מאמר שיטה

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/52095

⸱

18 בנובמבר 2014

 , 
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) הם סוג של מולקולות רגולטוריות שנשמרו באופן נרחב. כאן אנו מתארים שיטת שיבוט miRNA המסתמכת על שני שלבי קשירה חזקים ואחריהם ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה שלנו מאפשרת כימות מדויק בכל הגנום של miRNAs.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיבוט מירנה ורצף תפוקה גבוהה, המכונים miR-Seq, עומד לבד כגישת transcriptome רחבה לכמת miRNAs עם רזולוציה נוקלאוטיד יחידה. טכניקה זו לוכדת miRNAs על ידי הצמדת מתאמי 3 'ו 5' oligonucleotide למולקולות מירנה ומאפשרת גילוי דה נובו מירנה. צימוד עם פלטפורמות רצף של הדור הבא חזקות, miR-Seq כבר סייע בחקר ביולוגיה מירנה. עם זאת, הטיות משמעותיות שהוצגו על ידי צעדי קשירת oligonucleotide מנעו miR-Seq להיות מועסק ככלי quantitation מדויק. מחקרים קודמים מראים כי הטיות בשיטות miR-Seq הנוכחיים לעתים קרובות להוביל לכימות מדויק מירנה עם שגיאות עד 1,000 פי כמה miRNAs 1,2. כדי לפתור הטיות אלה הנחילה ידי קשירת RNA, שפיתחנו שיטת קשירת RNA קטנה שגורמת ליעילות קשירה של מעל 95% עבור שני 3 'ו 5' צעדי קשירה. בהשוואות im זההוכיח שיטת בניית ספרייה באמצעות miRNAs הסינתטי equimolar או באופן דיפרנציאלי המעורב, באופן עקבי תשואות קוראים מספרים עם סטייה של פחות מכפולה מהערך הצפוי. יתר על כן, שיטת miR-Seq יעילות גבוהה זו מאפשרת יצירת פרופילי מירנה מדויקת הגנום מדגימות רנ"א הכל in vivo 2.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתודולוגיות מבוססות רצף תפוקה גבוהה כבר מיושמות באופן נרחב הרבה דגימות ביולוגיות בשנים האחרונות מאוד להרחיב את ההבנה של המורכבות המולקולרית של מערכות ביולוגיות 3,4. עם זאת, הכנת דגימות RNA לרצף תפוקה גבוהה לעתים קרובות מקנה הטיות ספציפיות הגלומות למתודולוגיה המועסקות, המגבילות את התועלת הפוטנציאלית של טכניקות רבות עוצמה אלה. הטיות שיטה ספציפית הללו תועדו היטב להכנות ספרייה מבוססת-קשירה, הקטן-RNA 1,2,5,6. הטיות אלה מובילים לוריאצית 1,000 פי בקוראים מספרים לmiRNAs הסינתטי equimolar, מה שהופך את ההיסק של שפע מירנה מנתוני רצף נוטים בפראות משתנה וטעייה.

מחקרים המתמקדים במאפיינים של ligases RNA T4-נגזר הפאג תעדו כי האנזימים להציג את העדפות המבוסס על נוקלאוטיד 7, שבאו לידי ספריות מוטות כמו בניסויי רצף תפוקה גבוהה 1,2,8. על מנת למזער את ההטיות הנחילה ידי ligases RNA, אסטרטגיות מרובות להיות מועסקת; macromolecular צפיפות 9, באופן אקראי, רצף נוקליאוטידים של מתאם החשמל, הוא הפרוקסימלי לאתר קשירת 6, ומעסיק ריכוזים גבוהים של קשירת מתאם 2. באמצעות שילוב של שלוש הגישות הללו פיתחנו עבודת זרימה להכנה משוחדת של ספריות RNA קטנות תואמות לרצף תפוקה גבוהה (איור 1). להשוואה ישירה בין פרוטוקולים הנוכחיים והשיטה מותאמת שלנו, אנא פנה אל הדו"ח האחרון שלנו 2. שיטה מותאמת זה מניב יעילות קשירה של יותר מ 95% בשני 3 'ו 5' צעדים ומאפשרת קשירה משוחדת של מולקולות RNA קטנות מדגימות סינתטיות וביולוגיות 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: זה קריטי כדי לשמור על תנאי RNase ללא במהלך ההליך כולו.

