מאמר שיטה

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

13.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52228

⸱

23 בנובמבר 2014

 ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

במאמר זה

סיכום

ניתן להשתמש בהדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים כדי לחקור אינטראקציות בין סוגי תאים שונים בחוט השדרה בסביבת הרקמה הטבעית שלהם בחיה כימרית של מח עצם עם פגיעת ריסוק טראומטית של חוט השדרה בעמוד הגב.

תקציר

פגיעה טראומטית בחוט השדרה גורמת לתגובה דלקתית המערבת מקרופאגים שמקורם בדם ומיקרוגליה של מערכת העצבים המרכזית (CNS). מיקרוסקופיה דו-פוטונית תוך-חיונית מאפשרת לחקור מקרופאגים ומיקרוגליה בנגע חוט השדרה בבעל החיים החי. ניתן לבצע זאת בבעלי חיים בוגרים עם פגיעה טראומטית בעמוד הגב. כאן, אנו מתארים שיטות להבחנה בין מקרופאגים למיקרוגליה במערכת העצבים המרכזית באמצעות כימרה של מח עצם מוקרנת כדי להשיג בעלי חיים שבהם רק מקרופאגים או מיקרוגליה מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק מקודד גנטית. אנו מתארים גם מודל פציעה שמוחץ את עמוד השדרה הגבי של חוט השדרה, ובכך מייצר נגע מלבני פשוט, נגיש בקלות, שניתן לדמיין בקלות בבעל חיים באמצעות כריתת למינקטומיה. יתר על כן, נתאר נהלים להדמיה רציפה של בעלי החיים באתר האנטומי של הפגיעה לצורך חקר אינטראקציות תאיות במהלך הימים עד השבועות הראשונים לאחר הפציעה.

מבוא

התגובה הדלקתית למחלה או פציעה במערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא הבין היטב, במיוחד בכל הקשור ליחסי הגומלין בין תאי מערכת חיסון ותושב בתוך הרקמה. חקירות של אינטראקציות הסלולר אלה בחוט השדרה הן בעלי עניין מיוחד בחי. בדרכי העניין רק נגישות בקלות במערכת העצבים המרכזית הלבנות היא בעמודות הגבי של חוט השדרה, מה שהופך את זה תחום חשוב שבו יש למקד את המאמצים בשיפור גישה ניסויית אפשרית. חקירות אלה היו מוגבלות בשל הקושי הטכני בגישה ולייצוב מערכת העצבים המרכזית להדמיה. הדמיה לחיות בחוט השדרה שתוארה תנועה סלולרית בעבר 1-13, עם זאת, מספר המחקרים התייחסו בפגיעה בחוט השדרה מעבר לכמה שעות אחרי העלבון הראשוני. נגע חוט השדרה הטראומתי הוא סביבה מורכבת, עם תאי עצב, האסטרוציטים, fibroblasts, ותאי NG2, ותאי חיסון including מיקרוגליה, נויטרופילים, מקרופאגים, תאי T, תאי B ותאים דנדריטיים 14,15. המקרופאגים הם תת-הקבוצה של תאי מערכת חיסון אחראים לphagocytosis בנגע, שחדרו מהמחזור. תפקידם של תאי phagocytic אלה כבר התווכח, עם דיווחים מצביעים על כך שתאים אלה יכולים לקחת על שני תפקידים מזיקים ומגן ברקמה הפגועה. תפקידים אלה נעים בין הגדלת dieback axonal המשני לאחר פציעה ופועל באופן phagocytic 16-22, לוקח על ריפוי פצע פנוטיפ, ולהקטין את גירעונות תפקודיים בבעלי החיים הפצועים 21,23,24.

בעבר, מנסה להבחין מקרופאגים ממיקרוגליה הסתמכו בעיקר על מורפולוגיה ברקמה בריאה. עם זאת, מיקרוגליה ומקרופאגים מופעלים להביע רבים מאותו הסמנים ולהציג מורפולוגיה נבדלה לאחר פציעת 25-29, מה שהופכים את ההפרדה של פעילויות שונות של תאים אלה קשים ללמוד based בגורמים אלה לבד 30. ניתן להפריד תאים אלה על ידי ביטוי ההפרש של CD45 באמצעות זרימת cytometry 33,34, למרות שגישה זו היא פחות שימושית באפליה מסוג התא בגוף חי. ביטוי ההפרש ניצול של CCR2 וCX3CR1 במיקרוגליה ומקרופאגים גם נחקר, למרות שהשינויים הדינמיים בביטוי של סמנים אלה כמונוציטים להתמיין מקרופאגים יכולים לסבך ניתוח מדויק 35,36. Microglia הם התאים חיסוניים התושב במערכת העצבים המרכזית ונובע מאבות שק החלמון במהלך התפתחות עוברית, בעוד מקרופאגים נגזרים מאבות מח עצם ולהיכנס למערכת העצבים המרכזית הפצועה לאחר עלבון 31,32. גישה חלופית לשימוש במורפולוגיה להבחין בין שני סוגים אלה התא היא להחליף את מוח העצם עם אבות מבעלי חי תורם להביע סמן למעקב במקרופאגים נגזרו מאבות התורם, תוך שמירה על תושב CNS, recipהנגזר ient מיקרוגליה. המודלים chimeric מח עצם אלה נמצאים בשימוש נרחב ביישומים רבים אחרים 37-40. לשיטה זו אזהרות ייחודיות הקשורים לפגיעה בשלמות מחסום דם-המוח הנגרם על ידי תרופות קרינה או רעילות לתאים המשמשות למיגור אבות מח במארח, ובכך להגביל את השימוש שלה ביישומים מסוימים. לאחרונה, הבחנות פונקציונליות בין microglia ומקרופגים במערכת העצבים המרכזית מתחילות להבחין באמצעות cytometry זרימה, ניתוח מערך שבבי גן ושיטות chimerism 24,26,41-44, אשר תוכיח מאוד שימושי בעתיד. למרות מפריד בין שני סוגי התאים עדיין קשה, הבנת הפונקציות הייחודיות שלהם היא חשובה שבהוביל לטיפולים ממוקדים יותר של הפרעות שכוללות שני מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך מערכת העצבים המרכזית.

