דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

סיכום

נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.

תקציר

נמטודות Entomopathogenic (aka EPN) מייצגות קבוצה של נמטודות מאכלסת-האדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. נמטודות אלה שייכות לשתי משפחות: Steinernematidae וHeterorhabditidae. עד כה, יותר מ -70 מינים תוארו בSteinernematidae ויש כ 20 מינים בHeterorhabditidae. יש לי נמטודות שותפות mutualistic עם חיידקי Enterobacteriaceae ויחד הם פועלים כמתחם קוטלי חרקים רב עוצמה שהורג מגוון רחב של מיני חרקים.

במסמך זה, אנו מתמקדים בטכניקות הנפוצות ביותר נחשבות לאיסוף EPN מהקרקע. החלק השני של מצגת זו מתמקד בטכניקה מתגרה חרקים, גישה בשימוש נרחבת עבור הבידוד של EPN מדגימות קרקע, ואת טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת להתאוששות של נמטודות אלו מחרקים נגועים. שיטות וטכניקות אלה הן שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של כת EPNures במעבדה וגם יוצר את הבסיס למבדקים אחרים, כי רואים נמטודות אלה כאורגניזמים מודל למחקר בתחומים ביולוגיים אחרים. הטכניקות שמוצגים במצגת זו מתאימות לאלו שבוצעו ו / או שעוצבו על ידי חברי המעבדה בורסת SP, כמו גם אלה שתוארו על ידי מחברים שונים.

מבוא

נמטודות רבות הקשורים לחרקים, ואינטראקציות המארח שלהם נעות בין מועיל למזיק. במסמך זה, אנו מתמקדים בקבוצה של נמטודות, כי הם פתוגנים של חרקים, הידוע גם בנמטודות entomopathogenic (או EPN). שתי משפחות נמטודות שייכות לקבוצה זו של נמטודות: Steinernematidae וHeterorhabditidae ^11,13. ההשפעה פתוגניים שלהם היא בעובדה שמעניקה את האינטראקציה שלהם עם חיידקים אנאירוביים פקולטטיביים enteric (חיידקי Xenorhabdus לקשר עם steinernematids וחיידקים Photorhabdus לקשר עם heterorhabditids) ^2. החיידקים וקטורים ממארח ​​חרק אחד למשנהו על ידי את הבמה רק נמטודות חיים החופשית, לנוער בשלב השלישי התולעת (הידוע גם בנוער dauer, לנוער התולעת או IJ), שחיה בקרקע. ברגע שנכנס החרקים, נמטודות לשחרר את החיידקים לתוך hemolymph של החרקים, שהורג את מארח החרק על ידי הרעלת דם מסיבית. החיידקים גםבזות רקמות של החרקים ולהיות מקור המזון 'נמטודות, ומאפשר להם להגיע לבגרות ולהתרבות. בדרך כלל, דור אחד או שניים של נמטודות המבוגר מיוצר בתוך פגר החרקים. הצאצאים של reassociates הדור המבוגר שעבר עם כמה תאי חיידקיים במתמחים יותר בצורה מאשר היחסים התזונתיים הקודמים שלהם, ולטפח את התאים האלה במעיים שלהם, כאשר הם עוברים מ פגר החרקים לתוך האדמה שם הם ממתינים לחרקים אחר לparasitize ^6,11,14 (איור 1).

מאז הגילוי שלהם ב1927, EPN היה נחשב חלופות בעלות ערך לחומרי הדברה כימית כפי שהם יכולים parasitize מגוון רחב של חרקים, כי הם מזיקים חקלאיים ^3,4,5. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, נמטודות אלה וחיידקים סימביוטיים הוכרו כמערכת מודל נזיל לחקר היבטים ביולוגיים, אקולוגיים והאבולוציוני של interactio מארח-חיידק¹⁴ NS.

המטרה של מצגת זו היא להראות את השיטות וטכניקות הנפוצות ביותר לדגימת אדמה ובידוד של EPN. מגוון רחב של כלים זמין ויכול לשמש לאיסוף דגימות קרקע ובם: מקלפות אדמה, כפות סיידים, חופרי הודעה חור, מקדחים, צינורות דגימה, אתים שני, בין השאר (איור 2).

בהתאם לצורך של המחקר, יכולות להיחשב שתי אסטרטגיות דגימה:) מרובדת, ב) דגימה אקראית (איור 3). הדגימה מרובדת משמשת בדרך כלל כחלק מלימוד אינטנסיבי באזור מסוים או demarked על פני תקופה נתונה של זמן. באופן כללי, חתך הוא demarked ודגימות קרקע נלקחות במרווחי זמן קבועים בחתך על פני תקופה של זמן (איור 3 א) ^15. הדגימה האקראית היא בדרך כלל מועסק כאשר מתמקדים באזור נרחב. אסטרטגיית דגימה זו הייתה בשימוש ללימוד המגוון של EPN וrom שטח גדול גיאוגרפי או באזור (איור 3 ב) ^12. מספר גורמים יכולים להיחשב בהתאם למיקוד של המחקר הכולל מגוון רחב של גבהים, מרקמי קרקע ובתי גידול (לדוגמא., שדות מעובדים, יערות, שטחי מרעה, פארקים, חופי ים, אזורי riparian, וכו ').