1. Adenylation של 3 'לינקר

  1. לדלל oligonucleotide DNA המיועד לתגובות קשירה '3 עד 100 מיקרומטר בH nuclease ללא 2 O.
    הערה: oligonucleotide צריך 'קבוצת פוספט, dinucleotide אקראי ב5' 5 הסוף, וdideoxycytosine '3. 5 'קבוצת פוספט היא דרישה של אנזים MTH ל5 יעיל' adenylation 10. פוספט ניתן להוסיף על ידי טיפול מקדים של oligonucleotide עם kinase polynucleotide, או הורה עם השינוי באופן ישיר. Dinucleotide האקראי בסוף '5 הוא חשוב למזעור העדפת הרצף שתערוכת ligases RNA לסוף-סוף מסוים הצטרפות תגובות על פני אחרים 6. 3 'dideoxycytosine מציב אלמנט חסימה ב3' סוף t oligonucleotideo מעכב את ההיווצרות של concatamers מקשר מקשר במהלך שלבי קשירה לאחר מכן ומשמש גם לחסום "סוף מולקולת מירנה-לינקר נוצרה בסוף 3 '3 תגובת קשירת 11. רצף מקשר oligonucleotide שנבחר לשיטת miR-Seq משוחד הוא כדלקמן: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 '.
  2. להרכיב את התגובה הבאה adenylation: 200 pmol 3 'oligonucleotide מקשר, 4 μl 10x 5' חיץ adenylation DNA, 4 μl 1 מ"מ ATP, 4 μl האנזים MTH RNA, H nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 40 μl.
  3. דגירה תגובה על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לסיים תגובה על ידי חימום עד 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  4. לזרז מקשר adenylated על ידי התוספת של 2.5 כרכים של 100% אתנול ו 1/3 נפח של 10 אצטט M אמוניום להסיר ATP שייר ולמנוע ligations בלתי צפוי בתגובות עתידיות.
    1. בקצרה, לערבב אלcohol, מלח, ופתרון אוליגו להומוגניות, מסתובב במהירות מלאה בmicrocentrifuge (~ 15,000 XG) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שטוף את הכדור באתנול 70%, אוויר יבש, וגלול בנפח המתאים של H nuclease ללא 2 O להניב 50-100 מיקרומטר של אוליגו adenylated.
  5. לאשר adenylation על ידי הפעלת ג'ל polyacrylamide 18%.
    1. הכן את הג'ל על ידי הערבוב הבא ביחד: 6.3 אוריאה g, 6.75 מיליליטר של acrylamide 40%, ו -1.5 מיליליטר של 10x TBE. הוספת H 2 O ל -15 מיליליטר.
    2. מערבבים עד האוריאה נמס לגמרי ולהוסיף 150 μl 10% (w / v) persulfate אמוניום (APS) ו -15 tetramethlyethylenediamine μl (TEMED).
    3. ברגע שג 'קבע, שלפני ריצה למשך 30 דקות ב 24 V / סנטימטר של רוחב ג'ל עם TBE 1x חיץ פועל בטמפרטורת חדר. ברגע 30 דקות היא עד בארות מיושרות עם הפעלת מאגר.
    4. לערבב 5 pmol של אוליגונוקלאוטידים adenylated עם ונפח שווה של חיץ טעינת RNA denaturing 2x (95% v / v) Formamide (,0.02% (w / v) SDS, 0.02% bromophenol כחול (w / v), 0.01% (w / v) קסילן Cyanol, 1.0 מ"מ EDTA), חום לזמן קצר ל -75 מעלות צלזיוס, וצמד מקורר בקרח. לוותר מדגם כולו לתוך הבאר של הג'ל. כמו כן כולל סכום זהה של שליטה שאינה adenylated, ותקני גודל משקל מולקולריים נמוכים.
    5. הפעל את הג'ל על 24 V / סנטימטר עד bromophenol הכחול הוא ¾ מהדרך לתחתית הג'ל. לפרק מנגנון, ג'ל לאחר כתם עם פתרון SYBR-זהב 1x ב1x TBE ולדמיין על תיבת UV-transilluminator (איור 2).
      הערה: ג'ל לטהר את אוליגו adenylated באופן דומה לזה שתואר לעיל, אם "אין RNA קלט" בקרות וכתוצאה מכך כמות גבוהה של מוצר ה- PCR בהשוואה לדגימות עם RNA קלט.