תיאור של אינטראקציות הסלולר בתוך נגע חוט השדרה הגיע בעיקר ממחקרים שכלל דגמי תרבית תאים. זה דue לאתגרים כרוכים בהדמיה הן נגע חוט השדרה ותאי חיסון יחד בחי. מודלים של מכרסמים הנוכחיים של פגיעה בחוט השדרה של סוג וחומרה שונים כוללים דגמי חבלה 45,46, פציעות דקירת סיכה 2, חתך 47, ולפציעתם למעוך עמודה הגבית שתוארה כאן 16,18,48. דלקת בקרומי המוח עולה עם חומרת פציעה ומציבה אתגרים ייחודיים להשתלה של חלונות או ניתוחים להדמיה סידורי. חלק מאתגרים אלה כוללים חדירה של תאי phagocytic, כמו גם את הדור של רקמה סיבית על האתר כירורגית. חלק מנושאים אלה ניתן להתגבר על ידי יצירת נגעים קטנים ומכסה את חוט השדרה החשוף ברוטב כירורגית שאינו חיסוני בין הדורה ושרירי paraspinous כדי לאפשר לניתוח פתיחה מחדש לאחר מכן, כפי שנעשה כאן כדי ללמוד את הפציעה למחוץ עמודה הגבי . יכולת תמונת החלק הגבי בלבד של הספיןכבל אל גם מגביל את הבחירה של פגיעה, שכן דגמי חבלה בעיקר לגרום לניזק לחוט המרכזי, לעתים קרובות חוסך חלק הגבי רוב עמודות הגב, במיוחד בנקודות זמן מוקדמות לאחר פציעת 45,49. לכן, אנו מתארים מודל פציעה פשוט שמניב נגע נקי, הדיר, מלבני בצורה שהוא שימושי עבור שתי התצפית של תנועת תאים בתוך הנגע ולכימות קל של axonal עמדה ביחס לנגע.

פרוטוקול

הערה: יש שוכנו כל בעלי החיים ומנוצלים בהתאם לועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש (IACUC) במוסד. כל הנהלים שתוארו כאן אושרו על ידי Case Western Reserve University IACUC.

1. בעלי חיים מהונדסים

  1. השתמש בעכברי כתב ניאון זמינים מסחרי לתייג אקסונים (Thy-1 YFP H) 50 ומיקרוגליה / מונוציטים (CX3CR1 GFP / GFP 51; ראה רשימה של חומרים). יש intercrossed עכברים אלו ומתוחזק כמושבות רבייה פרט בהתאם למדיניות טיפול בבעלי החיים מוסדית.

