הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל In vivo דימות אופטי

15.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52136

⸱

5 בינואר 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

השימוש בפלואורופורים להדמיה in vivo יכול להיות מוגבל מאוד על ידי אופסוניזציה, פינוי מהיר, רגישות זיהוי נמוכה והשפעות ציטוטוקסיות על המארח. אנקפסולציה של פלואורופורים בליפוזומים על ידי הידרציה ואקסטרוזיה מובילה לכיבוי והגנה פלואורסצנטיים המאפשרים הדמיה in vivo עם רגישות גילוי גבוהה.

תקציר

הדמיה אופטית מציעה מגוון רחב של שיטות אבחון ומשכה עניין רב ככלי להדמיה ביו-רפואית. למרות המספר העצום של טכניקות הדמיה הקיימות כיום וההתקדמות במכשור, עדיין יש צורך בבדיקות רגישות ביותר המתאימות להדמיה in vivo. בעיה אופיינית אחת של בדיקות פלואורסצנטיות פרה-קליניות זמינות היא הפינוי המהיר שלהן in vivo, מה שמפחית את רגישות ההדמיה שלהן. כדי לעקוף את הפינוי המהיר, להגדיל את מספר מולקולות הצבע באתר המטרה, ובכך להפחית את האוטופלואורסצנטיות ברקע, נעשה אנקפסולציה של הצבע הפלואורסצנטי הקרוב לאינפרא אדום, DY-676-COOH בליפוזומים ואימות הפוטנציאל שלו להדמיה in vivo של דלקת. DY-676 ידוע ביכולתו להרוות את עצמו בריכוזים גבוהים. תחילה קבענו את הריכוז המתאים למרווה עצמית, ולאחר מכן עטפנו את ריכוז המרווה הזה בחלק הפנימי המימי של ליפוזומים PEGylated. כדי לבסס את פוטנציאל המרווה וההפעלה של הליפוזומים אנו משתמשים בשיטת הקפאה קשה המובילה לפגיעה בקרומים הליפוזומליים מבלי להשפיע על הצבע העטוף. הליפוזומים המאופיינים ברמה גבוהה של כיבוי פלואורסצנטי נקראו Lip-Q. אנו מראים על ידי ניסויים עם קווי תאים שונים כי קליטת Lip-Q היא בעיקר על ידי פגוציטוזיס, מה שבתורו איפשר את אפיון הפוטנציאל שלו ככלי להדמיה in vivo של דלקת במודלים של עכברים. יתר על כן, אנו משתמשים במודל בצקת המושרה על ידי זימוסן בעכברים כדי לבסס את הפוטנציאל של Lip-Q בהדמיה אופטית של דלקת in vivo. בהתחשב בספיגה אפשרית עקב אפקט חדירות ושימור משופר (EPR) הנגרמת על ידי דלקת, ניסויים בבעלי חיים הושוו לניסויים בבעלי חיים פורמולציה של ליפוזום הפועל תמיד עם ריכוז נמוך ולא מרווה של DY-676-COOH (המכונה Lip-dQ) ו-DY-676-COOH החופשי ל-Lip-Q.

מבוא

ליפוזומים נחקרו באינטנסיביות ויהוו את אחד ממערכות אספקת הסמים ביו-רפואיות ביולוגית ביותר עבור יישומים קליניים 1,2. הם מורכבים בעיקר מפוספוליפידים וכולסטרול, אשר שניהם תרכובות ביולוגית מחקה חלקים של קרום תא טבעי. אילו יכולים לנפול בפח חומרים הידרופילי בפנים המימי, ניתן לשלב סוכני lipophilic בתוך bilayer פוספוליפידים liposomal 3. Encapsulation של חומרים בתוך הפנים מימיים של יפוזומים מעניק הגנה מפני השפלה in vivo וגם מונע המערכת המארחת מהשפעות רעילות של תרופות ציטוטוקסיות המשמשות לטיפול במחלות, לדוגמא chemotherapeutics נועד להשמיד תאים סרטניים. השינוי של פני השטח liposomal עם פולימרים כמו polyethylenglycol (PEGylation) מרחיב עוד יותר את זמן זרימת דם liposomal in vivo בשל התייצבות sterical 4. Moreovאה, ליפוזומים יכולים לעקל ריכוזים גבוהים של מספר חומרים כגון חלבונים 5,6, חומרים הידרופילי 7,8 ואנזימים 9. לכן הם משמשים כלים טיפוליים ואבחון קליניים אמינות כמו שיזכו לאישורם למשלוח של תרופות ציטוטוקסיות כגון דוקסורוביצין לטיפול בסרטן 4. בשל הגמישות שלהם, יכולים גם להיות טעונים יפוזומים עם fluorochromes למטרות אבחון וניתוחיים מונחות הדמיה.

