כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ"א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הלב העוברי דג הזברה מורכב מרק כמה מאה תאים, המייצג רק חלק קטן של כל העובר. לכן, כדי למנוע transcriptome הלב מלהיות רעול פנים על ידי transcriptome העוברית הגלובלית, יש צורך לאסוף כמות מספקת של לבבות לניתוח נוסף. יתר על כן, כהתפתחות לב דג הזברה ממשיכה במהירות, אוסף לב ושיטות מיצוי RNA צריכים להיות מהיר כדי להבטיח אחידות של הדגימות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה במדריך מהיר לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות מעוברי דג הזברה. זהו תנאים הכרחיים להפקת RNA לב ספציפית שלאחר מכן כדי לקבוע את רמות ביטוי גני לב ספציפיות על ידי transcriptome ניתוחים, כגון תגובה בזמן אמת כמותי שרשרת של פולימראז (RT-qPCR). השיטה מבוססת על מאפיינים דבקים ההפרש של הלב העוברי דג הזברה בהשוואה לרקמות אחרות; זה מאפשר לPHY המהירהפרדת sical של לב מרקמת extracardiac על ידי שילוב של הפרעה fluidic כוח הגזירה, סינון בשלבים ואיסוף ידני של לבבות שכותרתו fluorescently מהונדסים.
מבוא
דג הזברה (Danio rerio) נעשתה שימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית ללמוד organogenesis in vivo בשל התפתחותה מהירה, שקופה וextrauterine העוברית, בשילוב עם גודל קטן ואת הזמינות של קווי כתב מהונדסים עם ביטוי רקמות הספציפיות של חלבוני ניאון. חוליות קטנות זה היא גם מתאים במיוחד ללמוד פיתוח לב כי חמצון של עובר דג הזברה המוקדם אינו מסתמך על קצב לב וזרימת דם; תכונות אלה אפשרו את האפיון של מספר רב של מוטציות לב וכלי דם 1,2 והדג הזברה היא עכשיו אורגניזם מודל להכרה רחבה ללמוד מחלות לב 3.
ללמוד ביטוי גנים במהלך התפתחות עוברית, תעתיקים מנותחים בדרך כלל על ידי כל הר הכלאה באתר (רוצה) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, או רצף הדור הבא (RNA-Seq) 7. בעודמאחלים מאפשר ניתוח של מרחב וזמן של ביטוי גנים בכל העובר, רמות תמליל בדרך כלל הוערכו על ידי RT-qPCR, microarrays או גישות RNA-Seq. עם זאת, שיטות אלו דורשות העשרת רקמה לפרופיל ביטוי גנים ספציפי.
מאז הלב העוברי דג הזברה מייצג חלק קטן מכל העובר, מחקרי transcriptome במהלך התפתחות לב דורשים פרוטוקול לנתיחה והעשרה של לבבות. בנוסף, כדי לקבל נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, חשוב לשמור על רקמת הלב מתפקדת במלואה עד מיצוי RNA. כאן, אנו מתארים פרוטוקול למהירות בידוד מבחינה פיזיולוגית נורמלי ולבבות פועמים ממאה עוברי דג הזברה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה ביעילות לניתוח נוסף. השיטה הנוכחית מתבססת על הפרוטוקול שדווח על ידי ברנס וMacRae, 2006 8. להעשרת רקמת לב, שתי השיטות להשתמש בקו כתב שריר לב מהונדסולנצל את תכונות הידבקות ההפרש של לב עוברי דג הזברה לעומת רקמות אחרות. בקצרה, על ידי pipetting עוברים רבים מעלה ומטה באמצעות פיפטה קצה צר, לבבות משתחררים בו-זמנית מגופים עובריים ולאחר מכן הופרדו מעוברית פסולת בשני שלבי סינון מהירים; לבבות שכותרתו fluorescently מכן מסודרים באופן ידני מפסולת שנותרה ושנאספו לעיבוד נוסף.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של החוק הגרמני ומדינת ברלין; טיפול דג הזברה היה פיקוח על ידי הרשות המקומית להגנה על בעלי חיים (LaGeSo, ברלין-ברנדנבורג).