2. מח עצם מפלצות

  1. לזהות בעלי חיים, כי הם לפחות 8 שבועות של גיל לשימוש כחיות נמען.
  2. הנח חיות מארח בכלוב הקרנה מחזיקה עגול שנועד להחזיק את העכבר בעמדה כדי להבטיח אפילו, הקרנה כל גוף.
  3. כוון את הטיימר על צסיום (Cs-137) irradiator לנהל dos קרינה של הגוף כולוגיל 800-1,000 Rads לבעלי החיים על פי הוראות יצרן (דוגמאות שהובאו כאן הוא 980 Rads).
  4. חזור חיות בכלובים שלהם לנוח למשך תקופה מינימאלית של 4 שעות.
  5. בחר בעלי חיים תורם של גנוטיפ המתאים (ראה איור 2 א) כמקור לתאי אב במח.
    הערה: התורמים המתאימים הם בעלי חיים המבטאים כתבי ניאון שושלת ספציפית שונים מהמארח לזהות אוכלוסיות תאים שונות, או אחד מאותו גנוטיפ כפקדים.
  6. מלא צלחת פטרי אחת עם אלכוהול 70%, ומנה שנייה עם 10 מיליליטר Roswell Park זיכרון המכון (RPMI) תקשורת ומסננת 40 מיקרומטר תא ספוגים בתקשורת. מלא צינור חרוטי 15 מיליליטר עם תקשורת RPMI. שמור את הכלים וצינור על קרח.
  7. להקריב בעלי החיים תורם על ידי CO 2 מחנק פי הנחיות מוסדיות. נקה את העור ופרווה על ידי השריית כל החיה עם אתנול 70% עד שכל הפרווה רטובה.
  8. הסר את skמהמחצית תחתונה של בעלי חיים על ידי חיתוך סביב אמצע הקטע ומושך את עור מעל הרגליים האחוריות כדי לחשוף באופן מלא את שרירי רגליים.
  9. הסר את עצם השוק על ידי overextension הקדמי במפרק הברך לעקור את העצם, ולאחר מכן באמצעות מלקחיים סטרילית ומספריים, קליפה וחותך את השרירים משני הקצוות של עצם השוק. מניחים את העצמות בצלחת פטרי עם אלכוהול עד 30 שניות ולאחר מכן להעביר למסננת התא בתוך צלחת פטרי המכילה את התקשורת.
  10. לנקוע את מפרק הירך ולקלף את השרירים מחוברים לעצם הירך, הניח את עצם ירך קצרה באלכוהול ולאחר מכן למקם אותו באותה מסננת תא בתוך הצלחת.
  11. בשכונת תרביות רקמה, להשתמש במספרי סטרילי לחתוך את שני הקצוות של העצמות ולהכניס מחט 21 מד על מזרק 1 מיליליטר לסוף העצם. לשטוף את מוח לחרוטי 15 מיליליטר עם תקשורת. חזור על הנהלים לעצמות שנותרו.
  12. שימוש בחלק האחורי של הבוכנה של מזרק 3 מיליליטר, עצם התאהבות מסתיים בתאמסננת על צלחת פטרי כדי לחלץ יותר תאים.
  13. הנח את המסנן על גבי צינור חרוטי 50 מיליליטר ולהעביר את התקשורת עם תאים להישאף מצינור חרוטי 15 מיליליטר. השתמש בחלק האחורי של הבוכנה לרסק את מוח על מנת לקבל השעיה תא בודדת. שטוף את צינור חרוטי 15 מיליליטר, שברי עצמות ומסננת התא עם 30 מיליליטר של תקשורת לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר.
  14. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב XG 500 עד גלולה תאים.
  15. תאי דם אדום Lyse עם 2 מיליליטר של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) תמוגה חיץ במשך 2 דקות. להרוות את מאגר תמוגה עם 10 מיליליטר של תקשורת המכילה 10% בסרום שור עוברי. צנטריפוגה XG ב 500 למשך 5-10 דקות עד גלולה.
  16. לשטוף את תאי פעם אחת ב 10 מיליליטר של תקשורת RPMI ופעמים במלח, צנטריפוגה XG ב 500 למשך 5-10 דקות עד גלולה לכל שטיפה.
  17. Resuspend תאים לריכוז סופי של 3 x 10 6 תאים ב200 μl של תמיסת מלח.
  18. העברה 3 x 10 6 תאי מח באמצעות הזרקה לוריד זנב לIRRעכברי נמען adiated.
  19. הנח מים acidified (pH 3.0) בכלוב נמען ולאפשר עכברים להתאושש.
    הערה: עכברים שאינם ההשתלה תמותי תוך 10-14 ימים לאחר ההליך.
  20. לאחר 8 שבועות, לאמת הכינון מחדש מח על ידי בחינת תאי מערכת חיסון בדם היקפי באמצעות cytometry זרימה (איור 2 ב-ג).

פגיעה Crush טור 3. הגבי

הערה: בחר בעלי חיים הכימרה מתאימים או בעלי חיים מהונדסים כפולים לניתוח המבוסס על הניסוי הרצוי. בעלי חיים בתאי מח עצם נגזר תושב או או שכותרתו נוצרו בשלבים קודמים.