הדמיה הקרינה מספקת חסכוני ולא פולשנית בכלי אבחון vivo שלעומת זאת, דורשים כמה דרישות בסיסיות. זה יכול להיות הוכיח כי יש לי fluorochromes שיתאים להדמית in vivo קליטה אופיינית ומקסימום פליטה בטווח שבי פיזור האור והפיזור, כמו גם autofluorescence רקמות שמקורן במים והמוגלובין נמוך. לפיכך, יש בדיקות כאלה מקסימום שרירי הבטן / em בין 650 ל 900 ננומטר 10. חוץ מזה, את היציבות של fluorochromes הן במבחנה in vivo היא קריטית, כמו opsonization ופינוי מהיר יכולים להגביל את בקשתם לin vivo הדמיה 11 מאוד. השפעות אחרות כגון יציבות עניה ורגישות נמוכה או תופעות רעילות לתאים באברי מטרה כפי שניתן לראות בירוק Indocyanine (ICG) 12-16, אינן רצויות ויש לקחת בחשבון בעת תכנון בדיקות הדמיה in vivo. תצפיות אלה הובילו לפיתוח הפעיל של כמה fluorochromes פרה-קליני NIR, חלקיקים, כמו גם טכניקות חדשות להדמית in vivo של תהליכים דלקתיים, סרטן ולניתוחי מונחי תמונה 17-20. למרות היציבות ביותר (הקרינה תת-אדום הקרובה) NIRF פרה-קליני צבעים במבחנה, זלוף המהיר והסליקה דרך הכבד והכליות לעכב את השימוש שלהם בהדמיה האופטית in vivo של מחלות ותהליכים דלקתיים.

ntent "> לכן אנו מציגים פרוטוקול לאנקפסולציה של fluorochromes כגון מאופיין היטב קרוב אינפרא אדום צבע פלואורסצנטי DY-676-COOH, ידוע בנטייתה להרוות עצמי בריכוזים גבוהים יחסית 21 ביפוזומים. בריכוזים גבוהים H- היווצרות ו / או דימר ואינטראקציות בין מולקולות fluorophore ממוקמות בתוך תוצאת רדיוס פורסטר של זה בהעברת פורסטר אנרגיית תהודה (סריג) בין מולקולות fluorochrome. בריכוז נמוך המרחב שבין עליות מולקולות fluorophore, ובכך למנוע אינטראקציה לערום-pi לערום-pi H-דימר היווצרות וכתוצאה מכך פליטת הקרינה גבוהה. מעבר בין ריכוז הגבוה ונמוך ומרווית הקרינה הליווי וההפעלה הוא אסטרטגיה מבטיחה שניתן לנצל להדמיה אופטית 22. במובן זה, אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבע NIRF DY-676-COOH בפנים המימי של יפוזומים הוא יותר favorable הדמיה in vivo מהצבע החופשי. האתגר של השיטה טמונה קודם כל באנקפסולציה הנכונה ושנית, באימות של היתרונות הנובעים ממתמצתים ריכוזים גבוהים של הצבע. השוואת תכונות ההדמיה של יפוזומים הרווה עם זה של הצבע החופשי וגם עם ניסוח liposome-הרווה אינה עם ריכוזים נמוכים של הצבע היא הכרחית. אנחנו מראים בפרוטוקול לחות סרט וחול פשוט, אך יעיל מאוד בשילוב עם מחזורי הקפאה והפשרה חלופיים שאנקפסולציה של ריכוזי מרווה של DY-676-COOH ביפוזומים אינה ריאלי. שיטות אחרות המשמשות להכנה ליפוזומים כגון שיטת השלב ההפוך אידוי 23, כמו גם את שיטת הזרקת אתנול 24 לאפשר הכנת liposome עם יעילות אנקפסולציה גבוהה עבור רבים חומרים הידרופילי. עם זאת, טבעו של החומר להיות במארז יכול להשפיע על יעילות אנקפסולציה. למעשה,פרוטוקול לחות סרט וחול שהוצג כאן גילה את היעילות הגבוהה ביותר לאנקפסולציה של DY-676-COOH. כדי להמחיש את היתרונות של אנקפסולציה liposomal של DY-676-COOH, מודל בצקת נגרם על zymosan, המאפשר חקר תהליכים דלקתיים בתוך כמה שעות, היה בשימוש. כאן, הוא הוכיח כי ליפוזומים עם ריכוזים גבוהים של DY-676-COOH במארז מתאימים יותר לכל גוף בהדמיה אופטית vivo של תהליכים דלקתיים מאשר לצבוע בחינם או ניסוח liposomal-הרווה אינה עם ריכוזי צבע נמוכים. כך הפרוטוקול הבסיסי מספק שיטה פשוטה ומהירה כדי לייצר ליפוזומים ניאון הרווה והאימות של פוטנציאל ההפעלה והדמיה שלהם הן ​​במבחנה in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל הנהלים אושרו על ידי ועדת בעלי החיים האזורית ובהתאם להנחיות בינלאומיות על השימוש האתי בבעלי חיים.

