Method Article

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל In vivo דימות אופטי

DOI:

10.3791/52136

⸱

January 5th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בפלואורופורים להדמיה in vivo יכול להיות מוגבל מאוד על ידי אופסוניזציה, פינוי מהיר, רגישות זיהוי נמוכה והשפעות ציטוטוקסיות על המארח. אנקפסולציה של פלואורופורים בליפוזומים על ידי הידרציה ואקסטרוזיה מובילה לכיבוי והגנה פלואורסצנטיים המאפשרים הדמיה in vivo עם רגישות גילוי גבוהה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה אופטית מציעה מגוון רחב של שיטות אבחון ומשכה עניין רב ככלי להדמיה ביו-רפואית. למרות המספר העצום של טכניקות הדמיה הקיימות כיום וההתקדמות במכשור, עדיין יש צורך בבדיקות רגישות ביותר המתאימות להדמיה in vivo. בעיה אופיינית אחת של בדיקות פלואורסצנטיות פרה-קליניות זמינות היא הפינוי המהיר שלהן in vivo, מה שמפחית את רגישות ההדמיה שלהן. כדי לעקוף את הפינוי המהיר, להגדיל את מספר מולקולות הצבע באתר המטרה, ובכך להפחית את האוטופלואורסצנטיות ברקע, נעשה אנקפסולציה של הצבע הפלואורסצנטי הקרוב לאינפרא אדום, DY-676-COOH בליפוזומים ואימות הפוטנציאל שלו להדמיה in vivo של דלקת. DY-676 ידוע ביכולתו להרוות את עצמו בריכוזים גבוהים. תחילה קבענו את הריכוז המתאים למרווה עצמית, ולאחר מכן עטפנו את ריכוז המרווה הזה בחלק הפנימי המימי של ליפוזומים PEGylated. כדי לבסס את פוטנציאל המרווה וההפעלה של הליפוזומים אנו משתמשים בשיטת הקפאה קשה המובילה לפגיעה בקרומים הליפוזומליים מבלי להשפיע על הצבע העטוף. הליפוזומים המאופיינים ברמה גבוהה של כיבוי פלואורסצנטי נקראו Lip-Q. אנו מראים על ידי ניסויים עם קווי תאים שונים כי קליטת Lip-Q היא בעיקר על ידי פגוציטוזיס, מה שבתורו איפשר את אפיון הפוטנציאל שלו ככלי להדמיה in vivo של דלקת במודלים של עכברים. יתר על כן, אנו משתמשים במודל בצקת המושרה על ידי זימוסן בעכברים כדי לבסס את הפוטנציאל של Lip-Q בהדמיה אופטית של דלקת in vivo. בהתחשב בספיגה אפשרית עקב אפקט חדירות ושימור משופר (EPR) הנגרמת על ידי דלקת, ניסויים בבעלי חיים הושוו לניסויים בבעלי חיים פורמולציה של ליפוזום הפועל תמיד עם ריכוז נמוך ולא מרווה של DY-676-COOH (המכונה Lip-dQ) ו-DY-676-COOH החופשי ל-Lip-Q.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליפוזומים נחקרו באינטנסיביות ויהוו את אחד ממערכות אספקת הסמים ביו-רפואיות ביולוגית ביותר עבור יישומים קליניים 1,2. הם מורכבים בעיקר מפוספוליפידים וכולסטרול, אשר שניהם תרכובות ביולוגית מחקה חלקים של קרום תא טבעי. אילו יכולים לנפול בפח חומרים הידרופילי בפנים המימי, ניתן לשלב סוכני lipophilic בתוך bilayer פוספוליפידים liposomal 3. Encapsulation של חומרים בתוך הפנים מימיים של יפוזומים מעניק הגנה מפני השפלה in vivo וגם מונע המערכת המארחת מהשפעות רעילות של תרופות ציטוטוקסיות המשמשות לטיפול במחלות, לדוגמא chemotherapeutics נועד להשמיד תאים סרטניים. השינוי של פני השטח liposomal עם פולימרים כמו polyethylen....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הנהלים אושרו על ידי ועדת בעלי החיים האזורית ובהתאם להנחיות בינלאומיות על השימוש האתי בבעלי חיים.

