הערכה של יכולת הקיום של הזרקת שומן האנושי בעכברי עירום עם מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת

סיכום

השתלת שומן היא טכניקה חיונית לשחזור ליקויים ברקמות רכות. עם זאת, זה נותר הליך בלתי צפוי המאופיין בהישרדות משתנה של השתל. המטרה שלנו הייתה לתכנן מודל עכבר המשתמש בשיטת הדמיה חדשה כדי להשוות את שימור הנפח בין טכניקות שונות של הכנה ואספקה של השתלת שומן.

תקציר

Lipotransfer הוא כלי חיוני בארסנל של המנתח לטיפול בגירעונות ברקמות רכים של כל הגוף. השומן הוא מילוי רקמות הרך האידיאלי כפי שהוא זמין, להשיג בקלות, זול, ומטבעו ביולוגית. ¹ עם זאת, למרות הפופולריות הגואה שלו, השתלת שומן הקשתה על ידי תוצאות בלתי צפויות והישרדות שתל משתנה, עם שיעורי ההחזקה פורסמו נעים בכל מקום בין 10 -80%. ^1-3

כדי להקל על חקירות בהשתלת שומן, יש לנו ולכן פיתחתי מודל חיה המאפשר ניתוח של שימור נפח שומן מוזרק בזמן אמת. בקצרה, חתך קטן נעשה בקרקפת של עכבר בעירום CD-1 ו200-400 μl של lipoaspirate מעובד ממוקם מעל הגולגולת. הקרקפת נבחרה כאתר נמען בגלל העדרו של שומן תת עורי המקומי, ובגלל הניגוד המצוין רקע הניתן על ידי calvarium, אשר מסייע בתהליך הניתוח. טומוגרפיה ממוחשבת-מיקרו (מיקרו-CT) משמשת כדי לסרוק את השתל בתחילת מחקר ובכל שבועיים לאחר מכן. תמונות CT משוחזרות, ותוכנת הדמיה משמשת לכמת כרכי שתל.

באופן מסורתי, טכניקות להערכת שומן שתל נפח חייבו הרדמת חסד בבעלי החיים המחקר לספק רק הערכה אחת של משקל ונפח שתל על ידי מדידה פיזית vivo לשעבר. השוואות ביוכימיים והיסטולוגית שכמו כן נדרשו בעלי החיים המחקר להיות מורדמים. טכניקת הדמיה שתוארה זה מציעה את היתרון של הדמיה ואובייקטיבית כימות היקף בנקודות זמן מרובות לאחר השתלה ראשונית מבלי להקריב בעלי החיים המחקר. הטכניקה מוגבלת על ידי הגודל של השתל יכול להיות מוזרקים כמו עור סיכון שתלים גדולים יותר ונימק שומן. לשיטה זו כלי לכל מחקרי הערכת כדאיות שתל שומן ושימור נפח. הוא טוב במיוחד מתאים לproviding ייצוג חזותי של שתלי שומן ובעקבות שינויים בנפח לאורך זמן.

מבוא

פגמים ברקמות רכות נובעים ממגוון סיבות כולל טראומה, כריתת גידול, הזדקנות ואנומליה מולדת. הם יכולים להיות מתישים עבור מטופלים, ומייצגים את אחת הבעיות הנפוצות ביותר, אך המאתגרות ביותר עבור מנתחים משחזרים. קיימות שיטות רבות לטיפול בחסרים ברקמות רכות, כגון דשים מקומיים וחופשיים, הזרקות קולגן וחומרי מילוי סינתטיים. ^4-8 עם זאת, מאז השימוש המתועד הראשון בו על ידי נויבר בשנת 1893¹, העברת שומן אוטולוגית נותרה תקן הזהב לתיקון ליקויים ברקמות רכות, מכיוון שהוא זמין, קל ובטוח לקציר, ותואם באופן טבעי. ^1.2

למרות יתרונות אלה, שתלי שומן אוטולוגיים סובלים מהישרדות בלתי צפויה ומשתנה, עם שיעורי שימור הנעים בין 10-80% לאורך זמן. ^1-3,9 על מנת להסביר את אובדן הנפח והסימטריה הצפוי הזה, מנתחים חייבים לעתים קרובות לתקן יתר על המידה בעת מילוי פגמים ברקמות רכות, או לבצע הליכי מעקב מרובים.