1. הכנת חומרים ומכשירים

  1. הכנת פיזור שלפוחית ​​נוצר באופן ספונטני (SFV)
    1. לפזר ולהכין מלאי של פתרונות פוספוליפידים הבאים: 214 מ"ג / מיליליטר phosphatidylcholine ביצה (EPC), 134 מ"ג / מיליליטר כולסטרול, 122 מ"ג / מיליליטר 1,2-distearoyl- SN N -glycero-3-phosphoethanolamine- - [methoxy (פוליאתילן גליקול) -2000] (מלח אמוניום) (MPEG 2,000 -DSPE) ו- 2 מ"ג / מיליליטר 1,2-dioleoyl- SN N -glycero-3-phosphoethanolamine- - (7-ניטרו-2-1,3-benzoxadiazol-4 -yl) (מלח אמוניום) (NBD-DOPE) בכלורופורם וחנות בבקבוקוני זכוכית.
    2. לרהט כלורופורם כ 3 מיליליטר בבקבוק תחתון עגול ולהעביר את הנפח המתאים של פתרון מניות פוספוליפידים לתוך הבקבוק התחתון העגול להכין ליפוזומים מורכבים מEPC: -DSPE MPEG 2000 ביחס טוחנת של 6.5:: חול 3: 0.5. לתיוג הקרינה הכפול של יפוזומים להוסיף 0.3% mol NBD-DOPE לפתרון השומנים.
    3. להתאדות כלורופורם מהפתרון אורגני פוספוליפידים תחת לחץ מופחת (300 mbar) על 55 מעלות צלזיוס באמצעות מאייד סיבובי.
    4. לאחר סרט פוספוליפידים הומוגנית נוצר, להפחית את הלחץ עד 10 mbar במשך 1-2 שעות כדי להסיר הפקדת כלורופורם שיורית.
    5. בעוד כלורופורם הוא מתאדה, לפזר DY-676-COOH (6.181 מיקרומטר) ב 10 pH חיץ מ"מ טריס 7.4 ולמלא כלי דיואר עם חנקן נוזלי. לעבור על אמבטיה קולית ונקבע על 50 מעלות צלזיוס.
    6. העבר את הנפח מתאים (0.5-1 מיליליטר) של DY-676-COOH (6.181 מיקרומטר) פתרון לבקבוק התחתון העגול כדי ללחלח את הסרט היבש פוספוליפידים והמערבולת במרץ עד שלפוחית ​​נוצרה באופן ספונטני (SFV) צורות פיזור. ודא שכל פוספוליפידים הם התפזרו כדי למנוע אובדן של שומנים.
    7. tra זהירותnsfer הבקבוק התחתון העגול מכיל את פיזור SFV לחנקן נוזלי ולהקפיא את הפיזור במשך 3-5 דקות. מניחים את הבקבוק התחתון העגול לאמבטיה קולית על 50 מעלות צלזיוס להפשיר הפיזור אז מערבולת הפיזור מרץ במשך 1-2 דקות. חזור על תהליך זה שש פעמים, ובסך הכל שבעה מחזורי הקפאה והפשרה.
  2. חול של SFV ליצור שלפוחית ​​liposome הומוגנית
    1. העבר את פיזור SFV לתוך מזרק 1 מיליליטר (מזרק) וextrude הפיזור דרך קרום פוליקרבונט 100 ננומטר באמצעות מכבש LiposoFast-יסוד לתוך מזרק-ב.
    2. Extrude הפיזור מהמזרק-b, חזרה למזרק, ואז לחזור על המחזור עשר פעמים. בשל חול, הפתרון בשינויים המזרק ממראה מעורפל לפיזור ברור עם זמן. לאחר עשרה מחזורים (עשרים צעדים שחול יחידים) להסיר מזרק-ב מההתקן ולמתוח את הפיזור בפעם האחרונה ממזרק ישירות לתוך סטרילי1.5 מיליליטר צינור תגובה.
  3. טיהור liposomal כמוס DY-676-COOH מצבע חופשי
    1. הכן עמודת כרומטוגרפיה ג'ל באמצעות חרוזים G25 הספוגים ב( 10 סנטימטר אורך עמודה 28, קוטר 0.8 סנטימטרים) pH חיץ מ"מ טריס 7.4.
    2. העבר 0.5 מיליליטר של פיזור שלפוחית ​​extruded על מיטת ג'ל ולתת לטמיון המדגם לתוך מטריצת ג'ל.
    3. Elute יפוזומים עם 10 7.4 (איור 1 א) מ"מ טריס חיץ pH ולשטוף את הטור עד מתנקז צבע החופשי לגמרי מחוץ לטור. אם יהיה בכך צורך, לאסוף ולמחזר את הצבע בחינם על ידי desalting והתייבשות על פי הוראות היצרן.
    4. להתרכז יפוזומים eluted ידי ultracentrifugation (200,000 XG, שעת 2 ​​ב 8 ° C) ולאחר מכן לפזר אותם בנפח מספק של pH סטרילי 10 מ"מ טריס חיץ, 7.4.
  4. כימות של ריכוז DY-676-COOH במארז
    1. הכן עקומת כיול על ידי המסת DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 ננומטר) ב 10 חיץ מ"מ טריס, pH 7.4 המכיל 0.1% טריטון X100.
    2. לפזר 2 μl (100 nmol שומנים סופיים של מניית / L 50 mmol) של יפוזומים במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר 100 μl חיץ טריס המכיל 1% טריטון X100 להרוס את שלפוחית ​​ולשחרר את הצבע במארז. ואז לדלל דגימות עם 10 חיץ מ"מ טריס, pH 7.4 לריכוז Triton-X100 סופי של 0.1% (V / V) מה שהופך את נפח כולל של 1 מיליליטר. הכן את כל הדגימות בשני עותקים.
    3. מדוד את הבליעה ופליטה של ​​כל הדגימות (חינם DY-676-COOH וTriton-X100 טופל יפוזומים) בעירור λ = 645 nm ופליטה λ = 700 nm. להקים ולהשתמש עקומת כיול של הצבע החופשי כדי לקבוע את הריכוז של צבע במארז.
  5. אפיון Liposome
    1. לקבוע את פוטנציאל הגדלים וzeta של יפוזומים על ידי פיזור אור דינאמי. לדלל את דגימות liposomal עם המסנן מעוקר (0.2 מיקרומטר) pH חיץ 10 מ"מ טריס 7.4 לaconcentration של 100-300 מיקרומטר (שומנים בדם). העברת הדגימות מדוללת לקובט חד פעמי בנפח נמוך ולמדוד את המדגם על פי הוראות היצרן.
    2. לאפיין את יפוזומים על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים על מנת לבסס את הגודל, היושרה וההומוגניות של שלפוחית ​​liposomal על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

