הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Ex vivo דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52205

⸱

5 בפברואר 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

במאמר זה

סיכום

כדי לטפל במנגנונים של דה-מיאלינציה ואפופטוזיס עצבי בנגעים בקליפת המוח של הפרעות דמיאלינטיות דלקתיות, נעשה שימוש במודלים שונים של בעלי חיים. אנו מתארים כאן גישה ex vivo על ידי שימוש בתאי CD8+ T ספציפיים לאוליגודנדרוציטים על פרוסות מוח, וכתוצאה מכך מוות אוליגודנדרוגליאלי ועצבי. נדונים יישומים ומגבלות פוטנציאליים של המודל.

תקציר

מוות של אוליגודנדרוציטים המלווה בהרס של נוירונים ואקסונים הם ממצאים היסטופתולוגיים אופייניים בנגעי חומר אפור בקליפת המוח והתת-קורטיקלית בהפרעות דמיאלינטיות דלקתיות כמו טרשת נפוצה (MS). בהפרעות אלו נמצאים בעיקר תאי CD8+ T בעלי ספציפיות משוערת לאנטיגנים הקשורים למיאלין ואוליגודנדרוציטים, כך שאפופטוזיס עצבי בנגעי חומר אפור עשוי להיות אפקט משני של תאים אלה. סוגים שונים של מודלים של בעלי חיים הוקמו כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של התהליכים הפתופיזיולוגיים שהוזכרו. עם זאת, למרות שהם מחקים היבטים מסוימים של טרשת נפוצה, אי אפשר לנתח את המנגנון המדויק ואת מהלך הזמן של מוות תאי עצב "אגבי". כדי לעסוק בקורס זה, אנו מראים פרוטוקול לחקר המנגנונים ותגובת הזמן של נזק עצבי לאחר התקפת תאי CD8+ T מכוונת אוליגודנדרוציטים. כדי להתמקד רק במעטפת המיאלין ובאוליגודנדרוציטים, תאי CD8+ T ספציפיים לאוליגודנדרוציטים המופעלים במבחנה מועברים לפרוסות מוח מבודדות באופן חריף. לאחר תקופת דגירה מוגדרת, ניתן לנתח נזק למיאלין ולתאי עצב באזורי עניין שונים. יידונו יישומים ומגבלות פוטנציאליים של מודל זה.

מבוא

מוות של אוליגודנדרוציטים והרס מעטפת המיאלין המלווה באובדן נוירונים ואקסונים הם ממצאים פתולוגיים אופייניים בנגעי חומר אפור אצל אנשים הסובלים מטרשת נפוצה (MS)1,2. ניתן לחלק את הנגעים בקליפת המוח עד כה לשלושה תת-סוגים שונים2: נגעים תת-פיאליים, תוך-קורטיקליים ולויקוקורטיקליים. בהשוואה לפלאק החומר הלבן, ההסתננות מאופיינים בדומיננטיות של תאי T CD8+, מה שמרמז על תפקידם המכריע האפשרי בדלקת בחומר האפור3. יתר על כן, ניתן למצוא התרחבות אוליגוקלונלית בדם, בנוזל המוח השדרתי (CSF) ובתוך נגעים דלקתיים עבור תאי CD8+ T עצמם4-6.

בהתאם לכך, ההנחה היא שתאי CD8+ T עשויים להיות ספציפיים לחלבוני מיאלין שונים7,8. ואכן, תאי T CD8+ נמצאים ליד אוליגודנדרוציטים ומעטפות מיאלין9,10 המראים ביטוי MHC I11 ולכן עשויים להיות אחראים לאובדן מעטפת המיאלין. תהליך זה נראה לעתים קרובות יחד עם נזק עצבי ואקסונלי "משני" נרחב בתוך החומר האפור של מערכת העצבים המרכזית (CNS)1,2. למעשה, מוות ישיר ועקיף של אוליגודנדרוציטים ונוירונים נגרם על ידי תאי T CD8+ באמצעות שני מנגנונים שונים: (i) נפיחות וקרע בקרום התא עקב היווצרות גרגירים ציטוטוקסיים בעקבות שחרור פרפורינים וגראנזימים ו-(ii) קשירה לקולטני Fas או חשיפה של FasL על פני השטח שלהם8,12,13.

סוגים שונים של מודלים של בעלי חיים הוקמו כדי לחקור את המנגנון הבסיסי של התהליכים שהוזכרו. מבחינה זו, תאי CD8+ T דרוכים ספציפיים לאוטואנטיגנים עם ביטוי מושרה בתאי גליה של מערכת העצבים המרכזית, כמו אוליגודנדרוציטים או אסטרוציטים, יכולים להיות מועברים באופן אימוץ כדי לנתח מוות עצבי ואקסונלי "משני" בחומר אפור לאחר מכן14,15. ביצוע ניסויים כאלה in vivo הוא עזרה גדולה לחקות כמה היבטים פתופיזיולוגיים של טרשת נפוצה, עם זאת, גישה זו אינה מתאימה לפתור את המנגנון והקינטיקה הבסיסיים של נזק אקסונלי ואפופטוזיס עצבי.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, הוקמה גישת ex vivo לחקר המנגנונים ומהלך הזמן של מוות תאי עצב לאחר מתקפת תאי T CD8+ מכוונת אוליגונדנדרוציטים. מכיוון שרק אוליגודנדרוציטים ולכן ייצור מעטפת המיאלין צריכים להיות ממוקדים על ידי תאי חיסון, נעשה שימוש בתאי OT-I מוגבלים מסוג I, תגובת אובאלבומין (OVA)16. תאים אלה מועברים לאחר מכן לפרוסות מוח המתקבלות מעכברים המבטאים באופן סלקטיבי OVA באוליגודנדרוציטים (עכברי ODC-OVA)17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים באמצעות עכברים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית, בהתאמה.