2. לינקר קשירת 3 End "של מירנה

  1. קשירת '3
    1. להרכיב את הרכיבים על הקרח הבאים, לפי הסדר הרשום: 1.0 מיקרוליטר 50% (w / v) 8000 PEG, 0.5 &956 #; l 10x חיץ האנזים RNA (500 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 100 מ"מ MgCl 2, 10 מ"מ DTT), 1.0 מיקרוליטר adenylated 3 'לינקר (100 מיקרומטר), מעכב RNase 0.5 μl, .5-8.0 מיקרוגרם רנ"א הכל, האנזים 0.5 μl RNA T4 2, H nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 5 μl.
    2. מערבבים את התגובה על ידי pipetting כפתרון הוא צמיג מדי למערבולת בשל הריכוז הגבוה של PEG 8000. מעורבים ברגע יסודיות, למקם את התגובה בCycler תרמית עם מכסה מחומם. הגדר את הבלוק 16 מעלות צלזיוס, ודגירה של 4 שעות.
      הערה: התגובה יכולה להיות מדורגת עד נפח סופי של 20 μl בלי לפגוע ביעילות קשירה. להגיב ל4 שעות בטמפרטורת הסביבה או הלילה ב 4 ° C כדי להניב את יעילות קשירה זהה במהות.
  2. טיהור ג'ל
    1. בעקבות קשירה '3, לערבב את התגובה עם נפח שווה של חיץ טעינת 2x RNA. חום עד 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהצמיד מגניב על קרח.
    2. הפעל את המדגם על 15% ג'ל polyacrylamide לטיהור עמוד.
      1. הכן ג'ל polyacrylamide 15% המכיל 7 M אוריאה, באופן דומה לזה שתואר קודם לכן בשלב 1.5.
      2. טרום להפעיל את הג'ל על 24 V / סנטימטר של רוחב ג'ל ללפחות 30 דקות. כבה את אספקת חשמל, בארות סומק, מדגם עומס וג'ל לרוץ באותו מתח כמו לפני ריצה.
      3. טען את המדגם ולהפעיל את עמוד עד bromophenol הכחול יש רק יצא ג'ל. המוצר הרצוי יעבור קרוב לcyanol קסילן.
  3. מכתים, ויזואליזציה, וכריתה
    1. לפרק מנגנון ג'ל וג'ל המקום במגש נקי עם חיץ 1x פועל (TBE), SYBR-זהב 1x, ורוק במשך 15 דקות.
    2. הסר ג'ל ממנה מכתימה ולדמיין על תיבת transilluminator UV המכוסה בניילון נצמד נקי. מוצר קשירה צריך להיות סביב 45 נוקלאוטידים באורך.
    3. בלו האזור הכולל את מוצר קשירה עם razo נקילהב r ומקום ב0.5 מיליליטר צינור מיקרו צנטריפוגות.
  4. בידוד מוצר ורטיבות
    1. תחתון פירס של 0.5 צינור מיליליטר microcentrifuge עם מחט G 30 ובמקום צינור הפירסינג בנמוך ההחזקה נקייה שנייה,, 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב~ 15,000 x ז.
    2. חזותי לאשר שכל פרוסה ג'ל עברה דרך החור בצינור הפנימי. במידת צורך, להשתמש בקצה פיפטה נקי לדחוף כמה שברי ג'ל קרובים יותר לחור.
    3. מחק את צינור 0.5 מיליליטר הריק ולהוסיף 400 μl של חיץ טור גבוה מלח (HSCB 400 מ"מ NaCl, 25 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 0.1% SDS) לסלארי acrylamide. צינור רוק (ים) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    4. העבר את התרחיף לטור ספין אצטט 0.22 מיקרון תאית באמצעות פיפטה קצה רחב נשא. צנטריפוגה במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר בXG ~ 15,000 כדי לאסוף את כל הנוזל ממטריצת ג'ל acrylamide.
    5. העבר את הנוזל לשפל ההחזקה נקייה,, צינור 1.5 מיליליטר מכילing 1 μl של 20 מ"ג / מיליליטר גליקוגן. הוסף נפח שווה של isopropanol ו1/10 נתרן אצטט נפח ה. מערבבים פתרון על ידי היפוך כמה פעמים צינור ולזרז במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    6. צנטריפוגה במהירות מלאה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עד גלולה חומצות הגרעין. הסר supernatant ולשטוף באתנול 70%. גלולה האוויר יבשה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולהמשיך ישירות 5 צעד קשירה ".