2. אישור של הקרינה-מרווה והפעלה של יפוזומים מוכנים

  1. ניתוח physicochemical של מרווה הקרינה והפעלה
    1. הכן שני צינורות 1.5 מיליליטר לLip-Q ו- 2 צינורות לDY-676-COOH החופשי. 100 nmol שומני ההעברה כולל (2.38 μl של פתרון מניות / L Lip-Q 42 mmol, המכיל 138 מיקרוגרם / מיליליטר של DY-676-COOH במארז) לצינורות המתאימים. העבר את המקבילה DY-676-COOH חופשי לתוכן הצבע של השפתיים-Q (0.38 מיקרוגרם שהתוצאה למשל מ 138 מיקרוגרם / μl 1000 x 2.38 μl Lip-Q בשימוש). דגירה אמבטיה אחדדואר של כל בדיקה על 4 מעלות צלזיוס ולהקפיא את הצינור השני ב -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה (16 שעות).
    2. לחמם בלוק חימום עד 30 מעלות צלזיוס. מלא תיבת קירור עם קרח כתוש ולאזן aliquot של pH חיץ 10 מ"מ טריס 7.4 לטמפרטורת חדר.
    3. הסר בדיקות מ4 ° C ולאזן בטמפרטורת חדר (עטופה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור) ובמהירות להפשיר בדיקות מ-80 ° C ב 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צ'יל הבדיקות מופשרות על קרח דק 1 לפני העברתן לטמפרטורת חדר (גם עטופה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור).
    4. הוסף 10 חיץ מ"מ טריס (pH 7.4) לכל אחד מהבדיקות עד 100 נפח סופי μl ולאזן את כל הבדיקות בבית RT במשך 10 דקות.
    5. פיפטה 80 μl של כל בדיקה לקובט זכוכית בנפח נמוך ולמדוד את הספיגה של כל בדיקה 400-900 ננומטר בספקטרומטר. להחזיר את הבדיקה לצינורות המתאימים שלהם.
    6. העבר את 80 μl של כל בדיקה לקובט זכוכית מתאימהולמדוד את פליטת הקרינה על ידי spectrofluorometer מרגשות הבדיקות בבית 674 ננומטר ומדידת הקרינה 694-800 ננומטר.
  2. ספיגת הקרינה סלולרית והפעלה
    1. קבל ותרבות שורות התאים הבאות בתקשורת והתרבות המקבילה שלהם בהתאם לתנאים סטנדרטיים (37 ° C, 5% CO 2 ו -95% אווירת humidified). כאן, השתמש בJ774A.1 שורת תאי מקרופאג העכברית (שונה הבינוני של הנשר בתוספת 10% (V / V) בסרום עגל עוברי של Dulbecco), קו תא גליובלסטומה אדם, U-118MG (ממ המכיל ויטמינים חיוניים ו -10% (v / v) בסרום עוברי עגל) וקו תא fibrosarcoma האנושי, HT-1080 (RPMI עם 5% FCS).
    2. שקופיות קאמריות מעיל 8-גם עם פולי-L ליזין (להוסיף 100 μl 0.001% פולי-L ליזין היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. פתרון לשאוב ולתת השקופיות קאמריות להתייבש לפחות 4 hr ב RT על שולחן עבודה סטרילית. יש לשטוף את השקופיות קאמריות 3פעמים עם תמיסת מלח שנאגרו של 200 μl האנק אז לאטום אותם עם פרפין ורדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 ° C עד צורך.
    3. בעוד השקופיות קאמריות מתייבשות, המסנן לעקר יפוזומים ופתרון צבע ולאחסן ב 4 ° C עד הצורך.
    4. לניתוח ספיגת בדיקה עם כל הגוף במערכת ההדמיה הקרינה vivo NIR, להכין 5 צלוחיות קטנות תרבות לכל אחת משורות תאי 3 מבחן (15 צלוחיות בסך הכל). הזרע 2 x 10 6 J774A.1, U-118MG ותאי HT-1080 לכל בקבוק תרבות עם 5 מיליליטר של מדיום תרבות בהתאמה (בquintuples) ולגדול במשך 16-24 שעות. במקביל לצלוחיות התרבות, זרע 30,000 תאים של כל שורת תא (J774A.1 וHT-1080) או 20,000 תאים (U-118MG) 2 בארות של חדר שקופיות בהתאמה ולגדול במדיום תרבות 500 μl במשך 16-24 שעות .
