מאמר שיטה

גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52158

⸱

26 בנובמבר 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles (UCLA), 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles (UCLA)

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתוכנתים מחדש ומאופיינים ללא גורמים והמרה למצבים קליניים משוערים.

תקציר

תאי גזע אנושי pluripotent מושרה (hiPSCs) יכולים להיות שנוצרו עם מתודולוגיות תכנות מחדש מבוסס lentiviral. עם זאת, עקבות של גנים שעלולים להיות סרטניים שנותרו באזורים משועתקים של הגנום, להגביל את הפוטנציאל שלהם לשימוש ביישומים טיפוליים אדם 1. בנוסף, אנטיגנים שאינם בני אדם נגזרים מתכנות מחדש של תאי גזע או הבידול לנגזרים רלוונטיים טיפולי מונעים hiPSCs אלה מלשמש בהקשר קליני בבני אדם 2. בסרטון הזה, אנו מציגים הליך לתכנות מחדש וניתוח hiPSCs ללא גורם ללא transgenes אקסוגני. hiPSCs אלה לאחר מכן ניתן לנתח מומי ביטוי גנים באינטרון הספציפי המכיל את lentivirus. ניתוח זה יכול להיעשות באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז רגישה כמותית (PCR), שבו יש יתרון על פני טכניקות רגישות פחות השתמש בעבר כדי לזהות הבדלי 3 ביטוי גנים. המרה מלאה לתרגול בכיתה קלינית טוב ייצור תנאים (GMP), מאפשר רלוונטי קלינית בבני אדם. הפרוטוקול שלנו מציע כי קריטריונים בטוחים נמל נוכחי ירחיבו וכוללים נגזרים מבוססי hiPSC ללא גורם מאופיינים ליישומים לטיפוליים אנושיים הנובע hiPSCs כיתה GMP, שאמורה לחסל את כל סיכון חיסוני בשל אנטיגנים שאינם בני אדם שסופקה על-מתודולוגיה אחרת. פרוטוקול זה הוא רחב החלים על תאי lentiviral לתכנות מחדש של כל סוג ומספק שיטה לשחזור להמרת תאים לתכנות מחדש לתנאי כיתה GMP.

מבוא

תאים אנושיים בוגרים הוכחו כמסוגלים לעבור שיפוץ אפיגנטי ותכנות מחדש, כתוצאה מביטוי מבוסס לנטי-ויראלי של ארבעה גורמי שעתוק מרכזיים4,5. התקדמות חשובה בתחום התכנות מחדש הייתה השימוש בקלטת תאי גזע לנטיוויראלית אחת הניתנת לכריתה, שהכילה את כל ארבעת גורמי השעתוק המתכנתים מחדש שאפשרו יחס סטויכיומטרי מדויק של ביטוי חלבון6. בנוסף, כאשר הוא מומר בריבוי ספציפי של טווחי זיהום, STEMCCA יכול להוביל לאירועי אינטגרציה גנומיים בודדים בעיקר במהלך תהליך התכנות מחדש7. הכנסת גרסה ניתנת לכריתה, המשתמשת בטכנולוגיית Cre/loxP ואחריה כריתה של וקטור התכנות מחדש לאחר גזירת קו תאי הגזע, אפשרהלהפיק קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC) ללא גורמים. בנוסף, על מנת לשפר את היישומים הטיפוליים של hiPSCs, היה צורך ליישם מתודולוגיה חדשנית, מהירה וניתנת ליישום להמרת קו תאים בדרגת תנאי ייצור נאותים (GMP), מתנאים המכילים קסנו לתנאים נטולי קסנו. כאן, אנו דנים במתודולוגיה רלוונטית המעריכה בצורה מדויקת יותר את הבדלי ביטוי הגנים המשולבים, במיוחד כאשר הם משולבים באינטרון, והמרת תאים בדרגה קלינית לתנאי GMP משוערים.