1. קבלת עוברי דג הזברה ללב Extraction
- דג הזברה צלב לב כתב כגון Tg (myl7: EGFP) twu34 קו מהונדס 9 על מנת לקבל עוברים עם ביטוי לב ספציפי GFP.
- שמור את העוברים במי ביצה על 28.5 מעלות צלזיוס עד השלב העוברי הרצוי 10,11. ודא שאוכלוסיית העובר שנאסף היא הומוגנית מבחינה גנטית והן על ידי שלב ההתפתחותי להגביל שינויים בביטוי גנים.
- Dechorionate את העוברים באופן ידני.
2. לבבות עובריים דג הזברה ביתור
הערה: שמור את כל הפתרונות על קרח. במידת האפשר, לעשות עבודת צוות: אדם אחד מנתח את לבם מEMBryos ואילו אדם אחר ממיין את לבם תחת סטראו הקרינה. זה מאפשר העיבוד של כמה מאות עוברים בכמה שעות.
- העבר כ -100 עוברים לתוך צינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגה. להרדים את העוברים עם tricaine (0.16 מ"ג / מיליליטר במדיום E3). המשיכו פעם אחת את העוברים בבירור מורדמים (הם לא יודעים לשחות ומשקעים לחלק התחתון של הצינור, אבל בלבם עדיין מכה).
- הסר את הפתרון / E3 tricaine ולשטוף את העוברים פעם אחת עם L-15/10% בינוניים FBS 1 מ"ל ולשמור על קרח.
הערה: הבינוני FBS L-15/10% חשוב לשמור איברים ותאי חיים במהלך ההליך כולו לנתיחה עד הלב הועבר לRNAlater או Trizol. - הוספת L-15/10% בינוניים FBS 1 מיליליטר לעוברים ופיפטה למעלה ולמטה 5-8 פעמים עם טעינת ג'ל טיפ עגול עד החלמון משתבש לחלוטין. פיפטה עוברי ירידה מבחינת על פני השטח של הפתרון, כך שהירידה תתפוצץ והעוברים הם שיבשו בעדינות.
הערה: כיצד מרץ ובאיזו תדירות יש לי העוברים להיות pipetted למעלה ולמטה תלוי בשלב ההתפתחותי של העוברים, יש צורך בכלומר יותר pipetting בשלבים מאוחר (למשל בגיל 56 hpf). - למנה הראשונה של עוברים גזורים, להעריך את היושרה של העוברים וחלקם של לבבות גזורים תחת סטראו, שכן חלק לבבות עשויים להישאר מחובר לעוברים אם pipetted מדי בעדינות. התאם את אופן pipetting לסיבובים הבאים של נתיחה בהתאם.
הערה: השתמש בעצות פיפטה השמירה נמוכות וצינורות microcentrifuge כדי למזער את לב דבק הפלסטי. - החל המדגם על מסנן 100 מיקרומטר מונח על שפופרת 50 מיליליטר צנטריפוגה; לשטוף את צינור 1.5 מיליליטר עם מדיום FBS L-15/10% מיליליטר 1 ולאחר מכן ליישם את זה למסנן כדי להקטין את איבוד של המדגם (כמה לבבות אפשר להידבק לקירות של הצינור). שטוף את המסנן פעמיים עם 1 מיליליטר L-15 / 10% FBS. בשלב זה את לבם עובר דרך המסנן ונאסף בצינור 50 מיליליטר.
- החל הזרימה דרך על מסנן 30 מיקרומטר ממוקם על צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולשטוף את המסנן פעם אחת עם 1 מיליליטר L-15/10% בינוניים FBS. בשלב הסינון השני, הלב נשמרים במסנן והפסולת קטנה היא לשטוף.
- הפעל את המסנן הפוך ולשטוף את הלבבות מתוך המסנן לתוך 1% צלחת פטרי מצופה agarose על ידי יישום שלושה שוטף רצוף עם FBS L-15/10% 1 מיליליטר.
- באופן ידני להפריד לבבות GFP חיובי מפסולת nonfluorescent העוברית (למשל עדשות העין) עם זוג המלקחיים תחת סטראו הקרינה ולרכז אותם במרכז הצלחת. לאסוף אותם על פי שלב 3.
הערה: אם העוברים הם בנים יותר מ 24 hpf, הלב צריך להיות מכות, מצביע על כך שהרקמות עדיין מבחינה פיזיולוגית נורמליות.