  1. הכן וחיטוי כלים כירורגיים, כולל rongeurs, מלקחיים דומון # 4, איריס מספריים, מלקחיים לרקמות מחזיקות, מחט נהגים וקליפים פצע.
  2. הכן תרופות לניהול לעכברים לשליטה בכאב. Bupernex וMarcaine משמשים בדרך כלל לשליטה בכאב. השתמש בתרופות מתאימות כנדרשnd אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC).
  3. לגרום להרדמה עם isoflurane 4% ולשמור על עם 1-2% isoflurane כדי להשיג קצב נשימה של 60-100 נשימות לדקה. החל סיכה עין בעיניו של בעל החיים כדי למנוע יובש בהרדמה ולאשר חוסר התגובה על ידי צביטה ברגל. לשמור על הטמפרטורה באמצעות כרית חימום ולנטר את הטמפרטורה באמצעות בדיקה רקטלית.
  4. לגלח את הגב של העכבר עם מכונת גילוח חשמלי מעל רמת חוט השדרה ממוקדת, ולאחר מכן לשטוף את האזור שלוש פעמים עם povidone- יוד ואחריו אלכוהול פעמיים עם 70%. מניחים את החיה על וילון סטרילי, ולכסות את החיה עם עוד וילון סטרילי עם חור לחתוך במיקום מתאים כדי להמחיש את האתר כירורגית. לשמור את כל הכלים על סדינים מעוקרים לאורך כל הניתוח.
  5. חותך את העור לאורך קו האמצע ברמת עמוד השדרה הרצויה עם איריס מספריים כדי לחשוף את השרירים בגבו של בעל החיים.
  6. תחת dissecting מיקרוסקופ, לחתוך את שרירי גב, ובכלל זה הטרפז והרצועות של dorsi latissimus לאורך קו האמצע שבו הם מייחסים לתהליכי השדרה הגבי, ולחשוף את עמוד השדרה.
  7. הסירו את שרירי הכתף בין תהליכי הגב ורוחביים של החוליה כדי לחשוף את lamina של החוליה הספציפית שיש להסירו (T11 במקרה זה). לזהות T11 על ידי ההחדרה של הצלעות שאינן צפות האחרונות על התהליך הזה.
  8. הכנס טיפים של rongeurs לתוך החלל מעל ומתחת לתהליך שיש להסירו ולהרים מעט כדי לוודא שהם נמצאים באופן מאובטח במקום סביב lamina השדרה אך לא עמוקים מדי כדי לפגוע בעמוד השדרה. rongeurs לסגור בתנועה אחת כדי להסיר את lamina.
  9. הגדלת laminectomy כנדרש על ידי השימוש בrongeurs להסיר חלקים קטנים של החוליה שנותרה.
  10. מדוד 1 מ"מ מקצות # 4 מלקחיים על ידי מחזיק אותם נגד שליט וסימון עם סמן קבע. מדוד 1 מ"מ בהימור הפרדהWeen שתי שיניים על ידי מחזיק את המלקחיים נגד השליט ולתקן את הרוחב המרבי של הטיפים ל1 מ"מ על-ידי החלקת טבעת גומי מלקחיים למקום על המוט של המלקחיים.
  11. ליצור חור קטן על ידי החדרת מחט 30 מד דרך הדורה בנקודות הכניסה לשתי השיניים של המלקחיים כדי לגשת לחוט השדרה.
  12. הכנס את שיני מלקחיים בזווית של 90 מעלות לדורה דרך החורים לעומק של 1 מ"מ מסומן על הצדדים של המלקחיים, כדי לוודא שהסימן הוא מעל הדורה. לצבוט לסגור את המלקחיים וחזקים למשך 10 שניות. מלקחיים שחרור, וחזור על הפעולה לסחוט עוד פעמים עבור הסכום כולל של שלוש מחזיק. הסר מלקחיים מחוט השדרה.
  13. משרים חתיכת ספוג ג'לטין דחוסה נספג במלח ומניחים על גבי אתר פציעה.
  14. שימוש בתפר פועל, תפר את השריר במקום מעל laminectomy וספוג ג'לטין ספוג במס '4 תפרי ניילון שאינו נספגים סינטטיים.
  15. קליפ העור במקום באמצעות CLI פצע 5 מ"מps.
  16. הזרק 10 μl Marcaine (1.0 מ"ג / קילוגרם) ב490 μl של תת עורי מלוח סביב אתר החתך וBupernex (0.1 מ"ג / קילוגרם) 5 μl לשריר לשרירי הישבן.
  17. לאפשר לבעלי החיים להתאושש על משטח חם ולפקח על קשיים בכל תנועה או סימנים של שיתוק בגפיים האחורי. אל תשאיר חיה ללא השגחה או בנוכחותם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין מן ההרדמה. אין להשתמש בכל בעלי חיים המציגים גירעונות מנוע נצפים.
    הערה: למרות שנגע למעוך זה יכול להתבצע בכל רמה לאורך חוט השדרה, כמעט, T10-L4 מציב אתגרים טכניים פחות הדמיה ביחס לנשימה וייצוב תנועת גוף באמצעות מהדק. מיקום קלאמפ חייב להיות שונה סביב כלוב הצלעות לתמונה ברמות החזה.