מחקר קודם השתמש רק בניתוח שעתוק מיקרו-מערך חסר רגישות יחסית כדי לנתח הבדלי ביטוי גנים בגנים משולבים לאחר התמרת STEMCCA3,9. כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה של ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית רגישה (PCR), כדי לבחון עוד יותר את הבדלי ביטוי הגנים המשולבים. חשוב לציין, הקריטריונים הנוכחיים של נמל מבטחים משליכים hiPSCs שיש להם גנים עם אינטגרציות ויראליות, ובכך מגבילים את הישימות של תאים אלהלטיפולים תאיים אנושיים במורד הזרם. אנו מציעים כי הסטטוס קוו עשוי להשתנות עם שימוש ב-hiPSCs מתוכנתים מחדש באופן אינטרוני המאופיינים במלואם ונטולי טרנסגנים. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול המרת תאים חזק בדרגת GMP שניתן ליישם בקלות על מגוון סוגי תאים שונים, אשר נגזרו במקור בתנאים המכילים קסנו10. זה מספק הזדמנויות משמעותיות לפיתוח ניסויים עתידיים בתכנות מחדש של תאים, הדורשים תנאים ברמה קלינית כדי לשמור על רלוונטיות טיפולית אנושית.

מתודולוגיות אלו מספקות בסיס שעליו ניתן להרחיב את קריטריוני נמל המבטחים הנוכחיים כך שיכללו קווי hiPSC מתוכנתים מחדש של STEMCCA השומרים על פרופיל ביטוי גנים תקין לאחר כריתת STEMCCA מהאינטרון המשולב. כמו כן, המרה מלאה לתנאים ברמה קלינית, ללא אנטיגנים של בעלי חיים שאינם אנושיים, תעזור לשלב סוגי תאים רבים נוספים, שבעבר תוכנתו מחדש ואופיינו רק בתנאים המכילים קסנו. מתודולוגיות אלה יחד, מהוות קרקע משכנעת עבור מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לשקול להרחיב את האישור המוגבל שלהם מטיפולים מבוססי תאי גזע עובריים אנושיים (ESC) לטיפולים מבוססי hiPSC11.

לאחרונה פירטנו את הנגזרת של קו hiPSC נטול פקטורים שאופיין במלואו והוסב למצבים קליניים משוערים10. כאן, אנו מפרטים את הפרוטוקול לגזירת hiPSC על ידי שימוש ב-STEMCCA lentivirus. תאי גזע אלה עוברים תהליך כריתה ואחריו אפיון ביטוי גנים. לבסוף, ה-hiPSCs מומרים לתנאים בדרגת GMP על ידי מתודולוגיית המרה איטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: שיטה זו שימשה במחקר דיווח נוראים et al 10..