מיטות השתל עם כלי דם גרועים אשמות בחלקן בספיגת רקמות זו. בנוסף, היעדר שיטת ניתוח אמת מידה להשוואת הישרדות השתל עשוי גם לתרום לחוסר העקביות בתוצאות המדווחות. שיטה מדויקת למדידת נפח השתל תפחית את שגיאת המדידה בעת הערכת שיעורי השמירה. זה בתורו יעזור לחוקרים לזהות בצורה מדויקת יותר את הגורמים הסיבתיים המשפיעים על הישרדות השתל. למרות שמודלים רבים של חיות מעבדה אפשרו הערכה כמותית ואיכותית של הישרדות שתלי שומן אנושיים, רובם מבוססים על אמצעים היסטולוגיים וביוכימיים ודורשים הקרבת חיית המחקר כדי להניב מדידה אחת. ^3,10-12 מעט דווח על השימוש בטכניקות הדמיה כדי לספור את שימור נפח השתלת השומן in vivo.

קומץ מחקרים קליניים הראו טכניקות מדידה יעילות יותר באמצעות הדמיה. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) הופעלה על ידי Hörl et al. כדי למדוד את הישרדות השתלת השומן¹³, ו-CT שימש את הר-שי ואחרים. ו-Fontdevila et al. בניתוחים שלהם של שימור נפח לאחר השתלה בחולים שסבלו מ-HIV. ^14,15 שימוש בתוכנת הדמיה תלת מימדית (תלת מימד), מאייר ואחרים. שימור נפח נמדד בבני אדם לאחר השתלת שומן אוטולוגית על ידי השוואת תמונות מהתקופה שלפני הניתוח ואחרי הניתוח. ¹⁶

עם זאת, שיטה סטנדרטית המשתמשת בהדמיה למדידת הישרדות שתלי שומן חסרה במחקר מדעי בסיסי. גישת הדמיה ברזולוציה גבוהה להערכת נפחי השתלות שומן תאפשר לא רק מדידות נפח מדויקות וניתנות לשחזור, אלא גם מדידות חוזרות המאפשרות הדמיה של התפתחות הישרדות שתלי השומן בזמן אמת.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקולי ניסוי וטפסי הסכמת מטופל לקבלת שומן היו נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת סטנפורד Institutional Review Board (פרוטוקול # 2,188). נהלי כל החיה אושרו על ידי הפנל המנהלי סטנפורד במעבדת טיפול בבעלי חיים (APLAC) לפי הפרוטוקול # 9999. כל הניסויים שנערכו עם הקפדה על בטיחות בבעלי חיים והנחיות טיפול הומניות.

1. שומן קציר

1. באמצעות ההליך קולמן ^17-19, להשיג רקמת שומן אנושית מהבטן, האגף, ו / או אזורי ירך של מטופלות בריאים עוברות שאיבת שומן אלקטיבי.
2. כדי לעבד את lipoaspirate להשתלה, כך שהוא מאפשר להתחיל השומן להתיישב למשך 30 דקות.
3. Lipoaspirate מתיישב בדרך כלל לשלוש שכבות, עם שמן בראש, שומן באמצע, ודם בתחתית. לשאוב ולזרוק את שכבת שמן העליונה ושכבה התחתונה דם.
4. כדי להסיר כל שנותר tumesc נוסףנוזל ent או פסולת תא, צנטריפוגות השומן במשך 5 דקות ב 350 XG ו4 ° C, ולשאוב את השכבה המימית התחתונה.
5. לחשב את כמות השומן הדרוש לשתל, המאפשר 20% שגיאת משלוח, ולהעביר את הנפח הרצוי של שומן לחרוטי 50 מיליליטר (ים). להכפיל 400 במספר העכברים במחקר כדי להשיג מיקרוליטר של השומן הדרוש לשתל.
6. בשלב זה, אם Cell ביצוע Assisted Lipotransfer ^20,21, מקום נפח של שומן להשתלה על קרח. לאחר מכן לקצור תאי שמקורם שומן סטרומה (ASCs) מהשומן שנותר בטכניקה סטנדרטית שתוארה על ידי צוק et al ^22.