4. Intravital הדמיה

  1. הכן וחיטוי כלים כירורגיים, כוללים מלקחיים דומון # 4, איריס מספריים, מלקחיים להחזקת רקמות, ד מחטנהרות וקליפים פצע.
  2. להרדים את העכבר כמו קודם עם isoflurane. לגרום הרדמה ב4-5% ולשמור על 1-2% לפי צורך כדי לשמור על קצב נשימה של 60-100 נשימות לדקה וחוסר התגובה לקמצוץ רגל. שמור את העכבר מחומם, לפקח על קצב נשימה כאשר לא הדמיה ולפקח באופן רציף בטמפרטורה של בעלי חיים עם בדיקה רקטלית.
  3. נקה את העור סביב קליפים פצע עם פולידין ולאחר מכן אלכוהול ולהסיר את סרטוני פצע על פי הוראות יצרן. ברגע קליפים פצע יוסרו, להסיר שיער עם נאיר במידת הצורך ולנקות את האתר שוב עם אלכוהול povidone- יוד ו- 70%.
  4. לפתוח מחדש את העור עם מספריים. הסר את כל תפרים שנותרו משריר ולמשוך שריר בנפרד עם מלקחיים, גזירה במספריים במידת צורך.
  5. תחת מיקרוסקופ לנתח, ליצור כיסים לחוט השדרה מלחציים על ידי חיתוך השרירים במספריים בצד של התהליכים הרוחביים ברמת חולית חוליה אחת מעל ומתחת לLaminectomy.
  6. הנח מלחציים סביב כל אחד מחוליה אלה ולהדק. להתאים לפי צורך, כדי לאפשר מקום למטרת מיקרוסקופ כדי להגיע לחוט השדרה. ודא שחוט השדרה הוא במקביל לפלטפורמת ההדמיה, ולשמור על יציבות רקמה להדמיה. אם חפץ נשימה נתפס, להסתגל מלחציים בהתאם למזעור תנועה בתחום ההדמיה.
  7. לכסות את ווי התלייה עם parafilm.
  8. הסר את ספוג ג'לטין דחוס נספג מחוט השדרה עם מלקחיים, בעדינות להרים את חתיכות רבות ככל האפשר, גם הסרת כמה שיותר רקמת צלקת מרחבי קרומי המוח ככל האפשר. כיסוי נחשף חוט השדרה עם מי מלח וספוג חדש במידת הצורך.
    הערה: אם דימום מתרחש מהשרירים המקיפים, או נלהב עם ספוג או לצרוב במידת הצורך. עם זאת, יש להיזהר שלא לגעת בחוט השדרה עם כויה. מכסה את חוט השדרה עם או פיסת רקמה לחה או ספוג ג'לטין דחוס כאשר צריבה.
  9. צור well להחזיק את נוזל הטבילה על ידי האיטום ראשון עור ורקמות עם Vetbond, ולאחר מכן באמצעות אקריליק שיניים לבנות גם בין שני מלחציים של בעל חוט השדרה והצדדים של בעלי החיים. חכה עד שתרופות אקריליק.
  10. מלא היטב עם נוזל השדרה מוחין מלאכותי (aCSF) ולבדוק שוב לכל דימום סביב אתר הניתוח.
  11. לחלופין, בשלב זה, להזריק צבעי ניאון כלי לוריד על ידי הזרקה לוריד זנב כדי להדגיש את כלי הדם במהלך הדמיה.
    הערה: dextran פלורסנט מעל 70 kDa משמש לעתים קרובות, למרות נקודות קוונטיות וקטינים שכותרתו fluorescently משמשים גם צבעי כלי שימושיים. 50 μl של 150,000 WM TRITC-dextran מוזרק לוריד בדרך כלל.
  12. כדי להשיג תנועתיות תא חיסוניים רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, הטמפרטורה של העכבר חייבת להישמר על 37 מעלות צלזיוס. הזז את העכבר לסביבה מבוקר טמפרטורה מתחת למיקרוסקופ הדמיה ולפקח על בעלי החיים לanes הנכוןרמת thesia בשיעור נשימה וקמצוץ רגל. לפקח על בעלי החיים בתדירות גבוהה במהלך הדמיה כדי לקבוע עומק ההרדמה, במטרה להשיג קצב נשימה של 60-100 נשימות לדקה.
  13. אתר את אתר ההדמיה באמצעות עינית המיקרוסקופ.
  14. התאם את מיקרוסקופ סריקת לייזר 2-הפוטון לקחת תמונת Z- מחסנית כל שניות 30-60 לקבל נתונים הדמיה דינמיים.
  15. ברגע שפגישת הדמיה תושלם להסיר את החיה מהתיבה המחוממת.
  16. שחרר את ווי התלייה השדרה ולהסיר את העכבר מהמהדק. משוך אקריליק גם במרחק של העור תוך הסרת מהדק.
  17. אם העכבר הוא להיות צילם שוב, מקום ספוג ג'לטין הדחוס מלוח ספוג על חוט השדרה. סגור את השרירים ועור מעל אתר הניתוח. אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה או בנוכחותם של בעלי חיים אחרים בעודו מחלים מהרדמה. אם החיה מראה סימנים של חסר נוירולוגים לאחר התאוששות, צריכים להיות מורדמים בעלי החיים. אחרת, להרדיםהעכבר בתא CO 2 לפני שהוא עולה מהרדמה על פי פרוטוקול שאושר על-המתת חסד IACUC.
  18. ניתוח תמונות ניאון באמצעות תוכנת ניתוח תמונה על ידי ביצוע הוראות היצרן.

תוצאות

תרשים סכמטי המתאר את הנגע למעוך עמודה הגבי מוצג באיור 1 א. לאחר הפגיעה, בעלי החיים מוכנים והתייצבו למיקרוסקופיה intravital באמצעות מהדק השדרה (איור 1). תמונה שצולמה מייד לאחר הפציעה למחוץ עמודה הגבי תערוכות נגע מלבני נראה בבירור עם נקודות החדרת שן מלקחיים שהם בבירור לזיהוי. האקסונים באתר הפציעה, נותקו על פני פרק הזמן של טור הגב כולו (איור 1 ג). שלמות כלי דם נותרה בשלמותה, ואין עדות לדליפת צבע הכלי זוהתה על ידי הקרינה. כדי לבצע הדמיה סידורי של אותו הנגע מעל שבועות, ניתן נתפרו השרירים והעור מעל laminectomy לחשיפה מחדש לאחר מכן. מורפולוגיה נגע דומה נצפית בנקודות זמן מאוחר יותר (1D דמויות, E). 5 ימים לאחר פציעה, אתרי החדרת מלקחיים עדיין נראים לעין אבל הנגע החל להגדיל בד הגודלue לפגיעה משנית הנגרמת על ידי דלקת. האקסונים בסוף הזנב של הנגע שחזרו מהאתר הראשוני של הפציעה באמצעות תהליך הנקרא "dieback axonal". האקסונים בסוף מקורי של הנגע הציגו ניוון כמו-Wallerian (1D איור, E). בין ימים 5 ו -22 לאחר פציעה, בגודל של הנגע התייצב. במקביל, זרם גדול של CX3CR1 + תאים ניתן לראות שחדר ובמסביב לפצע למעוך בנקודתי הזמן הללו, אם כי זהותו של תאים אלה (מיקרוגליה לעומת מקרופאגים) לא ניתן להבחין בהכנה, כפי שמוצג באיור 1.