1. תכנות מחדש אדם הבוגר Dermal Fibroblasts עם STEMCCA

  1. fibroblasts עורי מבוגר הפשרה אנושי (HUFs), מעבר 4 או פחות, באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, נזהר שלא להטביע את חלקו העליון של הבקבוקון עם מים.
  2. מניחים את תערובת 1 מ"ל של fibroblasts אדם לתוך בקבוקון חרוטי 15 מ"ל ומניח לאט 4 מיליליטר של תקשורת HUF סטנדרטית, טרום חיממה עד 37 ° C, בצורה טיפה חכמה, כדי לדלל את sulfoxide דימתיל (DMSO) ו מחדש להשעות תאים.
  3. צנטריפוגה הבקבוקון ב XG 200 במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant מחדש להשעות תאים בנפח מספק של תקשורת ליצור השעיה של 100,000 תאים / מיליליטר ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל ולאחת מצלחת שש היטב, מצופה מראש למשך 20 דקות עם ג'לטין 0.2%.
    הערה: אחות עם מספר שווה של תאים בכל שורה ומצב טוב צריכה להיות נזרעה for ספירת התאים / ריבוי של זיהום חישוב (משרד הפנים).
  4. רוק בצד הצלחת לצד וקדימה ואחורה כדי לפזר באופן שווה את התאים. דגירה לילה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified.
  5. ביום של התמרה, להשיג ספירת תאים (שניות) מהאחות היטב כ 24 שעות (ים) לאחר ציפוי HUF ראשוני.
  6. להפשיר 2 x 10 8 TU, או תרכיז שווה ערך, lentiviral (STEMCCA) ולדלל עד 1 x 10 8 TU / ml בתקשורת HUF.
  7. Transduce תאים ביחס 10-משרד הפנים בתקשורת HUF השלים עם סוכן transfection 8 מיקרוגרם / מיליליטר. מערבבים בארות transduced באופן שווה ודגירת לילה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified.
  8. כ 24 שעות לאחר התמרה lentiviral, לעבור תקשורת HUF לתאי גזע pluripotent אדם בינוני סטנדרטי (PSC).
  9. בימים 2 עד 6, לשנות תקשורת יומיומית עם מדיום PSC אנושי.
  10. ביום 6, צלחת שתי צלחות 10 סנטימטרים מצופים ג'לטין 0.2% מ1.5 x 1.75 10 6 MEFs שנלקח מעכברי CF1 בתקשורת HUF 12.
  11. ביום 7, נזהרת שלא צנטריפוגות יותר מ -100 XG, טריפסין טמפרטורת חדר שימוש כדי להרים את יום 7 fibroblasts תכנות מחדש מהיטב אחד של הצלחת והמעבר שש היטב ביחס 01:16, על ידי ציפוי את כל התאים באופן שווה בין שתי 10 צלחות סנטימטר, עם תקשורת טרי אנושית PSC, שהיו מצופים עם MEFs היום קודם לכן. להפיץ אגרגטים תא בתנועה ספירלית בכיוון השעון ומקום ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 humidified חממת הלילה.
  12. כ -48 שעות לאחר זריעת התאים לתכנות מחדש על MEFs ובכל יום לאחר מכן, לשנות את תקשורת PSC אדם בילתה עם תקשורת טרי.
  13. לאחר 3 עד 4 שבועות, לבחור מושבות בודדות עם ESC הטיפוסי כמו מורפולוגיה עם מחט 21-מד וsubclone החוצה אל צלחת 24 גם על ידי הצבת כ 8 עד 10 יצירות בודדות של מושבות ספציפיות לתוך בארות בודדות ב0.2% ג'לטין מצופה צלחת 24 גם פרה-סידed עם MEFs שנלקח מעכברי CF1 במדיום PSC אנושי.
    הערה: לאחר הרחבת מושבות הרימו, המושבות צריכה להיות מאופיינות כpluripotent על ידי היווצרות embryoid גוף וניתוח ביטוי של סמני pluripotency ברמת החלבון.