3. מקשר קשירת 5 'סוף-3 מירנה' היברידי לינקר

  1. לחומצות גרעין pelleted, להוסיף את המרכיבים הבאים: 2 μl PEG 8000 (50% w / v), 0.5 μl 10x RNA אנזים מאגר, ATP 0.5 μl (10 מ"מ), 0.5 μl NN-RNA אוליגו (100 מיקרומטר), ו- H 2 O לנפח סופי של 4 μl.
    הערה: ההרכב "אוליגו NN-רנ"א 'הוא כדלקמן 5'ההפוך dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3' והיה מטוהר באמצעות HPLC על ידי היצרן.
  2. מערבביםמדגם זה על ידי pipetting למעלה ולמטה שוב ושוב. לעשות את זה במשך זמן מה (עד 5 דקות) כדי להבטיח שהגלולה כבר לגמרי מחדש solubilized. אם מחדש solubilization הוא בעייתי, לחמם בקצרה המדגם (3-5 דקות) עד 37 מעלות צלזיוס ולחדש pipetting לערבב.
  3. ברגע שהכדור הוא חזרה בפתרון, להעביר את התוכן לצינור נקי PCR המכיל 1 μl של 1: 1 תערובת של מעכב RNase ו- T4 RNA אנזים 1 (5 יחידות). שוב מערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה.
  4. דגירה התגובה בCycler תרמית על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. פנה מייד לסינתזת cDNA.

4. שעתוק לאחור / cDNA סינתזה

  1. מוסיף את הרכיבים הבאים ל5 'תגובת קשירת: 2 μl חיץ 5x RT, 0.75 μl 100 מ"מ DTT, μl 1 Illumina RT פריימר 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 "(1 מיקרומטר), ו -0.5 dNTPs μl (10 מ"מ).
  2. מערבבים על ידי pipetting וחום עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן לקרר לאט בt הספסלop.
  3. ברגע שהתגובה מתקררת לטמפרטורת חדר, צינור מקום על קרח ולהוסיף 0.5 μl כל אחד מאנזים טרנסקריפטאז ההפוך ומעכב RNase. מערבבים על ידי pipetting והמקום בCycler תרמית לצעד הסיומת מצויינים בהוראות היצרן.
  4. ברגע שתוספת שלמה 5 μl של H nuclease ללא 2 O להביא את הנפח הסופי של ספריית cDNA עד 15 μl.