    5. ביום שלמחרת, להוסיף 100 nmol (כמות שומנים סופית) של Lip-Q 2 צלוחיות בכל שורת תא וגם אחד מכל שורת תאים בתא השקופיות.מייד להעביר בקבוק 1 בכל שורת תא עד 4 מעלות צלזיוס והבקבוק השני חזרה לחממה.
      (5 מיליליטר הוא 500 מדיום תרבות μl) הנפח של הבדיקות נוספות לצלוחיות והשקופיות קאמריות הן אותו הדבר, מה שהופך את הריכוז בתא שקופיות גבוה פי 10: הערה. זה נחוץ משום הגילוי מיקרוסקופי הוא פחות רגיש ממערכת ההדמיה הקרינה NIR בי כדורי תא מהצלוחיות הם צילמו.
    6. הוסף את DY-676-COOH החופשי במקביל ריכוז לתוכן הצבע של השפתיים-Q לתאים בכל שורת 2 צלוחיות תא וגם אחד מכל שורת תאים בתא השקופיות, ולאחר מכן להעביר בקבוק 1 בכל שורת תאים באופן מיידי ל4 ° C (דלדול אנרגיה) והבקבוק האחר יחד עם השקופיות קאמריות חזרה לחממה. דגירה כל התאים למשך 24 שעות בתנאים המקביל. תאי הבקבוק בלי בדיקה ישמשו כקבוצה ביקורת.
  3. הדמיה NIRF וניתוח חצי כמותית
    1. לאחר 24 משך דגירה שעה, לקצור את התאים בצלוחיות על ידי שטיפת תאים 2 פעמים עם הנקס שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) ולאחר מכן לגרד תאים ב 500 μl HBSS וגלול על ידי צנטריפוגה (5 דק 'ב 200 XG) ב 500 צינורות μl.
    2. מניחים את הצינורות עם כדורי התא (וHBSS) בתרמי NIRF ומסננים באמצעות תמונה לעירור (615-665 ננומטר) ופליטה (חתך ב> 700 ננומטר).
    3. לנכות autofluorescence ולהעריך את עוצמת היעד לעומת autofluorescence בהתאם להוראות יצרן. זה ייתן לי הרמות חצי כמותית של עוצמת הקרינה כאות ממוצעת (ספירה טיפסה / sec), המייצגת את רמות ספירה לאחר שינוי קנה המידה לזמן חשיפה, רווח מצלמה, binning ועומק סיבית, כך שהמדידות הן להשוות בין זה לזה.
  4. ניתוח מיקרוסקופי confocal
    1. אחרי 24 שעות דגירה, לקצור את התאים על שקופיות קאמריות על ידי שטיפת 2 פעמים עם 500 μl HBSS.
    2. תקן CELLS עם 200 μl HBSS המכיל 3.7% (v / v) פורמלדהיד למשך 30 דקות ב RT.
    3. בעוד הקיבעון קורה, לדלל את כתם DNA, Hoechst-33258 1:50 פתרון הרכבה.
    4. לאחר קיבוע, לשטוף את התאים 2 פעמים עם HBSS אז להפריד את התאים משקופיות הזכוכית. הוספת פתרון הרכבה 50 μl המכיל DNA-הכתם על כל נקודה המתאימה לבארות של השקופיות קאמריות. לכסות את התאים עם coverslips זכוכית, לאטום קצוות עם לק השקוף ואוויר יבש במשך 10 דקות ב RT (כהה).
    5. תאי תמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים או מיקרוסקופ confocal. השתמש בהגדרות הבאות העירור ופליטה להדמיה של הרכיבים המקביל: הגרעינים (Hoechst-33258: עירור 405 ננומטר, פליטה 420-480 ננומטר). NBD-DOPE (שומנים בדם liposomal: ננומטר עירור 488, פליטת 530 ננומטר). DY-676-COOH (צבע פלואורסצנטי NIR: nm 633-645 העירור, פליטת 650-700 ננומטר).
      הערה: ודא שמיקרוסקופ פלואורסצנטיvailable מצויד במסננים מתאימים המאפשרים עירור ופליטה של ​​אורכי גל גבוה יותר מאשר 630 ננומטר.