2. וקטור אינטגרציה ניתוח אתר וSTEMCCA כריתה

  1. לנתח את אתר האינטגרציה STEMCCA על ידי ההגברה ליניארית שאינה מגבילה PCR כמתואר 10.
  2. לאחר מנסה לאמוד על מנת להבטיח אינטגרציה אחד לאזור רצוי של הגנום, STEMCCA בלו על ידי aspirating את מדיום ESC האנושי הישן. ואז, לשלב 45 μl של וירוס Adeno-Cre-PuroR המרוכז עם 8 מיקרוגרם / סוכן transfection מיליליטר ב 3 מיליליטר של תקשורת PSC סטנדרטית למשך 24 שעות.
  3. לאחר תקופת הדגירה 24 שעות, לשאוב את supernatant ויראלי המעורב ולשטוף את התאים פעמיים עם תקשורת PSC אנושית. הנח תקשורת PSC אנושית טרי יחד עם 2 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin לתקופה של 5 ימים, לשנות את השנינות היומית התקשורתתקשורת h טרי ואנטיביוטיקה.
  4. לאחר 5 ימים, subclone נותר מושבות עם מחט 21-מד על בארות מצופים ג'לטין 0.2%, בצלחת 12 גם מראש מצופה עם MEFs נגזר מCF1mice ולהרחיב כפי שפורט לעיל.
    הערה: לאחר הרחבה מספיק כדי להשיג המניה קפוא, נדרשת המרה לתנאי מזין ללא. מצפה לפחות 95% מות מושבה תאי גזע כמו רוב התאים לא transduced בהצלחה וייכנעו לאנטיביוטיקה בהשוואה לתקופה של 5 ימים של דגירה. למרות Adeno-Cre-PuroR משלב ביעילות% .001-1 לכרומוזומים מארח של תאים נגועים, reexposing מדגם של מושבות ללא גורם לpuromycin כדי להבטיח 100% מוות של תאים יאשרו אינטגרציה, לא התרחשה 13.
  5. להפשיר בקבוקון אחד של מטריצת קרום במרתף מראש aliquoted על קרח, על פני תקופה של כ -2 שעות (המלצות יצרן) עד המטריצה ​​היא נוזל ולדלל את ריכוז סופי של 1:30 בתקשורת בסיסית קרה. Coבמספר רצוי של בארות בצלחת שש היטב עם 1 מיליליטר לכל טוב. בואו לשבת בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
  6. צלב-צוהר (באמצעות מחט 18-מד, או "טיפ" זכוכית או פלסטיק) לפחות 20 עד 30 מושבות וממצופות בעבר עם MEFs. להיות זהיר כדי להפחית MEF מרומם ולהעביר מצלחת.
    1. צור מכשיר הקווקווים באמצעות מספר הגישות שונות, מהחימום המסובך יותר, מושך, וגימור של זכוכית פיפטה פסטר על להבה פתוחה, לשימוש הפשוט של קצה פיפטה פלסטיק סטרילי או, כמו במקרה שלנו, 21- ו / או 18-מד מחטים.
  7. לשאוב את המטריצה ​​מהבאר לאחר הדגירה המצופה.
  8. הסר פיסות המושבות על ידי גירוד עדין מהצלחת הישנה עם pipettor 200-μl ומניח בזהירות לתוך 3 מיליליטר של תקשורת המשולבת הטרי 1 בצלחת מצופה המטריצה. דגירה הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% 2 חממה humidified CO. תקשורת שינוי 48 שעות לאחר passaging.
  9. לחלץ הדנ"א הגנומי מhiPSCs המרה-נכרת פוסט והמזין ללא, בלמעלה מ -80% confluency, באמצעות ערכות חילוץ DNA המסחרי.
  10. ניתוח לכריתה נכונה עם פריימרים ספציפיים לאינטגרציות אקסוגני של lentivirus STEMCCA: gDNA-hendo-MycS-קדימה, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-הפוך, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 ". מחדש פריימרים lyophilized עם מים כיתה-PCR לפתרון מניות של 10 מיקרומטר.
  11. הפעל PCR עם פרוטוקול חמשת השלבים הבאים: denaturation הראשוני ב 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 35 מחזורים של כל אחד מאלה: denaturation על 98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, חישול פריימר על 62 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, וסיומת על 72 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות; אחרי ארכה אחת מחזור אחרון ב 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
  12. הפוך ג'ל agarose 3% על ידי שקילה מתוך 1.5 גרם של agarose והצבתו לתוך 50 מיליליטר 1x חיץ טריס-אצטט-EDTA. מיקרוגל עד agarose הוא נמס והמקום בכתם ג'ל DNA בעמ 'דילול רופר, לערבב, ולוותר על נפח ראוי לקלטת ג'ל לבסס עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
  13. עומס 12 μl של מוצר ה- PCR מעורבב עם 3 μl של צבע טעינה לג'ל agarose 3%. הפעל את ג'ל למשך 30 דקות ב 80 V.
  14. דמיין עם אור אולטרה סגול על היעדריו של להקה המציין כריתה נכונה.