3. בידוד mRNA מDissecלבבות טד
- לאסוף את הלבבות בהיקף הקטן ביותר האפשרי (למשל 10 μl) וטפטף לתוך צינור 1.5 מיליליטר מכיל 0.75 מיליליטר RNAlater (על קרח). ודא שאין לבם להישאר בקצה פיפטה על ידי הצגתו תחת סטראו הקרינה.
- לחלופין, אם מכסה המנוע כימי זמין בסביבתו הקרובה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להעביר את לבם נאסף לתוך Trizol (זהירות) מתחת למכסת המנוע הכימי. זה עוקף את האובדן האפשרי של לבבות דבק בקצה פיפטה וגם במהלך צנטריפוגה של הלב (שלבים 3.4, 3.5 ו -3.7). בריכת הלבבות מכמה סיבובים של בידוד לתוך הצינור עם Trizol ולעבור ישירות לשלב 3.8; הנפח הסופי לא יעלה על 10% מהמקורי Trizol הנפח.
הערה: קרא את גיליון Trizol נתונים על בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש. ידית מגיב Trizol מתחת למכסת מנוע ובלאי מומלץ ציוד מגן אישי. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים וclothing. הסר את כל מקורות הצתה. - בריכת לבבות מכמה סיבובים של בידוד לתוך הצינור עם RNAlater (על קרח), כיעילות של בידוד RNA משתפרת עם כמות הרקמה שנאספו. אם נפח הדגימה הכולל עולה על 10% מRNAlater המקורי הנפח, להשתמש בצינור נוסף עם 0.75 מיליליטר RNAlater לאחסון (על קרח).
- צנטריפוגה הדגימות ב15,700 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C משקע הלבבות.
- תחת סטראו הקרינה, לאסוף בזהירות כמה שיותר supernatant ככל האפשר לתוך 1% צלחת פטרי מצופה agarose המכילה L-15/10% בינוניים FBS 3 מיליליטר, אבל לא להפריע את לבם משקע בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה. מאז עד 15% מהלב יכולים להישאר בsupernatant בשל הצמיגות הגבוהה של RNAlater, לשלוף אותם כמתואר בשלב 3.7.
- מתחת למכסת מנוע כימי, להוסיף 0.5 מיליליטר Trizol לצינור המכיל את לבם משקעים ולשמור על קרח.
- תחת microsco הניאוןPE, להעביר את לבם (משלב 3.5) מהצלחת מצופה agarose 1% המכיל את פתרון FBS RNAlater / L-15/10% למנה אחרת מצופה agarose 1% עם FBS L-15/10% 3 מיליליטר לדלל את RNAlater. לאסוף את הלב במרכז צלחת פטרי ולהעביר אותם בנפח קטן לתוך הצינור של לבבות משקעים בTrizol מתחת למכסת מנוע כימית.
- מערבולת צינור 1.5 מיליליטר המכיל את הלבבות בTrizol לשבש את לבם ואת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- מתחת למכסת מנוע כימי, להוסיף כלורופורם 100 μl (זהירות), ומערבב היטב ולהעביר את הפתרון / כלורופורם Trizol לצינור 1.5 מיליליטר PLG-הסתחרר מראש (צנטריפוגות 30 שניות במהירות המרבית לפני השימוש). דגירה של 3 דקות בטמפרטורת חדר.
הערה: קראו את MSDS כלורופורם לפני השימוש. ידית מגיב כלורופורם מתחת למכסת מנוע ובלאי מומלץ ציוד מגן אישי. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים ובגדים. הרחק מincompatibles כגון מתכות, בסיסים. - Centrifuge המדגם ב15,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C ולהעביר את השלב המימי לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש.
- להוסיף 5-10 גליקוגן מיקרוגרם ו -250 μl precooled (ב -20 ° C) isopropanol; מערבב היטב ודגירה במשך הלילה ב -20 ° C.
- צנטריפוגה המדגם ב15,700 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
- שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר אתנול 75%, צנטריפוגות ב 15,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
- בואו להתאדות אתנול על ידי ייבוש גלולה בטמפרטורת חדר עד שהוא הופך לבנה (לדוגמא במשך 10-15 דקות).