2. שומן הארכת

1. להשיג נקבה, עכברים בעירום CD-1 הומוזיגוטים למחקר הניסיוני. בחר עכברים בין 8 - 12 שבועות של גיל.
2. כדי לגרום להרדמה, עכבר מקום לתיבת מציאה עם 2.5% תערובת isoflurane / חמצן ב2 L / min למשך כ -10 דקות. שים לב שisof המומלץמינון lurane משתנה עם זן עכבר.
3. כאשר קצב הנשימה של עכבר הואט, לאשר הרגעה נאותה עם קמצוץ הבוהן. החל משחת עיני סיכה וטרינרים לשני העיניים של העכבר.
4. אם העכבר אינו נרתע בתגובה לקמצוץ הבוהן, זה מאשר את מטוס מספק של הרדמה. מניחים את אפו של העכבר לnosecone אספקת 2.5% תערובת isoflurane / חמצן ב1-2 L / min. אם עכבר חוזר מקמצוץ הבוהן, לחזור לקופסה ובדוק שוב מציאה לאחר 5 דקות.
5. הגדר את שדה סטרילי תחת עכבר ולאחר מכן לחטא את הקרקפת עם 2.5% povidone- יוד ואחריו 70% אתנול פתרון. חזור על עוד פעמיים.
6. הנח וילונות כירורגית על העכבר ולהיות זהיר כדי לשמור על שדה סטרילי. מכשירים סטריליים, כפפות, וPPE יש להשתמש בכל העת.
7. אם נפח שומן להיות מורכב הונח בעבר על קרח, לאפשר לשומן ראשון להסתגל לRT לפני הלידה.
8. Backload מזרק luer נעילת מיליליטר 1 עם 1 מיליליטרשל שומן.
9. חבר 14 G, צינורית שומן ארוך 8 סנטימטר השתלה לסוף המזרק.
10. מערכת ראש-ידי לחיצה על בוכנת המזרק עד בין 200 ל -400 μl של שומן נשארה במזרק. בעוד מדכא על בוכנת המזרק לאשר שהצינורית מילאה באופן מלא עם שומן על ידי התבוננות שומן יציאת חור הצינורית הדיסטלית.
11. באמצעות מלקחיים עדינים, להרים את עור הגב בקו האמצע מעל הזנב ביותר ההיבט של הגולגולת. הפוך 1.5 מ"מ לחתוך בעור באמצעות מספריים עדינים.
12. מניחים תפר 6-0 ניילון אחת דרך אמצע החתך שמאוחר יותר ישמש כדי להביא את פצע קצוות יחד לאחר ההשתלה מתבצעת. אין לקשור את התפר.
13. צור כיס תת-עורי מעל הגולגולת על ידי החדרת הצינורית דרך החתך בעור ועובר את הצינורית קדימה ואחורה בצורה מניפה מעל הגולגולת לשחרר קבצים מצורפים רקמת חיבור לעור שמעליה.
14. ברגע שהכיס נוצר, מקם את גannula בקו האמצע של העכבר ישירות על הגולגולת עד הקצה טמון במקורי ביותר ההיבט של הכיס שאמורה להיות ממש מאחורי קו בין העיניים. (איור 1 א)
15. לאט לאט להזריק השומן באופן מדרדר, קידום הבוכנה תוך משיכת הצינורית בחזרה. בעזרת מלקחיים, להביא את קצות הפצע יחד ולהרים אותם כדי לשמור על כל שומן מדולף החוצה מהכיס.
16. לקשור את התפר שהונח בעבר, ולוודא כי הקשר הראשון טמון בקלילות על העור. לקשור עוד שלושה קשרים מרובעים ולחתוך את התפר עם זנב 3 מ"מ. (איור 1)
17. ודא עם הדמיה ומישוש ידני שהכיס לא מלא יתר על מידה ועור שמעל הכיס הוא לא מתוח. אם הכיס כבר מלא יתר על מידה, לחתוך את התפר ולהסיר את כל השומן בכיס. לשטוף את הכיס עם נאגר מלוח פוספט pH (PBS) 7.4 מחדש להזריק נפח קטן יותר של שומן.
18. הסר עכבר מnesthesia ומניחים על הגב שלה או בצד בכלוב נקי על ידי עצמו. לפקח על בעלי החיים לנשימה רגילה, תנועות רגילות, היעדר הדימום, וסימנים של כאב או מצוקה. לנהל 0.1 מ"ג / קילוגרם תת עורי כל שעה 6 עצירות עד 48 שעות אם בעל החיים הוא בכאב.
19. לוודא כי בעלי החיים התעוררו במידה מספקת כדי לשמור על כיבה sternal לפני שעזב אותו ללא השגחה. אל תניחו לבעלי חיים לכלוב עם בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא.
20. לאחר 4 שעות, להבטיח כי בעל החיים הוא מסוגל לאכול ולשתות, מהלך, ולנשום באופן רגיל ושאין דימום ממקום הניתוח. להחזיר אותו למתקן הטיפול בבעלי החיים.