3. Quantitation של הבדלי ביטוי גנים על ידי שימוש בכמותי PCR מהקדם וhiPSCs נכרת-ההודעה

  1. לחלץ RNA הכולל מhiPSCs המרה-נכרת פוסט והמזין ללא באמצעות ערכות חילוץ RNA מסחריות.
  2. הפוך-לתמלל עד 1 מיקרוגרם של RNA הכולל באמצעות ערכות מסחריות בהתאם להוראות היצרן. השתמש מעוגן-אוליגו (DT) 18 ופריימרים hexamer אקראיים.
    הערה: ודא שפרוטוקול PCR מותאם לתעתיקי גנים של יותר מ או פחות מ -4 קילו. פריימרים ספציפיים יצטרכו להתבצע על i לפי גן STEMCCA המשולב במקורn כדי.
  3. מחדש את פריימר lyophilized עם מים כיתה-PCR לפתרון מניות 20 מיקרומטר.
  4. השתמש 5 ng של מדגם לכל 20 μl של תגובה שמורכבת מבדיקת UPL 10 מיקרומטר, 2x LightCycler 480 בדיקות הורים, ו -20 מיקרומטר קדימה לאחור פריימרים.

4. המרה לתנאי כיתה GMP

  1. ביום הראשון של מעבר hiPSCs-נכרת ההודעה על תנאים בכיתה GMP, לעשות תערובת של תקשורת בהיקף של PSC האנושי בשילוב 1 (1 תקשורת משולבת) וכיתה קלינית בפועל ייצור טוב (GMP) תקשורת תואמת תקשורת תקשורת (בשילוב 2 ) בשעה 80:20 יחס.
  2. לשאוב את התקשורת המשולבת הישנה 1 ומקום 3 מיליליטר של התקשורת המשולבת החדשה 1 ו- 2, מחומם מראש, ביחס 80:20. שינוי בתקשורת כל יום במשך 3 ימים עם היחס הספציפי הזה. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO 2.
  3. ביום 4, להפיק את התקשורת בשילוב 1 ו -2 ביחס 50:50. לשאוב את המדיום וreplac הישניםדואר עם תקשורת חימם מראש, עם התקשורת בשילוב 1 ו -2 ביחס 50:50. שינוי בתקשורת במשך 3 ימים עם היחס הספציפי הזה. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO 2.
  4. ביום 7, להפיק את התקשורת בשילוב 1 ו -2 ביחס 20:80. לשאוב את המדיום הישן ולהחליף עם תקשורת מחוממת מראש, עם התקשורת המשולבת 1 ו -2 ביחס 20:80. שינוי בתקשורת במשך 3 ימים עם היחס הספציפי הזה. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO 2.
  5. ביום 10, להפוך את התקשורת בשילוב 1 ו -2 ב0: יחס 100. לשאוב את המדיום הישן ולהחליף עם תקשורת חימם מראש, עם התקשורת בשילוב 1 ו -2 ב0: יחס 100. שינוי בתקשורת בכל יום ביחס הספציפי הזה. תאים נמצאים כעת בללא מדיה קסנו מוגדרת לחלוטין. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO 2.
    הערה: במהלך תהליך גיור כל זה, יש צורך בpassaging השגרתי עם מחט 18-מד לשמור גודל מושבה ראוי וצפיפות. תכנית על passaging תאים כל 4 עד 5 ימים על בסיס גודל מושבה, confluency, ובידול.
  6. אחד מעיל גם בצלחת שש היטב עם מצע ללא קסנו מוגדר כמומלץ על ידי היצרן.
  7. מעבר מכאני ומחוברות גם, שכבר הוסבו לחופשי קסנו-תנאי תקשורת, מצלחת שש היטב עם מחט 18-מד. חשוב לציין, למקם את המדיה חדשה (מדיה משולבת 2) בתאים עם מעכבי ROCK 1x עבור שעה 1, לפני passaging מראש מצב התקשורת.
  8. לשאוב את פתרון המצע הסינתטי מהצלחת החדשה כי התאים מועברים ל. הסר את כל המדיה המכילה את גושי תאי גזע מהצלחת הישנה ולהעביר לצלחת חדשה.
  9. תאי מקום בחזרה ל-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 2 ימים עם הפרעה פיזית מינימאלית (באופן אידיאלי צלחות, פעם אחת בתוך חממה, לא נגעו ישירות בכל דרך) כדי לאפשר מרבי של קובץ מצורף.
    הערה: תאים ידרשו שינויים בתקשורת מדי יום. passagin המתמשךg כל 4 ימים יהיו חשובים. באמצעות מחט 21-מד, מעבר רק חלקים ממושבות עם מורפולוגיה אופטימלית כמו ESC (יחס nucleocytoplasmic גבוה). פעולה זו תבטיח את הבחירה למושבות hiPSC ראויות שתגדלנה היטב וסופו של דבר להניב מושבות הומוגנית. זמן הכולל לגזירה של ESC כמו מושבות הוא בין 15-20 ימים לאחר שינוי התקשורת המשולב הראשוני.
  10. להקפיא את hiPSCs-נכרת לאחר כיתה GMP על ידי הפתח-צלב הראשון כל המושבות באמצעות מחט 18-מד. הרם את כל החתיכות באמצעות pipettor μl 200 ולהעביר את כל התקשורת המכילה את התאים לבקבוקון חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  11. בעוד התאים צנטריפוגה, להפוך את תקשורת הקפאה מורכבת מכמויות שווה של תקשורת המשולבת הקרה 2 והקפאה בינונית עם ריכוז DMSO סופי של 7.5%.
  12. לאחר תאי pelleted, לשאוב את המדיום ישן וירידה מבחינת מחדש להשעות את גלולה עם תקשורת ההקפאה. מייד transfer לבקבוקוני הקפאה ולהכניס למקפיא -80 מעלות צלזיוס.