אנחנו מראים את הטכניקה מתגרה חרקים, שתוארה במקור על ידי מצעים ^ו1 Akhurst ומהווה חלופה פשוטה וסלקטיבית לשחזור EPN מדגימות קרקע. זהו הליך סלקטיבית המבוסס על ההנחה כי נמטודות (שלב IJ) יימשך למארח חרקים וparasitize זה. טכניקה זו יכולה להיחשב גם לבידוד של פתוגנים אחרים חרקים כגון פטריות, חיידקים ^ו8,10.

אנחנו גם מדגימים את טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת לאחזור צאצאי נמטודות ממארחי חרקים נגועים ^7,14. זה מאמץ נפגשהוד שמציע את היתרון של אחזור נמטודות צאצאים "נקיים" ללא פסולת מגוויות חרקים משפילות.

לבסוף, הטכניקות המתוארות ומוצגות במאמר זה מתאימות לאלה שהגו ו / או שבוצעו במעבדה שלנו, כמו גם אלה שתוארו על ידי עמיתים ומשתפי פעולה שונים.

פרוטוקול

1. אוסף דוגמאות קרקע

1. שקול המשתרע על שטח מינימאלי של 2 - 4 מ ^'2 עבור כל אתר דגימה.
2. לאסוף דגימות קרקע בעומק של לפחות 15 סנטימטר (איור 4).
3. קח לפחות 5 דגימות אקראיות בתוך תחום זה.
4. קח 3 subsamples לדגימה. בהתאם למטרת המחקר, או לשלב את subsamples או לשמור אותם בנפרד.
5. מניחים כל דגימה בשקית ניילון. שקול כפול לצוד, כדי למנוע דליפה של דגימות (איור 4).
6. דוגמאות לייבל עם סמן עמיד למים. כלול את המידע הבא מכל אתר דגימה: מידע באתר (כולל יישוב / אזור / שם אתר ולתאם מידע GPS), תאריך, בית גידול, צמחייה קשורה, טמפרטורה, גובה, וכו '
   הערה: במידת צורך, לאסוף ו / או להקליט את נוכחותם של חרקים או חסרי חוליות אחרות שנאספו במדגם לזיהוי שלאחר מכן. הם עשויים לייצג נאטור פוטנציאלמארחים אל EPN.
7. כלי איסוף נקיים בין דגימות על ידי שטיפה ביסודיות עם מים ו / או חיטוים עם 70% אתנול או 0.5% פתרון אקונומיקה.
8. שמור דגימות בצידנית (8-15 מעלות צלזיוס) במהלך הובלה למעבדה.
9. קח את חלק של דגימת הקרקע לניתוח כדי להשיג מידע על הרכב קרקע, מרקם, לחות, מוליכות חשמליות או פרמטרים אדמה רצויים אחרים.

. 2 בידוד נמטודות מדגימות קרקע: טכניקת חרקים מתגרה

1. הסר את כל פסולת (כלומר., סלעים, חתיכות עץ או קליפה, עלים, וכו '.) שנאסף בדגימות שלך כדי למנוע זיהום עם מיקרואורגניזמים saprobic.
2. מוסיף מים כדי ללחלח את הקרקע ולהקל על התנועה של נמטודות.
   הערה: השתמש בבקבוק ספריי כדי להגדיל את רמת הלחות של הקרקע באיטיות.
3. הנח כ 200-250 מיליליטר של אדמה לחה במכל פלסטיק נקי עם מכסה.
4. להוסיף פיתיונות חרקים. שקול 5-10 חרקים על פני הקרקע של כל דגימה (איור 5).
5. כסה את המכל עם מכסה ולהפוך את מכולות.
6. לשמור על מכולות בחושך ועל RT (בדרך כלל 22-25 מעלות צלזיוס).
7. בדוק מכולות כל 2 - 3 ימים ולהסיר חרקים מתים.
   הערה: להוסיף חרקים בריאים נוספים לכל מכולה למתגרה נוסף של דגימת הקרקע.
8. הסר את החרקים מתים מהמכולות. הערה: גוויות עם חום או צבע אוקר בדרך כלל parasitized ידי steinernematids, בעוד הלבנים האדומים לגופות סגולות כהות parasitized ידי heterorhabditids.
9. יש לשטוף גופות במים סטריליים.
10. מניחים גופות במלכודת לבנה הותאם להתאוששות של צאצאי נמטודות (ראה הליך בהמשך).