1. הכנת חומרים ומכשירים

  1. הכנת פיזור שלפוחית ​​נוצר באופן ספונטני (SFV)
    1. לפזר ולהכין מלאי של פתרונות פוספוליפידים הבאים: 214 מ"ג / מיליליטר phosphatidylcholine ביצה (EPC), 134 מ"ג / מיליליטר כולסטרול, 122 מ"ג / מיליליטר 1,2-distearoyl- SN N -glycero-3-phosphoethanolamine- -....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבעי ניאון כגון DY676-COOH צבע NIRF משמש כאן בפנים המימי של יפוזומים מובילה לרמה גבוהה של הקרינה מרווה. מרווה הקרינה, תופעה ראתה עם fluorophores רבות בריכוז גבוה, ניתן לנצל בכמה יישומי ההדמיה vivo בי רגישות גבוהה וזיהוי אמין של אזור היעד הם דרשו. השימוש ביפוזומים מספק גם הגנה של הצבע שהיא חיונית ליישומי in vivo. אפיון יסודי של יפוזומים הוא הכרחי וכולל מספר גורמים כגון הרמה של צבע במארז, יציבות וגודל של יפוזומים, מרווה הקרי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז יפוזומים גם יכולים לשמש כמערכות אספקה ​​לצבעי ניאון, הם מאפשרים הדמיה של מחלות יעד. אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבעי ניאון כגון צבע NIRF, DY676-COOH משמש כאן, מובילה לרמה גבוהה של מרווה הקרינה של הצבע וממולכד. מרווה הקרינה, תופעה ראתה עם fluorophores רבות בריכוז גבוה יכולה להיות מנוצלת בכמה יישומי ההדמיה vivo, שבו רגישות גבוהה וזיהוי אמין של אזור היעד היא דרשו. השימוש ביפוזומים מספק גם הגנה של הצבע שהיא חיונית ליישומי in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי HI-698 / 10-1 Deutsche Forschungsgemeinschaft וRU-1,652 / 1-1. אנו מודים לדורין מאי לקבלת סיוע טכני מעולה והחברה DYOMICS GmbH, Jena על תמיכתם.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>חומרים וציוד להכנת ליפוזומים
ביצה פוספטידילכוליןAvanti Polar Lipids840051Pממיסים בכלורופורם ומאחסנים בבקבוקוני זכוכית (214 מ"ג/מ"ל)
כולסטרולסיגמאC8667ממיסים בכלורופורם ומאחסנים בבקבוקוני זכוכית (134 מ"ג/מ"ל)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום)Avanti Polar Lipids880120Pמתמוססים בכלורופורם ומאחסנים בבקבוקוני זכוכית (122 מ"ג/מ"ל)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (מלח אמוניום)Avanti Polar Lipids810145Pמתמוססים בכלורופורם ומאחסנים בבקבוקוני זכוכית (2 מ"ג/מ"ל)
Sartorius MC1 (d = 0.01 מ"ג)Sartorius AGResearch RC 210 Pמשמש לשקילת הפוספוליפידים
RotavaporBü chi Labortechnik AGR-114המשמש ללחות של סרט פוספוליפיד
WaterbathBü chi Labortechnik AGR-481המשמש ללחות של סרט פוספוליפיד
בקר ואקוםBü chi Labortechnik AGB-720המשמש ללחות של סרט פוספוליפיד
VacoboxBü chi Labortechnik AGB-177משמש להידרציה של סרט פוספוליפיד
Circulation ChillerLAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230משמש ללחות של סרט פוספוליפיד
DY-676-COOHDyomics GmbH676-00ממיסים ב-10 מ"מ Tris ומאחסנים מלאי ב-20° C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanApplichemA1086buffer 10 mM, pH 7.4
TrichlormethanCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2משמש להכנת ליפוזום