כדי להבדיל את ההתנהגות של מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך מייקרו-סביבת הנגע למעוך, מודל הכימרה הקרינה שימש (שמתואר באיור 2 א). ראשית, תאי אב במח העצם של עכבר + / GFP CX3CR1 מוחלפים בcel תורם לא פלורסנטls, כך microglia + GFP רק CNS-התושב גלוי על ידי הדמיה ניאון. היעילות של הכינון מחדש מח יכולה להיות מאושרת על ידי זרימת cytometry בחינת הדם ההיקפי 8 שבועות לאחר השתלת מח (איור 2 ב, ג). באיור 2, F4 / 80 ומקרופאגים החיוביים GFP, מסומן בכחול, המתגלים ב+ / GFP → C57BL / 6 עכבר chimeric CX3CR1, שבו כמה מונוציטים חיוביים שליליים אבל F4 / 80 GFP הם גם בהווה. באיור 2 ג, אין F4 הכפול חיובי / 80 ותאים חיוביים GFP נותרו לאחר החלפה של מח עצם נמען + / GFP CX3CR1 עם מח עצם מסוג בר. לפני פציעה, מיקרוגליה מופצים באופן שווה בתוך חוט השדרה, בו מוצגות מנוחה, מורפולוגיה מסועפת (איור 2 ד). 8 ימים לאחר פציעה, יכולים להתגלות רק כמה המיקרוגלים ובמסביב לפצע. microglia אלה להציג מורפולוגיה אמבואידית (איור 2E). שנית, עצםתאי אב במח בעכבר לא פלורסנט מוחלפים על ידי תאי מוח של עכבר + / GFP CX3CR1, לכן טיוח מח עצם נגזר CX3CR1 + מונוציטים / מקרופאגים הגלויים על ידי הקרינה GFP (איור 2 א). לפני פציעה, GFP + התאים זוהו רק במידה רבה perivascular, אשר כבר דיווחה להיות מח עצם נגזר ולהתהפך ללא הרף על בסיס קבוע 28 (איור 2F). לאחר פציעה למעוך, ניתן לראות תאים + / GFP CX3CR1 לאורך הצד הפנימי של כלי דם המקיפים את הנגע (איור 2H-J), ומרכז הנגע מלא בחדירת מקרופאגים CX3CR1 + / GFP (איור 2G).

הדמיה הזמן לשגות של העמודות הגבי יכולה להתבצע עד 6 שעות. באיור 3, אנו מראים CX3CR1 אינו chimeric + / עכבר GFP מייד לאחר פציעה שבו תאים מהמחזור ניתן לראותn נע מכלי הדם לכיוון ליבת הנגע ומרגש באתר הפציעה (איור 3 א ', ב'; משלים סרט 1). ניתוח תמונת ניצול עוצמת הקרינה לזהות תאים יכול לעקוב אחר הנתיבים נלקחו על ידי מקרופאגים (איור 3 א ', ב'; משלים סרט 1). סטטיסטיקה נגזרת מניתוח ההדמיה מראה תנועתיות של מקרופאגים הממוצע בנגע היא 3.6 מיקרומטר / min (איור 3D). לבסוף, בעדיין ניתן לאתר 22 ימים לאחר פציעה, האקסונים, מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך הנגע מפגין תחום ההדמיה יציב על פני תקופות זמן (סרט משלים 2) ארוכות.