3. Liposome מבוסס בVivo דימות פלואורסצנטי של דלקת

  1. הכנה של בעלי חיים וחומרים
    1. בית 8-12 שבועות בן עכברי זכרי NMRI במשקל כ 36 גרם בתנאים סטנדרטיים עם כרצונך מזון ומים.
    2. שבעה ימים לפני תחילת ניסויים, לתת את כל עכברי דיאטת pheophorbide נמוכה על מנת לצמצם autofluorescence רקמות.
    3. עשרים וארבע שעות לפני תחילת כל ניסוי, לגלח עכברים באזור הרצוי (למשל, אזור גב כל אם הדמיה של בצקת רגל האחורית היא רצויה).
    4. לשקול את בעלי החיים ולחשב את כמות הבדיקה כדי להיות מוזרק לכל עכבר (Lip-Q וLip-DQ ב 10 μmol (ריכוז שומנים בדם) לכל קילוגרם משקל וחופשי DY-676-COOH (שווה ערך ל לצבוע תוכן של-Q שפתיים בשימוש) .
    5. תמונת בעלי החיים בתרמי NIR הקרינה גוף כולו עם אותן ההגדרות המשמשות לכדורי התא. מדידה זו מספקת autofluorescence של בעלי החיים.
    6. לפזר 10 מ"ג zymosan-ב 1 מיליליטר תמיסת מלח איזוטוני ולאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. אינדוקציה של דלקת ובהדמית NIRF vivo
    1. הכן 3 מזרקים לכל עכבר המכילים את הפתרונות הבאים. מלא מזרק אחד עם 50 zymosan-פתרון μl (10 מ"ג / מיליליטר) ואת המזרק השני עם תמיסת מלח איזוטוני 50 μl. מלא את המזרק השלישי עם הבדיקות, לפי Lip-Q וLip-DQ (10 μmol / משקל קילוגרם (שומנים בדם)) מיועדים לבעלי חיים בדיקה וחופשי DY-676-COOH (ריכוז כמו בשפות-Q) לבעלי חיים שליטה. ודא שהבדיקות הן בדילול עם HBSS סטרילי 150 נפח סופי μl.
    2. החל קרם עיניים בעיניים של בעלי חיים כדי למנוע יובש ולהרדים חיות עם isoflurane 2% עד שהם שקועים בשינה עמוקה ולא מגיב כאשר נגעו בכפות (זה לוקח בערך 2 דקות).
    3. מניחים את העכבר על מחצלת חמה (עדיין תחת הרדמה) ולהזריק zymosan-תת עורי פתרון ברגל האחורית הימנית ותמיסת מלח על הרגל האחורית השמאלית. מייד להזריק לוריד ובדיקת תמונת החיה לאחר מכן לאחר מכן זמן שיא של הזרקה / מדידה (כt = 0 שעה). שמור את התמונות וכתוצאה מכך כקוביות תמונה וחזור על השלבים לעיל עבור כל בעלי החיים האחרים והבדיקות המתאימות.
    4. תמונת בעלי החיים בכל שעה 2 לאחר הזרקה לשעה 10 ולאחר מכן ב 24 שעות לאחר הזרקה, ולוודא כי השלב של חדר המדידה הוא חם (למשל, על ידי הצבת מחצלת חמה מתחת), על מנת להימנע מהיפותרמיה. לאחר כל מדידה, למקם את החיות בכלוב עם כרצונך מזון ומי מודעה ולמקם את הכלוב בתא בעלי חיים ממוזג. להרדים בעלי החיים על ידי ההרדמה הראשונה עם 2% isoflurane עד בעלי החיים כבר לא מגיבים למגע, ואז להרדים עם פחמן דו חמצני למשך 5-10 דקות, מה שהופך אתבטוח שבעלי החיים להפסיק לנשום לחלוטין וצפידים מתרחש.
    5. לנתח את העכברים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים שניתן להעריך באינטרנט (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) ותמונת האיברים.
    6. להעריך את תוצאות המדידה על פי הוראות יצרן על ידי ניכוי הקרינה הכוללת של בעלי החיים (unmixing) אז אזורי הקצאה של העניין לautofluorescence (משמאל רגל אחורית עם מי מלח) וקרינת היעד של אזור המודלק (רגל אחורית תקין עם zymosan-) הראשון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבעי ניאון כגון DY676-COOH צבע NIRF משמש כאן בפנים המימי של יפוזומים מובילה לרמה גבוהה של הקרינה מרווה. מרווה הקרינה, תופעה ראתה עם fluorophores רבות בריכוז גבוה, ניתן לנצל בכמה יישומי ההדמיה vivo בי רגישות גבוהה וזיהוי אמין של אזור היעד הם דרשו. השימוש ביפוזומים מספק גם הגנה של הצבע שהיא חיונית ליישומי in vivo. אפיון יסודי של יפוזומים הוא הכרחי וכולל מספר גורמים כגון הרמה של צבע במארז, יציבות וגודל של יפוזומים, מרווה הקרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאז יפוזומים גם יכולים לשמש כמערכות אספקה ​​לצבעי ניאון, הם מאפשרים הדמיה של מחלות יעד. אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבעי ניאון כגון צבע NIRF, DY676-COOH משמש כאן, מובילה לרמה גבוהה של מרווה הקרינה של הצבע וממולכד. מרווה הקרינה, תופעה ראתה עם fluorophores רבות בריכוז גבוה יכולה להיות מנוצלת בכמה יישומי ההדמיה vivo, שבו רגישות גבוהה וזיהוי אמין של אזור היעד היא דרשו. השימוש ביפוזומים מספק גם הגנה של הצבע שהיא חיונית ליישומי in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי HI-698 / 10-1 Deutsche Forschungsgemeinschaft וRU-1,652 / 1-1. אנו מודים לדורין מאי לקבלת סיוע טכני מעולה והחברה DYOMICS GmbH, Jena על תמיכתם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים וציוד להכנת ליפוזומים