5. ספריית הכנה

  1. לאינדקס PCR, להרכיב את התגובה על קרח הבא: 6 μl 5x Phusion מאגר, dNTPs 1 μl (10 מ"מ), 0.9 μl DMSO, 0.75 μl 5 'פריימר (25 מיקרומטר), 0.75 μl 3' פריימר (25 מיקרומטר), ספריית 3 μl cDNA (ריכוז משתנה בהתאם לכמות של הקלט), 0.5 μl Phusion פולימראז (יחידת 1), H-nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 30 μl. בחר רצפי פריימר כדי להבטיח תאימות עם התבנית ואת פלטפורמת הרצף שלבחירה.
    1. הפעל את תגובת PCR עם ההגדרות הבאות: denaturation הראשוני על 98 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, במשך 4 המחזורים הראשונים, לפגל 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, לחשל על 50 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, להאריך ב 72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות .
      הערה: בהתאם לכמות חומר ההזנה, להשתנות כולל מספרי מחזור PCR. בדרך כלל, לקלט של 1-2 מיקרוגרם של רנ"א הכל, 13 מחזורי PCR כולל מספיקים כדי ליצור את ספריית miR-Seq.
    2. לבצע מחזורים שלאחר מכן, לדוגמא, מחזורי 5-12, באופן דו-שלבים שבו מחזורי חישול וסיומת משולבים ויבוצעו על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות וdenaturation הוא שוב 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות.
      הערה: נפח התגובה היא 30 μl להתיר השהיית תכנית ה- PCR ולהסיר aliquot 10 μl במספרי מחזור שנקבע מראש כדי לפקח על מראה של מוצר רצוי. בדרך כלל, מחזורי 10, 13, ו -16 נבחרו לבדיקה מסך מדגם RNA.
  2. הכן8% ג'ל acrylamide שאינו denaturing על ידי ערבוב 2 מיליליטר של acrylamide 40%, 1 מיליליטר של 10x TBE, ו- H 2 O ל 10 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 10% APS 100 μl ו -10 μl של TEMED. יוצקים ג'ל ולתת סט.
    1. טרום להפעיל את הג'ל על 12 V / סנטימטר של רוחב ג'ל למשך 30 דקות. בארות סומק. הוסף 1 μl של חיץ טעינת 10x (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 טריס-HCl pH 8.0 מ"מ, 0.1% (w / v) SDS, 0.01% (w / v) bromophenol הכחול), להוסיף 10 μl של מדגם היטב בכל ממדים 5 מ"מ x 1 מ"מ x 15 מ"מ. בדרך כלל, כל אחד גם יכול לטעון עד 30 μl של דגימות. הרץ את הג'ל המדגם ב 10 V / סנטימטר של רוחב ג'ל במאגר 1x TBE עד הצבע הכחול bromophenol רק נגמר תחתית הג'ל.
    2. כתם ולדמיין ג'ל כמתואר בשלב 2.3.
    3. בלו להקת זוג 146 הבסיס וelute לילה ב0.25 מיליליטר של HSCB באופן דומה למה שתואר בסעיף 2.4. משקע DNA בנפח שווה של isopropanol ו1/10 נתרן אצטט נפח ה. גלולה לשטוף בדואר 70%thanol וגלול במאגר TE.
    4. לכמת את הספרייה באמצעות PicoGreen פי המלצות יצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות הצפויות לשיטה הקודמת צריכים להיות בתחילת תצפית של משמרת אחת נוקלאוטיד (גידול) בגודל של oligonucleotide DNA שהיה כפוף לadenylation על ידי האנזים MTH RNA (איור 2). בעקבות קשירה '3, להדמיה של ג'ל acrylamide מציינת (ראה איור 3) להקות חדות משקל מולקולרי גבוהות באו לידי ביטוי באזור נוקלאוטיד 100-300 של הג'ל. זה מצביע על כך מדגם RNA הכולל בשימוש הוא באיכות גבוהה (לא מושפל). שנית יש לבחון אות בהירה מאוד באזור 25 נוקליאוטידים של ג'ל, שהוא ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתודולוגיה שתוארה במסמך זה עושה שימוש במספר משתנה מפתח למקסם את