figure-results-1
איור 1: יצירה והדמיה רציפה של הפציעה למחוץ עמודה הגבי. (א) הגבפציעה למחוץ עמודה מתבצעת על ידי הסרת תהליך הגב של החוליה ברמת העניין. מלקחיים מוכנסים לתוך טור הגב של גזרי מ"מ כבל 1 השדרה ולאחר מכן סגרו 3 פעמים כדי לייצר את הנגע שמוצג בסגול. (ב) בעלי החיים אז ממוקמים בחוט השדרה מלחציים להשיג יציבות להדמית intravital. (C) מייד לאחר פציעה, אתרי המלקחיים ההכנסה (סגלגל אדום) ומלבני פציעה למחוץ נפח (הקופסה האפורה) ניתן זיהו בבירור. האקסונים בשורשי הגב ניתן לראות (חצים לבנים), כמו גם את הקצוות הפצועים של האקסונים בצד הזנב של הנגע (ראשי חץ מלאים). (ד) 5 ימים לאחר פציעה, אתרי החדרת מלקחיים (סגלגל אדום ), ועדיין יכול להיות דמיין) המידה של הנגע (התיבה האפורה בקלות. הנגע גדל בגודל מאז העלבון הראשוני. האקסונים עוברים ניוון כמו-Wallerian ניתן לראות מקורי לנגע ​​(ראשי חץ פתוח) בadditiעל האקסונים בשורשים הגבי (חצים לבנים) ואת הקצוות של אקסונים נפצעו (ראשי החץ לבנים). (E) 22 ימים לאחר פציעה, אתר הנגע עדיין מזוהה עם ממדים דומים לפציעה לאחר 5 ימים. שים לב למספר הגדול של CX3CR1 + תאים ובסביב האתר נפצע. תכונות שכותרתו הן אותו הדבר כמו ב( D). כל הברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2: בנייה של עכברי chimeric כדי לעקוב אחר CX3CR1 + / GFP להביע מקרופאגים נגזרות מח CNS-תושב microglia או עצם בנגע למעוך עמודה הגבי. תרשים סכמטי של דור עכברי chimeric עם או CX3CR1 + / GFP להביע מיל ()croglia או מקרופאגים. ראשית, עכברי Thy-1 YFP H הם מוקרנים ובמח העצם מחדש עם תאי מח מבודדים מעכבר + / GFP CX3CR1, וכתוצאה מכך עכבר chimeric מקרופאגים שהם + GFP. שנית, Thy-1 עכברי H / CX3CR1 + / GFP YFP הם מוקרנים ובמח העצם מחדש עם תאי מח מבודדים מעכבר לא פלורסנט, הפקת עכבר chimeric המיקרוגלים שהם + GFP. (ב) דוגמא של זרימת cytometry נתונים עם תאי F4 / 80 + וCX3CR1 GFP + בדם מבעלי חי chimeric עם תורם מח + / GFP CX3CR1 הושתלו C57BL / 6 נמען מוקרן. דוגמא תאים שמקורם בתורמים החיוביים CX3CR1 כי הם חיוביים עבור שני GFP וF4 / 80 מוצגים בכחול מודגש אזור. (C) של זרימת cytometry נתונים עם F4 / 80 + וCX3CR1 GFP + תאים בבעלי חי chimeric עם C57BL6 מח תורם הושתלו irהמוקרן CX3CR1 נמען + / GFP. שים לב לחוסר CX3CR1 + / GFP החיובי הכפול וF4 / 80 תאים בתוך הכחול מודגש אזור. (ד ') תמונת מצב מיקרוסקופית שני פוטונים intravital של עכבר מתכנית chimeric הראשונה, מראה GFP + מיקרוגליה עם מורפולוגיה מסועפת בתוך הגב עמודה (ראש חץ). תאים אלה ובין בין האקסונים (צהוב) בשורש הגבי ועמודה הגבי. בר סולם = 100 מיקרומטר. (E) ההדמיה Intravital של אותו העכבר ב( B) 8 ימים לאחר פציעת טור הגבי מגלה כמה CX3CR1 + מיקרוגליה עם גופי תא גדולים ואמבואידית בצורה שחסרות תהליכים (ראש חץ). בר סולם = 100 מיקרומטר (F) Snapshot. של עכבר מתכנית chimeric השנייה ב (א), מראה GFP + מקרופאגים זעומים, בתוך parenchyma CNS. בר סולם = 100 מיקרומטר. (G) ההדמיה Intravital של אותו העכבר ב( F) 8 ימים לאחר פציעת טור הגבי מגלים אלזרם arge של מקרופאגים ובמסביב לפצע. בר סולם = 100 מיקרומטר. תמונה בהגדלה גבוהה יותר של תאי דם + CX3CR1 נגזרים במגע עם הכלים בבעלי החיים ללא כל הפגע (H). בר סולם = 30 מיקרומטר. שיקום (I) של תאי CX3CR1 במגע עם הכלי, מבט מבפנים על הספינה. בר סולם = 30 מיקרומטר. (J) שחזור של תאי CX3CR1 במגע עם הכלי, מבט מבחוץ של כלי השיט. בר סולם = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3 :. נתוני מעקב תא נציג בCX3CR1 אינו chimeric + / GFP עכבר מייד לאחר למחוץ עמודה הגביפציעה. (א) תמונת מצב של CX3CR1 מיקרוגליה + ומקרופאגים האקסונים סביב פגומים (צהובים) מסרט משלים 1 מייד לאחר פציעה למחוץ טור גב. (B) הנתיבים (האפורים) שצולם על ידי + תאי CX3CR1 ב (א) במהלך 110 דקות פגישת ההדמיה intravital. ייצוג מקודד זמן של המסלולים ב( ב) (ג). מסלולים הם בצבע המבוססים על הזמן שלהם בתוך הסרט כולו 110 דקות, כפי שמוצגים בסרגל הזמן. היסטוגרמה (D) של תנועתיות הכוללת של התאים + CX3CR1. כל הברים בקנה מידה הם 30 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט משלים 1: סרט intravital נציג מייד לאחר פציעה למחוץ עמודה הגבי בheterozygote הכפול Thy-1 YFP / + GFP / + עכבר. הדמיה של עמוד השדרה Intravital בוצעה מייד לאחר פציעה למחוץ עמודה הגבי ברמת T11. פנל ימני מראה התנועה של מיקרוגליה CX3CR1 + ומקרופאגים. נתיבי תנועת התא מוצגים כפסים לבנים על הלוח השמאלי. הפציעה ממוקמת בפינה השמאלית העליונה. ניתן לראות CX3CR1 + תאים עוברים לאתר של הפגיעה במסלולים אלה. האקסונים מוצגים בצהוב. בר סולם = 40 מיקרומטר. סה"כ זמן: 110 דקות. מהירות השמעה: 300x.

סרט משלים 2:. סרט intravital נציג ב 22 ימים לאחר נגע למעוך עמודה הגבי בheterozygote הכפול Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + העכבר המוצג כאן הוא סרט נציג שצולם בעכבר 22 ימים לאחר למעוך עמודה הגבי הראשונית פגיעה ברמה T11 השדרה. Injאורי ממוקם בפינה הימנית העליונה של המסגרת. האקסונים עולים (צהוב) rostrally מוצגים בפינה הימנית התחתונה. כלי וריד הגבי ודם מסומנים עם TRITC-dextran (אדום). CX3CR1 + תאים בתוך מהלך הנגע במהירות איטית יותר בהשוואה לאלו מייד לאחר פציעה. בר סולם = 50 מיקרומטר. סה"כ זמן: 90 דקות. מהירות השמעה: 600x.