1. הערות כלליות לניסויים בעכבר

  1. שמור על העכברים בתנאי הפתוגן ללא ולאפשר להם גישה כלרצונך מזון ומים.
    הערה: חשוב להשתמש בעכברי גיל והתאמת מין בקבוצות ניסוי כי דפוסים חיסוניים יכולים להשתנות עם גיל ומין.

2. CD8 + T לתאי הכנה והפעלה של OVA ספציפי (OT-I)

  1. לבצע גירוי של תאי OT-T אני כמתואר להלן 5 ימים לפני הכנת פרוסות מוח.
    הערה: 5 x 10 5 מפעיל מופעל CD8 + OT-אני תאי T ריכוז 5 x (CD8 + T-תאים של עכברים הטרנסגניים הכרת פפטיד OVA 257-264 רק בהקשר של מולקולות MHC-I) יש צורך לכל פרוסה 10 5 נבחר ניסויברית כאופטימלית לטובת אינטראקציה תאי תאים טובה ברגע שהתאים מתחילים נודדים לפרוסה ו, באותו הזמן, את כמות התאים היא לא גבוהה מדי כדי לגרום לתגובת יתר המאפשר תא בודד ספירת 8,18.
  2. הכן את המדיום לculturing OT-T-תאים. להשלים DMEM 500 מיליליטר עם 5% עוברי עגל בסרום (FCS), 10 מ"מ HEPES, L-גלוטמין 2 מ"מ, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, חומצות אמינו החיוני 1% ו- 25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. אחסן הבינוני על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. הסר את הטחול של עכברים הטרנסגניים OT-כמו לכל התייחסות 16. העבר אותם למדיום מוכן.
  4. צור השעיה תא בודדת על ידי רסוק טחולים דרך מסננת השעיה ו צנטריפוגות 70 מיקרומטר ב XG 300 דקות 5, 4 ° C.
  5. דגירה השעיה תא עם 5 מיליליטר אמוניום כלוריד, אשלגן (ACK) חיץ (150 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ KHCO 3, 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.3) במשך 5 דקות כדי lyse תאי דם אדומים.
  6. להפסיק incubatiעל עם מדיום 10 מיליליטר ו צנטריפוגות זה שוב כפי שתואר לעיל.
  7. לדלל השעיה התא בינוני ולחשב מספרים. פלייט תאים בצפיפות של 3 x 10 7 תאים / גם בצלחת 12 גם ו ראש על ידי דגירה עם OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 ננומטר) ואינטרלוקין 2 (IL-2) (500 IU / ml) ל 5 ימים.
  8. לאחר 4 ימים, להוסיף IL-2 בריכוז של 500 IU / ml שוב.
  9. לאחר גירוי, לטהר OT-אני תאי T מהשעית תא באמצעות עכבר סלקציה שלילי מבוסס ערכת בידוד תא T CD8 + הבאים הוראות יצרן. טיהור מבוססת על הדלדול של כל מי שאינו CD8 + התאים באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Class II, Ter-119, וTCRγ / Δ אשר לאחר מכן הושלך על ידי שימוש בעמודות מגנטיות עבור elution של CD8 + T לתאים המטוהרים.
    הערה: צעדים קריטיים בprocedu זהמחדש מסומנים על ידי מייצר: חשובה שהתגובה כרוכה רק תאים בודדים, כי הנוכחות של גושים יכולה לחסום את הטור במהלך שלב elution; הספירה של התא לפני הוספת קוקטייל Byotin חשובה לתואר של טוהר של המדגם וההליך צריכה להתבצע על קרח כדי למזער איגודי נוגדן נוקבים.