- להוסיף DDH RNase ללא 20 μl 2 O לגלולה ודגירה של 10-15 דקות ב 55 ° C לפזר RNA; אז לשמור על קרח.
- להעריך את ריכוז RNA וטהרה על ידי מדידת הספיגה. להעריך את שלמות RNA על ידי הפעלת המדגם על 1% agarose ג'ל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן אנו מתארים ניסוי נתיחת לב נציג באמצעות דג הזברה Tg (myl7: GFP) twu34 קו מהונדס 9, המבטא את החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אך ורק בתוך שריר הלב (איור 1).. אספנו שני לבבות גזורים ועובר ממנה הם נגזרו על מנת להעריך את טוהר של מדגם הלב. בקצרה, Tg הומוזיגוטים (myl7: GFP) דג הזברה twu34 9 היו outcrossed עם wild-type, כך שכל הלבבות העובריים תויגו GFP. 500 עוברים כמה (56 hpf) הועברו לתוך צינורות 1.5 מיליליטר (כ. 100 עוברים בכל ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מאפשר להעשרה המהירה של רקמת לב עוברית דג הזברה לביטוי גני מנתח. הכמות והאיכות של מדגם RNA לב הספציפי מאוד תלויה במספר צעדים חיוניים: ראשון, כמות המדגם הוא השתפר מאוד אם אובדן הלבבות נמנע בכל שלב של הפרוטוקול, מאז טיהור RNA תעבוד רק עם מספיק חומר מוצא. שנית, את הטוהר של המדגם, שתלוי לחלוטין בניסוי, נקבע על ידי מיון ואיסוף לבבות בתוך צלחת פטרי תוך הדרה מוחלטת רקמות אחרות. שלישי, איכות מדגם ביקורתית תלויה בהגבלת השפלה RNA שיכול להתרחש על שיבוש של העוברים; זו מושגת על ידי ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות ל-C. Burns, C. McRae על התוויית העיקרון הבסיסי של פרוטוקול טיהור זה, ול-F. Priller על היישום הראשוני של שיטה זו במעבדה שלנו. ס.א.-ס. נתמך על ידי פרופסור הייזנברג של ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). עבודה זו נתמכה על ידי מענק DFG SE2016/7-1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ציוד לגידול דגים ואיסוף ביצים | עיין בספר דג הזברה11 לפרטים | ||
| סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי | |||
| מיקרוצנטריפוגה | |||
| UV-ספקטרופוטומטר | למשל תא | ||
| אלקטרופורזה | |||
| של חומצות גרעין Thermo Scientific Nanodrop 2000צלחות פטרי 4 ס"מ Ø, מצופות 1% אגרוז במיקרופיפטות בינוניות | |||
| וטיפים (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 מ"ל צינורות | |||
| 15 מ"ל ו-50 מ"ל צינורות | |||
| זוג מלקחיים | |||
| דומונט #5ExactaCruz ™ טיפים עגולים לטעינת ג'ל במדף סטרילי, 1-200μ l | סנטה קרוז | sc-201732 | |
| 100 μ מסנן m (מסננת תאים BD Falcon 100 מ"מ)BD | Biosciences | 352360 | |
| 30 μ מסנן m (מסנני הפרדה מוקדמת-30 ומיקרו; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| ג'ל נעילת פאזה, כבד, צינורות 1.5 מ"ל | פריים | 2302810 | |
| מי ביצים בינוני | 60 μ גר'/מ"ל מלחי ים אינסטנט אוקיינוס ב-ddH2O, 0.00001% (w/v) מתילן | ||
| כחול E3 בינוני | 5 מ"מ NaCl, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl<תת>2, 0.33 מ"מ MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי טריקאין, pH 7 |
| 1% אגרוז (במדיום E3) | |||
| 1% ג'ל אגרוז (במאגר TBE) | |||
| לייבוביץ&חריף; s L-15 בינוני | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (סרום בקר עוברי) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| גליקוגן | Invitrogen | 10814-010 | 20 ומיקרו; g/µ l במים נטולי RNase |
| כלורופורם | |||
| איזופרופנול | |||
| 75% אתנול (ב-DEPC-ddH2O) | |||
| מאגר העמסת חומצות גרעין | |||
| מאגר TBE (Tris/Borate/EDTA) לאלקטרופורזה |
מקורות
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