5. hiPSCs נכרת-ההודעה אפיון כיתה GMP

  1. כדי להבטיח ביטוי הולם של סמני pluripotency לאחר המרה, להשתמש QPCR לכמת ביטוי של סמני pluripotency מפתח (Sox2, Oct4, וNANOG) על ידי שימוש בצבעי היסוד המפורט בטבלה 1 עם אותם השלבים כאמור בשלב 3. מתודולוגיות QPCR המעקב אותם צעדים כפי שמופיע בשלב 3.
  2. שימוש cytometry זרימה לזהות את החומצה שאינה בני האדם sialic Neu5Gc (חומצת -glycolylneuraminic N) בהתאם לתנאים סטנדרטיים המופיעים בערכה, כפי שפורסם בעבר 10.
  3. לשטוף בעדינות את צלחות תרבית תאים עם תאים באמצעות מלוח 1x פוספט שנאגרו (PBS).
  4. לנתק את המושבות באמצעות מגיב ניתוק 1x במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. במהלך זמן הדגירה של 5 דק 'של שלב 5.4, להכין את פתרון החסימה (הניתן בערכה) על ידי ביצוע 0.5% חסימת הסוכן בPBS קר כקרח.
  6. תווית הסט של צינורות לניתוח cytometry הזרימה הבא: בלא הכתם; 4 '6-Diamidino-2-phenylindole DAPI, (DAPI); שליטת נוגדן 1: 200; נוגדן ראשוני 1: 200; נוגדנים משני 1: 200 החמור נגד העוף IgG (H + L); MEFs מדגם; תאים-נכרת לאחר מדגם על מטריצה; ו- נכרתה הודעה לדוגמא תאים על מצע סינטטי.
  7. בעדינות לעקור אגרגטים תא מצעד 5.4 על ידי הוספת 2 מיליליטר של חסימת תכני פתרון ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 80 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. שוטף את התאים פעמיים עם פתרון חסימה ו צנטריפוגות כאמור בשלב 5.7.
  9. בעדינות מחדש להשעות כ 1 x 10 6 תאים בחסימת פתרון עם מקביל דילול הנפח של כל נוגדן 100 μl. דגירה עם הנדנדה עדינה ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  10. חזור על שטיפות שלוש פעמים כמו בשלב 5.8.
  11. להשעות מחדש את התא גלולה ב400 μl של diluent לBuffer (מערכה) עם 1: 100 של DAPI לצינורות 2, 6, 7, ו -8 כפי שמופיע מתחת לשלב 5.6.
  12. תאי מתח דרך מסננת 40 מיקרומטר ולהפעיל באמצעות cytometer זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנו מציגים פרוטוקול להפקת hiPSCs ללא גורם כיתה קלינית על ידי שימוש בגישת תכנות מחדש מבוססת lentiviral STEMCCA. איור 1 א מציג תמונה מייצגת של שלושה קווים שונים hiPSC-נכרת מראש, לאחר תכנות מחדש עם גישת STEMCCA על שכבת MEFs. היתרון העיקרי של גישת תכנות מחדש STEMCCA טמון בהצלחת תכנות מחדש העקבית מושגת על ידי מדענים רבים, בקבוצות מחקר שונות ובמקומות. איור 1 מציג את הג'ל שעתוק-PCR ההפוך פוסט-כריתה, מראה subclone אחד מסוים (2.3) שהוא חופשי לחלוטין מlenti...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מתארים שיטה של ​​הפקת hiPSCs ללא גורם והופך אותם מבחינה קלינית רלוונטי על ידי המרת תאים אלה לתנאי כיתה GMP להתמיינות תאים במורד הזרם בתרופות אנושיות בעתיד. למרות שפרוטוקול זה הוא החלים רחב למגוון של סוגי תאים, בחרנו לתכנת מחדש fibroblasts עורי האנושי, בשל הקלות של חילוץ מהמטופל ותחולתם לתרופות אנושיות מותאמות אישית. ברגע שמגבלות תקנה ככל בידול מלא לנגזרי תא רלוונטיים מבחינה קלינית הוא 14 מודאגים, ההמרה הוצגה לתנאי כיתה GMP תהיה עוד יותר רלוונטית