כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ"א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הלב העוברי דג הזברה מורכב מרק כמה מאה תאים, המייצג רק חלק קטן של כל העובר. לכן, כדי למנוע transcriptome הלב מלהיות רעול פנים על ידי transcriptome העוברית הגלובלית, יש צורך לאסוף כמות מספקת של לבבות לניתוח נוסף. יתר על כן, כהתפתחות לב דג הזברה ממשיכה במהירות, אוסף לב ושיטות מיצוי RNA צריכים להיות מהיר כדי להבטיח אחידות של הדגימות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה במדריך מהיר לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות מעוברי דג הזברה. זהו תנאים הכרחיים להפקת RNA לב ספציפית שלאחר מכן כדי לקבוע את רמות ביטוי גני לב ספציפיות על ידי transcriptome ניתוחים, כגון תגובה בזמן אמת כמותי שרשרת של פולימראז (RT-qPCR). השיטה מבוססת על מאפיינים דבקים ההפרש של הלב העוברי דג הזברה בהשוואה לרקמות אחרות; זה מאפשר לPHY המהירהפרדת sical של לב מרקמת extracardiac על ידי שילוב של הפרעה fluidic כוח הגזירה, סינון בשלבים ואיסוף ידני של לבבות שכותרתו fluorescently מהונדסים.
מבוא
דג הזברה (Danio rerio) נעשתה שימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית ללמוד organogenesis in vivo בשל התפתחותה מהירה, שקופה וextrauterine העוברית, בשילוב עם גודל קטן ואת הזמינות של קווי כתב מהונדסים עם ביטוי רקמות הספציפיות של חלבוני ניאון. חוליות קטנות זה היא גם מתאים במיוחד ללמוד פיתוח לב כי חמצון של עובר דג הזברה המוקדם אינו מסתמך על קצב לב וזרימת דם; תכונות אלה אפשרו את האפיון של מספר רב של מוטציות לב וכלי דם 1,2 והדג הזברה היא עכשיו אורגניזם מודל להכרה רחבה ללמוד מחלות לב 3.
ללמוד ביטוי גנים במהלך התפתחות עוברית, תעתיקים מנות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של החוק הגרמני ומדינת ברלין; טיפול דג הזברה היה פיקוח על ידי הרשות המקומית להגנה על בעלי חיים (LaGeSo, ברלין-ברנדנבורג).
1. קבלת עוברי דג הזברה ללב Extraction
- דג הזברה צלב לב כתב כגון Tg (myl7: EGFP) twu34 קו מהונדס 9 על מנת לקבל עוברים עם ביטוי לב ספציפי GFP.
- שמור את העוברים במי ביצה על 28.5 מעלות צלזיוס עד השלב העוברי הרצוי 10,11. ודא ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן אנו מתארים ניסוי נתיחת לב נציג באמצעות דג הזברה Tg (myl7: GFP) twu34 קו מהונדס 9, המבטא את החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אך ורק בתוך שריר הלב (איור 1).. אספנו שני לבבות גזורים ועובר ממנה הם נגזרו על מנת להעריך את טוהר של מדגם הלב. בקצרה, Tg הומוזיגוטים (myl7: GFP) דג הזברה twu34 9 היו outcrossed עם wild-type, כך שכל הלבבות העובריים תויגו GFP. 500 עוברים כמה (56 hpf) הועברו לתוך צינורות 1.5 מיליליטר (כ. 100 עוברים בכל .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מאפשר להעשרה המהירה של רקמת לב עוברית דג הזברה לביטוי גני מנתח. הכמות והאיכות של מדגם RNA לב הספציפי מאוד תלויה במספר צעדים חיוניים: ראשון, כמות המדגם הוא השתפר מאוד אם אובדן הלבבות נמנע בכל שלב של הפרוטוקול, מאז טיהור RNA תעבוד רק עם מספיק חומר מוצא. שנית, את הטוהר של המדגם, שתלוי לחלוטין בניסוי, נקבע על ידי מיון ואיסוף לבבות בתוך צלחת פטרי תוך הדרה מוחלטת רקמות אחרות. שלישי, איכות מדגם ביקורתית תלויה בהגבלת השפלה RNA שיכול להתרחש על שיבוש של העוברים; זו מושגת על ידי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות ל-C. Burns, C. McRae על התוויית העיקרון הבסיסי של פרוטוקול טיהור זה, ול-F. Priller על היישום הראשוני של שיטה זו במעבדה שלנו. ס.א.-ס. נתמך על ידי פרופסור הייזנברג של ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). עבודה זו נתמכה על ידי מענק DFG SE2016/7-1.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ציוד לגידול דגים ואיסוף ביצים | עיין בספר דג הזברה11 לפרטים | ||
| סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי | |||
| מיקרוצנטריפוגה | |||
| UV-ספקטרופוטומטר | למשל תא | ||
| אלקטרופורזה | |||
| של חומצות גרעין Thermo Scientific Nanodrop 2000צלחות פטרי 4 ס"מ Ø, מצופות 1% אגרוז במיקרופיפטות בינוניות | |||
| וטיפים (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 מ"ל צינורות | |||
| 15 מ"ל ו-50 מ"ל צינורות | |||
| זוג מלקחיים | |||
| דומונט #5ExactaCruz ™ טיפים עגולים לטעינת ג'ל במדף סטרילי, 1-200μ l | סנטה קרוז | sc-201732 | |
| 100 μ מסנן m (מסננת תאים BD Falcon 100 מ"מ)BD | Biosciences | 352360 | |
| 30 μ מסנן m (מסנני הפרדה מוקדמת-30 ומיקרו; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| ג'ל נעילת פאזה, כבד, צינורות 1.5 מ"ל | פריים | 2302810 | |
| מי ביצים בינוני | 60 μ גר'/מ"ל מלחי ים אינסטנט אוקיינוס ב-ddH2O, 0.00001% (w/v) מתילן | ||
| כחול E3 בינוני | 5 מ"מ NaCl, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl<תת>2, 0.33 מ"מ MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי טריקאין, pH 7 |
| 1% אגרוז (במדיום E3) | |||
| 1% ג'ל אגרוז (במאגר TBE) | |||
| לייבוביץ&חריף; s L-15 בינוני | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (סרום בקר עוברי) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| גליקוגן | Invitrogen | 10814-010 | 20 ומיקרו; g/µ l במים נטולי RNase |
| כלורופורם | |||
| איזופרופנול | |||
| 75% אתנול (ב-DEPC-ddH2O) | |||
| מאגר העמסת חומצות גרעין | |||
| מאגר TBE (Tris/Borate/EDTA) לאלקטרופורזה |
מקורות
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