ביצה פוספטידילכוליןAvanti Polar Lipids840051Pממיסים בכלורופורם ומאחסנים בבקבוקוני זכוכית (214 מ"ג/מ"ל)
כולסטרולסיגמאC8667ממיסים בכלורופורם ומאחסנים בבקבוקוני זכוכית (134 מ"ג/מ"ל)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום)Avanti Polar Lipids880120Pמתמוססים בכלורופורם ומאחסנים בבקבוקוני זכוכית (122 מ"ג/מ"ל)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (מלח אמוניום)Avanti Polar Lipids810145Pמתמוססים בכלורופורם ומאחסנים בבקבוקוני זכוכית (2 מ"ג/מ"ל)
Sartorius MC1 (d = 0.01 מ"ג)Sartorius AGResearch RC 210 Pמשמש לשקילת הפוספוליפידים
RotavaporBü chi Labortechnik AGR-114המשמש ללחות של סרט פוספוליפיד
WaterbathBü chi Labortechnik AGR-481המשמש ללחות של סרט פוספוליפיד
בקר ואקוםBü chi Labortechnik AGB-720המשמש ללחות של סרט פוספוליפיד
VacoboxBü chi Labortechnik AGB-177משמש להידרציה של סרט פוספוליפיד
Circulation ChillerLAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230משמש ללחות של סרט פוספוליפיד
DY-676-COOHDyomics GmbH676-00ממיסים ב-10 מ"מ Tris ומאחסנים מלאי ב-20° C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanApplichemA1086buffer 10 mM, pH 7.4
TrichlormethanCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2משמש להכנת ליפוזום
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hהמשמש להכנת ליפוזום
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)Scientific Industries Inc.SI-0256משמש להכנת ליפוזום
Sephadex G25 בינוני GE Healthcare Europe GmbH17-0033-01משמש לטיהור ליפוזומים
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002משמש להשמדת ליפוזומים  לכימות צבע
LiposoFast-BasicAvestin Inc.משמש לשחול של ליפוזומים
קרום מסנן פוליקרבונט, 100 ננומטר (ממברנת Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)VWRהמשמש לשחול של ליפוזומים באמצעות LiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG Labtechהמשמש לכימות צבע
Zetasizer Nano ZSMalvernמשמש לקביעת גודל הליפוזום ופוטנציאל הזטא
אולטרה-צנטריפוגה Beckmann Coulter GmbHXL 80המשמש לריכוז הדגימות
Rotor Beckmann Coulter GmbHSW 55 TIהמשמש לריכוז הדגימות<
Zymosan-A מ-Saccharomyces cereviciaeSigmaZ4250-250MGהמשמש להשראת דלקת
תמיסת מלח איזוטונית (0.9%)Fresenius GmbHPZN-2159621המשמשת לדילול וופורייזר Zymosan-A
IsofluraneOhmeda Isotec 4המשמש להרדמת בעלי חיים
IsofluraneActavis GmbH PZN-7253744הרדמה
Thermo Mat Pro 20 WLucky Reptile61202-HTP-20המשמש לשמירה על חום בעלי חיים במהלך ההרדמה
Omnican-F (הזרקה של 1 מ"ל) בראוןPZN-3115465משמש למריחה תת עורית ותוך ורידית של בדיקות
קרם עיניים פנתנולJenapharmPZN-3524531המשמש למניעת יובש בעיניים של בעלי חיים במהלך הרדמה
תמיסת מלח חוצצת הנקסPAA Laboratories /Biochrom AGL2045w/o Mg2+, Ca2+ ופנול אדום. לדילול בדיקות ולשטיפת תאים
שקופיות תא 8 בארותBiosciences354108משמש לתרבית תאים ואחריו מיקרוסקופיה 
צלוחיות תרבית תאיםGreiner BioOne
מדיה לתרבית תאיםGibco (Life Technologies GmbH)
סרום עגל עוברי תמיסת פולי-ליזין Invitrogen
(0.01%, 50  מ"ל)סיגמאP4832המשמש לציפוי שקופיות תא תרבית תאים
Mountant PermafluorThermoScientific S21022-3פתרון הרכבה למיקרוסקופיה
Hoechst-33258AppliChemכתם DNA למיקרוסקופיה