3. מיקרו-CT

1. עכברי סריקה לנקודת התחלה ב היום שלאחר ניתוח 3 נפח, ולאחר מכן לחזור על סריקות בשבועות שלאחר ניתוח 2, 4, 6 ו -8.
2. כאשר ההדמיה העכברים בכל נקודת זמן, פעל לפי הנחיות הרגעה וטיפול בבעלי החיים לפני ואחרי-פרוצדוראלי כפי שתואר בעבר בSteps 2.2-2.4 ו2.17-2.19.
3. לבצע סריקות בסורק CT מיקרו עם גודל voxel שחזור של 100 מיקרומטר או טוב יותר.
4. עם kilovoltage שיא X-ray של 80 KVP ונוכחי האנודה של 450 מייקרו-אמפר, לנהל מנת מנה של כ 5 centiGy במהלך סריקת 9 דקות לכל עכבר. שים לב ערכים אלה משתנים בהתאם לפרוטוקול הסריקה.
5. קודם לביצוע הסריקה הראשונה, לכייל מיקרו-CT עם פנטום הדמיה שמבדיל בין האוויר, מים, ועוצמת עצם.
6. הנח ארבעה עכברים לסורק במצב הגחון עם שני עכברים על גבי ושתי בתחתית. מיטת סריקה בקלות ניתן לבנות באמצעות 60 מיליליטר מזרקים להחזיק את גוף העכבר ומזרקי 10 מיליליטר כקונוסים האף. ²³
7. לשמור על עכברים תחת הרדמה עם 2.5% תערובת isoflurane / חמצן ב 1-2 ליטר לדקה.
8. ודא עם תמונת צופים שכל הגולגולת של העכבר, מהאף לחוליית צוואר הראשון, ומחלק העליון של גולגולת לבסיס של SKUll, יהיה צילם.

ניתוח 4. מיקרו-CT

1. פתח את התמונות משוחזרות עם תוכנת מיקרו-CT הדמיה ניתוח שמאפשרת יצירת אזורים של העניין (ROI של) על ידי בחירת voxels באמצעות ספים לעוצמת פיקסל. תוכנה גם מאפשרת יצירת משטחי 3D באמצעות אינטרפולציה של voxels שנבחר, ולניתוח נפח.
2. התחל על ידי טעינת תמונות CT המשוחזרת בשני ממדים (2D) העטרה, צירי, ונוף sagittal. (איור 2 א)
3. שימוש בפרוסה הצירית כמדריך, לנווט לפרוסת sagittal שמתאימה להיבט השמאלי ביותר של שתל השומן. בחר סף עליון ותחתון לעוצמת פיקסל הלוכד את כל voxels המתאים להשתלת השומן, אבל זה אינו כולל את הרקמות ועצמות הסמוכות. (איור 2)
4. הגדר את ההחזר על ההשקעה בתצוגת sagittal שמתאימה לשתל השומן באמצעות ספי עוצמת פיקסל שהוגדרו בעבר. REPEAT הליך זה כל פרוסה sagittal החמישית, ניווט עד שיגיע לימני ביותר ההיבט של השתל. (איור 2 ג)
5. לשרבב voxels שנבחרו מכל ROI 2D של ל, ROI 3D בשילוב יחיד. (איור 2 ד)
6. ROI שיא מחושב על ידי תוכנת נפח.
7. לדקלם isosurface 3D לדמיין סופי שתל שומן הנפח. (איור 2E)
8. בניתוחים שלאחר מכן, הקפד לשמור את מקסימום עצמת פיקסל וערכי סף מינימליים זהים לאלה המשמשים לניתוח הבסיסי.

