיון

הניסויים שתוארו להפגין גירוי optogenetic של SGNs, ויכולים, בעיקרון, לשמש גם כדי לעורר תאי שיער פנימיים ו / או חיצוניים, הניתנים הביטוי לopsins. ניסויים אלה דורשים סבלנות וטיפול הרבה. כפי שהוזכר קודם, השלבים הקריטיים ביותר הם cochleostomy / הכנסה טובה עגולה חלון, כמו גם מיקום מתאים וכיוון של מקור האור.

יש מגבלות עם גירוי optogenetic בעת שימוש ChR2. במקרה העליות משרעת oABR שלנו עם עוצמת אור ומשך דופק אבל יורד כאשר ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	חומר הרדמה
קסילזין HCl	RXV		הרגעה ומשכך כאבים
בופרנורפין	רקיט בנקיזר		משכך כאבים
Dumont #5 מלקחיים	Fine Science Tools	11251-10	הוא משמש להחזקת רקמות קשות, למשל עצם או חומרים. לעולם אל תשתמש בהם להחזקת רקמות עדינות רכות
Dumont #5 - מלקחיים עדינים	כלי מדע עדינים	11254-20	לשימוש רק להחזקת רקמות רכות
מספריים עדינים - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	לפתיחת העור ועזרה בדיסקציה של השרירים
Lempert Rongeurs	כלי מדע עדינים	16004-16	הם שימושיים מאוד להסרת העצם בקלות מהלייזר בולה
473 ננומטר	צ'אנגצ'ון תעשיות חדשות	MLL-III473	100 mW מצב מוצק 473 ננומטר
לייזר דרייבר	צ'אנגצ'ון תעשיות חדשות	DPSSL MLL 100 mW	TTL מופעל דרייבר לייזר
250 ומיקרו; m סיבים אופטיים	כל מסחרי; למשל Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	שלוט בכמות האור המשולבת לסיב מבקר הלייזר
עבור מודולטור Acousto-optical	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	שלוט במודולטור האקוסטו-אופטי
Solo2 מד כוח ואנרגיה לייזר	Gentec-EO		משמש למדידת עוצמת האור של ה-LED והלייזר המשולב בסיבים
כחול ומיקרו; לד	קרי	C470UT200	יש צורך לבנות כמה μ מכשירי LED מכיוון שנפגעים בקלות או שהבידוד אינו מספיק טוב
מערכת TDT	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	ניתן להשתמש בו בכל מערכת ליצירת גירויים  הצגה ורכישת נתונים
שוק יחיד, בדיקת סיליקון 16 ערוצים	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	מדובר במכשירים שבירים, יש לטפל בהם בזהירות ולנקות אותם לאחר השימוש
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	לבצע קרניוטומיה עבור הקלטות IC והשתלת בורג ייחוס
מיקרו מקדחה פלדה קוצים	כל פרסומת; למשל Fine Science	Tools 19007-07
בורג עצם הקשה עצמית	כל פרסומת; למשל Fine Science Tools	19010-10	בורג ייחוס
מיקרומניפולטור	כל פרסומת; e. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 ציר		מיקום של בדיקת הקלטה