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hהמשמש להכנת ליפוזום
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)Scientific Industries Inc.SI-0256משמש להכנת ליפוזום
Sephadex G25 בינוני GE Healthcare Europe GmbH17-0033-01משמש לטיהור ליפוזומים
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002משמש להשמדת ליפוזומים  לכימות צבע
LiposoFast-BasicAvestin Inc.משמש לשחול של ליפוזומים
קרום מסנן פוליקרבונט, 100 ננומטר (ממברנת Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)VWRהמשמש לשחול של ליפוזומים באמצעות LiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG Labtechהמשמש לכימות צבע
Zetasizer Nano ZSMalvernמשמש לקביעת גודל הליפוזום ופוטנציאל הזטא
אולטרה-צנטריפוגה Beckmann Coulter GmbHXL 80המשמש לריכוז הדגימות
Rotor Beckmann Coulter GmbHSW 55 TIהמשמש לריכוז הדגימות<
Zymosan-A מ-Saccharomyces cereviciaeSigmaZ4250-250MGהמשמש להשראת דלקת
תמיסת מלח איזוטונית (0.9%)Fresenius GmbHPZN-2159621המשמשת לדילול וופורייזר Zymosan-A
IsofluraneOhmeda Isotec 4המשמש להרדמת בעלי חיים
IsofluraneActavis GmbH PZN-7253744הרדמה
Thermo Mat Pro 20 WLucky Reptile61202-HTP-20המשמש לשמירה על חום בעלי חיים במהלך ההרדמה
Omnican-F (הזרקה של 1 מ"ל) בראוןPZN-3115465משמש למריחה תת עורית ותוך ורידית של בדיקות
קרם עיניים פנתנולJenapharmPZN-3524531המשמש למניעת יובש בעיניים של בעלי חיים במהלך הרדמה
תמיסת מלח חוצצת הנקסPAA Laboratories /Biochrom AGL2045w/o Mg2+, Ca2+ ופנול אדום. לדילול בדיקות ולשטיפת תאים
שקופיות תא 8 בארותBiosciences354108משמש לתרבית תאים ואחריו מיקרוסקופיה 
צלוחיות תרבית תאיםGreiner BioOne
מדיה לתרבית תאיםGibco (Life Technologies GmbH)
סרום עגל עוברי תמיסת פולי-ליזין Invitrogen
(0.01%, 50  מ"ל)סיגמאP4832המשמש לציפוי שקופיות תא תרבית תאים
Mountant PermafluorThermoScientific S21022-3פתרון הרכבה למיקרוסקופיה
Hoechst-33258AppliChemכתם DNA למיקרוסקופיה
Hera-SafeHeraeus Instrumentsספסל עבודה סטרילי המשמש לתרבית תאים
תא HERAHeraeus Instrumentsהמשמשת לתרבית תאים
LSM510-MetaZeissהמשמש למיקרוסקופיה
קונפוקליתמערכת הדמיה פלואורסצנטית Maestro-TM in vivoCRi, Woburnהמשמשת להדמיה פלואורסצנטית של כל הגוף של בעלי חיים קטנים
ספקטרופוטומטר (Ultrospec 4300 pro UV)GE Healthcareהמשמש למדידת
ספקטרופלואורומטר ספיגה (Jasco FP-6200)Jascoמשמש למדידת פליטת
<חזק>בעלי חיים
עכברי NMRI (בני 8-12 שבועות, זכר)Elevage Janvier, צרפתמשמש לניסויי דלקת
td colspan="4" ><חזק>חומרים וציוד להערכת ליפוזום והדמיה אופטית BD חממת פלואורסצנטי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  2. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liposomal EncapsulationNear Infrared FluorescenceFluorescence QuenchingIn Vivo ImagingPhagocytic UptakeLipid Film HydrationExtrusion PurificationSpectrometric MeasurementsZymosan Induced EdemaPEGylated Liposomes

Related Articles