מלכודת לבנה השתנה:. 3 נמטודות שחזור מגוויות נגועות

1. הנח את החלק העליון של קוטר 50 (או 60) מ"מ. צלחת פטרי בתוך צלחת גדולה יותר (100 מ"מ).
2. הגדרת חטא אחדנייר GLE מעגלי מסנן (# Whatman 1) בתוך הצלחת קטנה יותר.
3. גופות מניחים על נייר הסינון של המנה קטנה יותר מה שהופך את גופות בטוחים לא נוגעות זה בזה, כדי למנוע כל זיהום.
4. מלא את צלחת פטרי החיצונית (גדולה יותר) עם CA. 20 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים. אל תוסיפו מים בצלחת שמחזיקה את הגופות.
5. מכסה את צלחת פטרי הגדולה ואת התוכן שלה עם המכסה (איור 6).
6. תווית מנות בהתאם. הוסף את הפרטים הבאים: שם נמטודות (מינים / לבודד), תאריך זיהום (זיהום נקבע מועד) ותאריך מלכודת (זה תאריך המלכודת מוגדרת).
7. שמור מלכודת ב RT עד הופעתה של התולעת שלבים לנוער (IJS) מתרחשת. תהליך זה יכול לקחת בין 10-25 ימים בהתאם למין נמטודות ו / או המאמץ הנחשב.
8. מים קציר עם IJS על ידי הסרת הצלחת הגדולה יותר של המלכודת ולשפוך מים עם נמטודות לתוך מבחנה.
9. לאפשר לנמטודות למזוג לתחתית בתייקר. תהליך זה עשוי לקחת כמה דקות.
10. יוצקים מים בזהירות, מה שהופך נמטודות בטוחה תישאר בתחתית הכוס.
11. יש לשטוף נמטודות על ידי הוספה יותר מים ומאפשרים לנמטודות למזוג. צעד זה יכול להיות חוזר ונשנה 2 - 3 פעמים עד שהמים נקיים.
12. הנח השעיה נמטודות בבקבוק תרבית רקמה (250 מיליליטר). שמור על ריכוז של ההשעיה ל1,000 - 3,000 מיליליטר / נמטודות.
13. בקבוק חנות עם תליוני נמטודות בחדר קר או בחממה בין 10-20 ° C.
    הערה: לבדוק צלוחיות מאוחסנות מעת לעת כפי שחיי מדף של EPN הוא משתנה. בדרך כלל ניתן לאחסן steinernematids ל6-12 חודשים ללא הצורך בsubculturing, ואילו heterorhabditids עשוי לדרוש בדיקות תקופתיות יותר.

תוצאות

אוסף דוגמאות קרקע

קטינים התולעת שלישי בשלב של EPN השלבים רק בחינם החיים במעגל החיים 'נמטודות אלה אשר מתגוררים באדמה (איור 1). לכן, איסוף דגימות קרקע היא שיטה יעילה מאוד להתאושש מנמטודות אלו. איור 4 מראה פרופיל קרקע המציין את העומק שבו צריכים לקחת דגימות. שמירה על הלחות של מדגם היא גורם מפתח להישרדות של נמטודות. כתוצאה מכך, חשוב לשמור על דגימות קרקע בשקיות ניילון ולשמור אותם בטמפר...

דיון

הפגנה זו היא הראשונה מבין שתי מצגות המתארות את מספר הטכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד EPN והחיידקים סימביוטיים שלהם. טכניקות אלו מייצגות שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN במעבדה וגם יוצרות את הבסיס למבדקים אחרים שמעסיקים EPN כמו אורגניזמים מודל למחקר.

סקרי קרקע שונים של EPN הראו כי השפע וההפצה שלהם יכולים להשתנות על פני עונות השנה, בתי גידול ואזורים גיאוגרפיים ^{4, 5,9,15.} גורמים כגון מרקם קרקע, ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	לטכניקת פיתיון חרקים
נייר סינון, 55 מ"מ דרגה 1 תאית	Whatman/VWR	28450-048	תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה
60 x 15 מ"מ צלחות פטרי	VWR	25384-092	תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה
100 x 15 מ"מ צלחות פטרי	VWR	25384-088	תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה
שקיות ניילון ZIPloc	Ace Hardware או חנות		מקומית דגימת קרקע
פיפטור מכני P1000, P200 מ"ל	VWR	89130-562; 89130-566	תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה
טיפים לפיפטור 1000 מ"ל, 200 מ"ל	VWR	16466-004 ; 53510	תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה
Bleach	Ace Hardware או חנות		מקומית דגימת קרקע, חיטוי
נתרן היפוכלוריט	Ace Hardware או חנות		מקומית דגימת קרקע, חיטוי
70% אתיל alochol	AAPER	17212945	דגימת קרקע, חיטוי
אתים	Ace חומרה או חנות לחומרי בניין מקומית	N/A	דגימת קרקע
דגימת קרקע צינורית	Accuproducts		דגימת קרקע
קרקע, ידית ארוכה	Nupla	PRB4T 69401	דגימת קרקע
סרט מדידה	Ace Hardware או חנות		דגימת קרקע
סרט דגל, צבעים שונים	Ace Hardware או חנות		מקומית דגימת קרקע
צלוחיות תרבית רקמות	VWR	Falcon, 29185-304	מלכודת לבנה, אוסף EPN
בקבוקי כביסה, פוליאתילן, פה רחב	VWR	16650-107	מלכודת לבנה, אוסף EPN