3. הכנת פרוסות המוח חריפה ושיתוף התרבות עם OT-אני תאי T

  1. לפני הכנת המוח החריף פרוס 19, להכין פתרון placedine קר כקרח פיסיולוגי מלוח באמצעות 200 סוכרוז מ"מ, 20 מ"מ צינורות, 2.5 מ"מ KCL, 1.25 דקסטרוז 0.5 CaCl 2 ו -10 מ"מ לאא 2 PO 4, 10 מ"מ MgSO 4, ומלאכותי נוזל השדרתי (ACSF) באמצעות 125 mM NaCl, 2.5 KCl, 1.25 לאא 2 PO 4, 24 מ"מ NaHCO 3, 2 מ"מ MgSO 4, 2 מ"מ CaCl 2, 10 מ"מ דקסטרוז. התאם את ה- pH של כל פתרון ל7.35 על ידי using NaOH. לפני התאמת pH של ACSF, פתרון חייב להיות בועות בתערובת של 95% O 2, 5% CO 2.
  2. טרום לקרר את הפתרונות.
  3. הרדימי 8 - עכברים 10 שבוע ישנים (למשל, C57Bl / 6 כשליטה או עכברי ODC-OVA מהונדסים 17 עם שאיפה באמצעות isoflurane 5.0%, 5.0% halothane או להזריק 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ"ג / xylazine קילוגרם משקל גוף באמצעות ה- IP חכה להרדמה ולהשתמש בקמצוץ הבוהן כדי להעריך את הרמה של הרדמה ולערוף אותם בבת אחת. להרדים את העכברים כמו לכל טיפול בבעלי חיים מוסדי ולהשתמש בקריטריוני וועדה להמתת חסד.
  4. שים עכבר בעמדת הגחון. לחטא ולחתוך קרקפת sagittally. פתח את עצם גולגולת sagitally, להסיר את המוח במהירות בעזרת סקופ ולתקן אותה על הצלחת של vibratome באמצעות דבק.
  5. מלא את הצלחת עם הפתרון מוכן placedine קר כקרח הפיזיולוגי מלוח.
  6. חותך 300 מיקרומטר פרוסות העטרה עם vibratome.
    הערה: הליך זה הוא יודעn להניב דגימות רקמה שלמות קיימא מתאימות ללימודים סלולריים פונקציונליים בתוך פרק זמן של לפחות 8 שעות 19-21 זמן. ואכן, לאחר פרק זמן זה, כבר מתחיל לאחר 6 שעות, הכנת תערוכות איכות מופחתת, כלומר שינויים במאפיינים בסיסיים ופונקציונליים כמו דור פוטנציאל פעולה והפצה.
  7. לאחר חתך, להעביר פרוסה אחת מייד לבאר כל צלחת 12 גם מלא בACSF.
  8. בזהירות להוסיף 5 x 10 5 תאי OT-T אני לכל פרוסה.
  9. דגירה פרוסות לתקופה של עד 8 ​​שעות בחממה (37 ° C, 5% CO 2).
  10. לאחר תקופת הדגירה, פרוסות קציר ולהטביע אותם על ידי שימוש ברקמה-tek מתחם OCT ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. לאחסן אותם ב -20 ° C ללימודים היסטולוגית נוספים לדוגמה, להעריך מבנה עצבי (למשל, אנטי-MAPII באמצעות או נוגדנים נגד synaptophysin) או אפופטוזיס (למשל, באמצעות אנטי caspase-3 נוגדנים ואנטי-אנטי NeuNגופים) על פי נהלים קבועים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר הדגירה של פרוסות מוח עם CD8 + תאי T-מכוון oligodendrocyte, oligodendrocytes כמו גם נוירונים עוברים אפופטוזיס (2A דמויות ו1C, בהתאמה). סימנים היסטולוגית של אפופטוזיס (למשל, caspase-3, Tunel) ניתן לאתרם מוקדמים לאחר 3 שעות של דגירה. תקופת דגירה לא צריכה להיות ארוכה יותר מ- 8 שעות על מנת להבטיח את איכות טובה של ההכנה ותוצאות לשחזור. ניתן למצוא תאים אפופטוטיים בכל רחבי פרוסה עם עליונות באזורי myelinated. צביעה היסטולוגית למופת של הפרוסה לשלמות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מודלים של בעלי חיים שונים תוארו בעשורים האחרונים לטיפול במאפייני פתולוגיים של הפרעות demyelinating דלקתיות כמו טרשת נפוצה. בvivo מודלים עכבר והחולדה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות את תכונות pathophysiological של המחלה, כלומר, ניתוח של ההשלכות של תהליכי demyelination וחידוש יצירת המיאלין ושל פרקים מתמזגים של דלקת וניוון של מערכת עצבים. עם זאת, רק גישה vivo לשעבר מאפשרת לנתח את המנגנונים העומדים בבסיס המדויק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) במינסטר (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 עד S.G.M. ME3283/2-1 עד S.G.M.) ועל ידי Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB ו-SGM).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 12 בארותקורנינג3513
2-מרקפטואתנולג'יבקו31350-010
2-מתילבוטןרוט3927.1
70 ומיקרו; m מסננתFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500סידן כלורי
CD8+-בידוד ערכת בידודMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-גלוקוזMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151סרום עגל עובר
GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500אשלגן כלורי
KHCO3SigmaP9144אשלגן מימן פחמתי
L-גלוטמיןGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500מגנזיום גופרתי
NaClSigma31434נתרן כלורי
NaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500נתרן מימן פוספט
NaHCO3Merck1.06329.0500נתרן מימן פחמתי
NaOHMerck1.09137.1000נתרן הידרוקסיד
NH4ClSigma213330אמוניום כלוריד
חומצת אמינו לא חיוניתGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbumin
PIPESSigmaP6757
סוכרוזMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTסאקורה4583

מקורות

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

T CD8T
Ex vivo דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.