למגוון של סוגי תאים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ג'יימס א. ביירן (JAB) ואגוסטין וגה-קרספו מקבלים מימון מחקר מ-Fibrocell Science, Inc. JAB הוא יועץ מדעי ל-Fibrocell Science, Inc. לאף מחבר אחר אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לפטריק סי לי, סיריל ראמאת'ל ו-Saravanan Karumbayaram (SK) על עזרתם בביצוע ניסויי הגזירה והאפיון של iPSC; אהרון קופר על ביצוע ניסויי האנליזה של iPSC; ויטוריו סבסטיאנו ורנה א. רייחו פרה על ניהול מאמצי התכנות הראשוניים; SK, וויליאם א. לאורי, ג'רום א. זאק ודונלד ב. קון על הנחיית הקמת מתקני ה-GMP של UCLA המאפשרים המרה ואפיון של iPSCs ברמה קלינית; גוסטבו מוסטוסלבסקי על שסיפק לנו את וקטור התכנות מחדש הפוליציסטרוני של STEMCCA. עבודה זו מבוססת על שיתוף פעולה מחקרי עם Fibrocell Science ויוזמת החקירות הקליניות לנגזרות שהושגו בעור (CIDMOD) ליצירת טיפולים תאיים מותאמים אישית בטוחים. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממרכז אלי ואדית ברוד לרפואה רגנרטיבית וחקר תאי גזע ב-UCLA, קרן משפחת פלפס, Fibrocell Science, Inc., ופרס המלומדים של UCLA CTSI ל-JAB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מדיה וריאגנטים
DMEM/F12 (מדיה בסיסית)Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב)11330057
סרום בקר עובריInvitrogen16000044
חומצות אמינו לא חיוניות מינימליות (MEM) (NEAA), 100xInvitrogen11140050
Glutamax, 100xInvitrogen35050-061
PenStrep, פניצילין-סטרפטומיצין, 100xInvitrogen15140-122הפשרה ב-4 מעלות; C, aliquot ואחסון ב & מינוס; 20 מעלות; החלפת
סרום נוקאאוטC Invitrogen10828028הפשרה ב-4 מעלות; C, aliquot ואחסון ב & מינוס; 20 מעלות; C
Trypsin/EDTA, 0.5%Invitrogen15400-054לדלל את המלאי ל-0.05% ב-1x PBS
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסיGlobalStem (רוקוויל, מרילנד, ארה"ב)GSR-2001להקים מחדש ל-10 ומיקרו; מלאי גרם/מ"ל באלבומין סרום בקר 0.1% מומס ב-1x PBS ומאחסנים ב-& מינוס; 80 מעלות; C
β-mercaptoethanolMillipore (בילריקה, מסצ'וסטס, ארה"ב)ES-007-E
Matrigel (מטריצת ממברנת הבסיס)BD Biosciences (סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב)356231לדלל את בקבוקון המטריגל עם 10 מ"ל של DMEM/F12 בזמן שהוא על קרח לדילול של 1:2. Aliquot ואחסון ב & מינוס; 20 מעלות צלזיוס.
CELLstart (מצע סינטטי)InvitrogenA1014201
Stemmolecule Y27632Stemgent (קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב)04-0012-02
PuromycinInvitrogenA1113802
LightCycler 480 Probes MasterRoche (באזל, שוויץ)4707494001
ProFreeze-CDM בינוני/קפוא בינונילונזה (באזל, שוויץ)12-769E
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)D8418
PBSInvitrogen14190-250
100 BP DNA סולםInvitrogen15628019
כתם ג'ל DNA בטוח SYBR 10,000xInvitrogenS33102
AgaroseBio-Rad Laboratories, Inc. (הרקולס, קליפורניה, ארה"ב)161-3101
ג'לטין, מעור חזירSigma-AldrichG1890-100Gהכינו מלאי ב-0.2% ב-PBS, חיטוי ואחסנו בטמפרטורת החדר.