5. שומן קציר

1. לאחר העכברים נסרקו ל8 ^24,25 נקודת הזמן בשבוע, להרדים את העכברים כפי שתואר לעיל לעיל בשלבי 2.2-2.4 ו2.17-2.19.
2. בעקבות הנחיות APLAC, להרדים את העכברים על ידי הפרדת העמודות בעמוד השדרה שלהם.
3. מניחים את העכבר בשדה אופרטיבי. בעזרת המספריים tenotomy, לפתוח בזהירות את הכיס ולנתח tהוא מעל עור ורקמות חיבור קבצים מצורפים משתל השומן.
4. בשלב זה, זה עשוי לעזור לבלו תיקון של עור הגב שמעליה כדי לסייע בחילוץ של השתל. (איור 3 א)
5. קל לשמור על מתיחה על השתל עם מלקחיים ולהפוך את שתל מצד לצד כדי להמחיש נקודות רצופות של מתח שצריך להשתחרר במספריים.
6. הישאר קרוב לשתל ככל האפשר כאשר מוציאים כדי למזער את רקמת החיבור שצולמה עם השתל. (איור 3)
7. לאחר כריתת שתל, למדוד מסה בקנה מידת tared כי הוא מדויק ללפחות 0.01 גרם.
8. חשב את הנפח של שתל השומן באמצעות הערך שנמדד המסה והצפיפות הממוצעת של שומן אנושי (0.9 גר '/ מיליליטר) כיחס המרה.
9. שקלו את הנפח מחושב של שתל שומן לזו המתקבלת באמצעות מיקרו-CT.
10. שתלי שומן יכולים להיות מעובד להיסטולוגיה או ניתוח נוסף במידת צורך.

תוצאות

שתלי שומן ירדו בהדרגה בנפח במהלך המחקר, וכתוצאה מכך 62.2% הישרדות ממוצעת על ידי 8. (איור 4 א) בשבוע ²⁴ בסיום סריקת השבוע 8, כל שתל שומן הופק בחתיכה אחת. בדיקת סכום דרגת Wilcoxan שימשה להשוות את ההבדל בין מדידות נפח של שתלי שומן מתקבלים על ידי שני מיקרו-CT או מחושבים ממסה פיזית. לא נמצא הבדל משמעותי בין שתי שיטות אלה (עמ '-value דו-צדדי = .9362). (איור 4)

עם 5 ...

דיון

עד לנקודה זו, רוב החוקרים הסתמכו על שיטות הלא הדמיה לכמת את ההישרדות לטווח הארוך של שתלי שומן, אך שיטות אלה דורשים הקרבת בעלי החיים המחקר ולהניב רק מדידה אחת. ^3,10-12 המחקר שלנו מייצג שיטת ניתוח השתפרה המאפשרת אובייקטיבי, כימות של הישרדות שתל שומן בזמן אמת במודל של עכברים.

קריטי בתהליך זה הוא להבטיח כי עכברים מספיק חיסון המשמשים למחקר, כמו זה מונע את דחיית השתל שיתרחש אם עכברים בעלי מערכת חיסונית שלמה ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
SAL lipoaspirate
צנטריפוגה	בקמן קולטר, בע"מ, פסדינה, קליפורניה
50 מ"ל צינורות חרוטיים	BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה
CD-1 עכברים עירומים CD-1 (Crl:CD1-Foxn1nu)	מעבדות צ'ארלס ריבר, בע"מ, ווילמינגטון, MA
איזופלורן	הנרי שיין, דבלין, אוהיו
2.5% בטדין	פרדו פארמה, L.P., סטמפורד, CT
70% תמיסת אתנול	מגן זהב, הייוורד, קליפורניה
1 סמ"ק מזרק נעילת לואר	BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה
צינורית מד 14	Shippert Medical, Centennial, CO
	Extractps Fine Science Tools, היידלברג, גרמניה
מספריים Tenotomy	Fine Science Tools, היידלברג, גרמניה
6-0 תפר ניילון	Ethiconבלו אפר, OH
פוספט חוצץ	מי מלח Gibco, Carlsbad, CA
סורק מיקרו-CT	סימנס הלת'קר, פלזנטון, קליפורניה
פנטום	TriFoil Imaging, Northridge, CA
תוכנת ניתוח הדמיה	IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Scale	מטלר-טולדו אינטרנשיונל, בע"מ, קולומבוס, אוהיו

,