Hera-SafeHeraeus Instrumentsספסל עבודה סטרילי המשמש לתרבית תאים
תא HERAHeraeus Instrumentsהמשמשת לתרבית תאים
LSM510-MetaZeissהמשמש למיקרוסקופיה
קונפוקליתמערכת הדמיה פלואורסצנטית Maestro-TM in vivoCRi, Woburnהמשמשת להדמיה פלואורסצנטית של כל הגוף של בעלי חיים קטנים
ספקטרופוטומטר (Ultrospec 4300 pro UV)GE Healthcareהמשמש למדידת
ספקטרופלואורומטר ספיגה (Jasco FP-6200)Jascoמשמש למדידת פליטת
<חזק>בעלי חיים
עכברי NMRI (בני 8-12 שבועות, זכר)Elevage Janvier, צרפתמשמש לניסויי דלקת
td colspan="4" ><חזק>חומרים וציוד להערכת ליפוזום והדמיה אופטית BD חממת פלואורסצנטי

מקורות

  1. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  2. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
  3. Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
  4. Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
  5. Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
  6. Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
  7. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
  8. Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
  9. Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
  10. Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
  11. Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
  12. Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
  13. Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
  14. Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
  15. Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
  16. Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
  17. Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
  18. Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
  19. Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
  20. Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
  21. Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
  22. Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
  23. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
  24. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
  25. Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
  26. New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
  27. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
  28. Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
  29. Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
  30. Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
  31. Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
  32. Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
  33. Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
  34. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14(2005).
  35. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  36. Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
  37. Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
  38. Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
  39. Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
  40. Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
  41. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
  42. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
  43. Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

כמיסה ליפוזומליתפלואורסצנציה בבתחום האינפרה-אדום הקרובדימות In Vivoעיקול פגוציטריהידרטציה של סרט שומןטיהור באמצעות אקסטרוזיהמדידות ספקטרומטריותבצקת המושרה על ידי Zymosanליפוזומים PEGylated
הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל In vivo דימות אופטי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.