mTeSR1StemCell Technologies (ונקובר, קולומביה הבריטית, קנדה)5850שלב תוספת פי 5 עם המדיום הבסיסי, הוצא ואחסן ב-4 מעלות; C עד שבועיים.
Stemedia NutriStem XF/FF תרבית בינונית05-100-1Aהפשרה ב-4 מעלות; C O/N, אליקוט ואחסון ב-4 מעלות; C עד שבועיים.
פרימוציןInvivoGen (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)ant-pm-1
Accutase (מגיב דיסוציאציה)InvitrogenA1110501
חמור נגד עוף IgG AlexaFluor 488Jackson ImmunoResearch (ווסט גרוב, פנסילבניה, ארה"ב)703-546-155
חומר פוליברן/טרנספקציהMilliporeTR-1003-G
<חזק>פלסטיק
צלחות חזקות >12 בארותVWR (ווסט צ'סטר, פנסילבניה, ארה"ב)29442-038
צלחות 6 בארותVWR29442-042
צלחות 10 ס"מסיגמא-אולדריץ'Z688819
מחט 18 מדפישר סיינטיפיק (פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)148265D
מחט 21 מדפישר סיינטיפיק14-829-10D
<חזק>ציוד
BD LSRII זרימה ציטומטרKSystem מאת ניקון (טוקיו, יפן)
BD FACSDiva גרסה 6.1.3 תוכנהBD Biosciences
ערכות
PureLink גנומי DNA מיני ערכתInvitrogenK182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR KitKAPA Biosystems (ווילמינגטון, MA, ארה"ב)KK2601
ערכת בידוד RNA טהור גבוהRoche11828665001
Transcriptor First Strand cDNA SynthesisKit Roche4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack KitSialix (ניוטון, MA, ארה"ב)Basic Pack
media
Combined media 1StemCell Technologies ו Stemgentמורכב מחלקים שווים mTeSR1 ו-Nutristem
Combined Media 2StemCell Technologies ו-Stemgentמורכב מחלקים שווים TeSR2 ו-Nutristem
HUF MediaDulbecco' s שונה Eagle' s medium/F12 [DMEM/F12] בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1x גלוטמקס ו-1x Primocin
Human Pluripotent CellDMEM/F12 בתוספת 20% תחליף סרום נוק-אאוט, 1x גלוטמקס, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1x פרימוצין, 1x ובטא;-מרקפטואתנול, ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי.
DMEM/F12, Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני/F12; PBS, מי מלח עם חוצץ פוספט.
Media

מקורות

  1. Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
  2. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
  3. Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
  4. Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
  7. Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
  8. Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
  9. Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
  10. Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
  11. Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
  12. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
  13. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
  14. Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
  15. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  16. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

hiPSCsDNAAdeno CreGMPhiPSCs

מאמרים קשורים