יעילות קשירה, כלומר ריכוז גבוה של PEG, השימוש בlinkers אקראי, וריכוז גבוה של linkers 2,6,9. גישה זו מאפשרת ספריות רצף אמין כמותי מדגימות RNA הכולל 2. ערכנו titrations מרובה של RNA הקלט והגעתי למסקנה כי המתודולוגיה הקודמת היא מתאימה ביותר עבור כמויות RNA הכוללת בטווח 1-8 מיקרוגרם (מידע לא מוצג). כאשר כמויות בטווח 10-500 ng משמשות, רוב שטח הקריאה הוא נצרך על ידי concatamers מתאם ורצפי חיידקים שממנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לחברי מעבדת יי ובמיוחד לג'אוג'י ז'אנג על דיונים פוריים בנוגע לתכנון קישורים ויעילות הקשירה, כמו גם לאגודה האמריקאית לסרטן על תמיכתם בעבודה זו באמצעות מלגת פוסט-דוקטורט (#125209) ל-J.E.L. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך גם על ידי המכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס R01AR059697 (לר.י.) ומענק מחקר ממכון לינדה קרניק לתסמונת דאון. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3 'Linker (5' זרחני, 3' חסום)טכנולוגיות DNA משולבותמותאמות אישית
5' Linkerטכנולוגיות DNA משולבותמותאמות אישית5' חסומות, HPLC מטוהר
T4RNL2 (1-249 K227Q)New England BiolabsM0351Sמתמחה בקשירת מתאמי DNA טרום-אדניליים
10x מאגר קשירה (ללא ATP)ניו אינגלנד מעבדות ביולוגיותכלולות במאגר קשירה M0351S
10x (עם ATP)מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדכלולות ב-M0204L
RNaseOUTInvitrogen10777-019
פוליאתילן גליקול (מול. משקל 8,000)מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדכלולות ב-M0204L
אמביוןמים ללא נוקלאזAM9937מצאנו שמים שנאספו ממנגנון זיקוק הם באיכות שווה.
T4RNL1ניו אינגלנד BiolabsM0204L
Superscript III RT ערכתInvitrogen18080-051 
ערכת PCR שלניו אינגלנד ביולאבסM0530S
Illumina RP1 פריימרטכנולוגיות DNA משולבותרצף מותאם אישיתזמין מ-Illumina
Illumina RT פריימרטכנולוגיות DNA משולבותמותאם אישיתזמין מ-Illumina
Illumina Index פריימר/יםDNA משולבותמותאמות אישיתמידע על רצף זמין מ-Illumina
40% אקרילאמידפישר סיינטיפיקBP14081
אוריאהסיגמא אולדריץ'U6504
אמוניום פרסולפטסיגמא אולדריץ'A3678
טטרמתיאתילנדיאמין (TEMED)סיגמא אולדריץ'T9281
2x מאגר טעינת RNA דנטורינגאינגלנד ביולאבסכלול עם סכיני גילוח M0351S
VWR55411-050
צינורות SpinX Centricon CostarCLS8161
צינורות מיקרופוגה עם שמירה נמוכהפישר סיינטיפיק02-681-320
Sybr GoldInvitrogenS-11494
ערכת דנילציהניו אינגלנד BiolabsE2610L
מידע מידע רצף טכנולוגיות ניו

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
  2. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109(2013).
  3. Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
  4. Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
  6. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).
  7. McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
  8. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).
  9. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
  10. Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
  11. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
  12. Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
  13. Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNAmiR SeqRNAcDNAmiRNAs

מאמרים קשורים