דיון

אינטראקציות הדמיה סוגי תאים שונים בתאי רקמת מולדתם של שבהתפתח פתולוגיה בזמן אמת יצרו עניין רב. בתוך הרשת הצפופה של מערכת העצבים המרכזית, קשר תאי תאים ואיתות עם תאים סמוכים חיונית לתפקוד תקין ולהבנת הפתולוגיה של מערכת העצבים המרכזית. כאן, אנו תיארנו את השימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר 2-פוטון לתצפית של תנועה הסלולר בתוך נגע מכאני בחוט השדרה. בנוסף לאיכות של הכנת הניתוח ורקמה, יציבות מכאנית של הרקמה היא בעל חשיבות עליונה למיקרוסקופיה זמן לשגות מוצלחת, במיוחד הבידוד של חוט השדרה מנשימת חפץ בתנועה. יציבות ניתן להעריך על ידי מחפש תנועה של חוט השדרה תחת מיקרוסקופ לנתח שמתאים לקצב הלב או הנשימה של בעלי החיים. יציבות יש לבחון גם בעת ביצוע הניתוח וגם מייד לפני תחילת הדמיה. אם האנימהl הוא לא יציב, התאמות צריכות להיעשות כדי ההשמה והאטימות של מלחציים חוט השדרה. מודלים של עכברי כתב ניאון ספציפי תא מסוג בשילוב עם גישות הכימרה מח העצם אפשרו זיהוי של תאי monocytic לעומת מיקרוגליה ואקסונים. מחקרים קודמים גילו כי מיקרוגליה מונוציטים בדם נגזר ולא אחראים לנזק axonal המשני לאחר טראומה באמצעות המתודולוגיה שתוארה כאן 43. צבע כלי מצומדות dextran מאפשר זיהוי כלי שני לספק ציוני דרך ולזהות פרצות בשלמות כלי דם. הבחירה של מודל עכבר כתב הניאון המתאים היא קריטית כדי לאפשר זיהוי הנכון של סוגי התאים הרצויים להיות צילם.

פיתוח דגמי עכבר ניאון המתאימים למחקרים המתבצע גם קריטי להצלחה של ניסויים. הבחנה בין שתי אוכלוסיות phagocytic של CX3CR1 + / GFP תאים במערכת העצבים המרכזית היו קשים באופן מסורתי. כפי שניתן לראות כאן, טכניקה נפוצה חיסונית, מפלצות קרינה, יכולה להיות מנוצלת כדי להבחין, מיקרוגליה CNS-תושב רדיו עמיד ממקרופאגים נגזרות מח העצם. יש הליך הקרנת הפוטנציאל לפגוע במחסום דם המוח ולשנות פנוטיפים תאים, ולכן שימוש במודל זה יש לשקול בזהירות. שינויים אלה במידה שונה עם מינון קרינה, כמו גם משך תקופת החלמה, וההשפעה שלהם על דגמים דלקתיים שונים לא נחקרה באופן מלא. ההשפעות של קרינה על מחסום דם מוח CNS ניתן למזער על ידי מגן הראש במהלך הקרנה, וזה הוכח להפחית חדירת תא אל חוט השדרה לאחר הקרנה, גם אם חוט השדרה הוא לא ישירות מוגן 52. כאן יש לנו ציינו כי מספר התאים שחדרו למערכת העצבים המרכזית במצב יציב כתוצאה מדור הכימרה הוא חסר משמעות בניגוד לתחושהאה של תאי הזנת הנגע. מודלים חלופיים אחרים לשקול לכלול מפלצות בהשפעת סמים או 52 מודלים של עכברי parabiotic 53.

הנה, יש לנו הצגנו מודל פציעה קטן ספציפי, פשוט ושחזור כי תוצאות בנגע לחומר לבן גב של חוט השדרה שהוא קל לתמונה באמצעות מיקרוסקופיה 2-הפוטון. שיטה זו מספקת גם נגע לכימות לassay מידת dieback axonal בעמודות הגבי שבספרות כבר בשילוב עם 16,18,43,48,54 ניתוח רקמות קבועות משלימים. במודל זה, בעלי חיים להציג רק גירעונות מינימאליים ואין צורך בטיפול מיוחד לאחר פציעה. מחקרים עתידיים ניצול טכניקות פציעה למחוץ טור והדמיה הגב המתואר כאן עשויים להיות כלי מיון רבי עוצמה כדי להעריך את היעילות של טיפול בפגיעה בחוט השדרה. טיפולים אלה עשויים לכלול מעכבים קטנים מולקולה, תרופות, מוצרים סלולריים, שתלי רקמה וטיפול קומבינטוריתs. יחסי הגומלין בין מקרופאגים, מיקרוגליה ונוירונים הם גם צפוי לשחק תפקיד בדגמים אחרים מחלה בחוט השדרה, כוללים טרשת נפוצה, גידולים, דלקת קרום מוח וטרשת לרוחב amyotrophic, וטכניקה זו עשויה להיות שימושית במחקר של מחלות אלו, כמו גם .

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

הסוכנויות הבאות סיפקו תמיכה כספית קריטית למחקר זה: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), קרן דנה (A.Y.H.), קרן סנט בולדריק (A.Y.H.), קרן דוכן הלימונדה של אלכס (A.Y.H.), קרן המלאך של גבריאל (A.Y.H.) ותוכנית יונדאי הופ-על-גלגלים (A.Y.H). המחברים אסירי תודה על עזרתם ההכרחית של ג'רי סילבר ושרה בוש בלימוד פציעת ריסוק עמוד הגב (DCC). המחברים אסירי תודה גם לג'ינגצ'ואנג יו, אליזבת הייר והונגמיי הו על העזרה הטכנית בגנוטיפ ולרוס אנדרסון על הרכבת היחידה לייצוב עמוד השדרה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברי CX3CR1 GFPמעבדות ג'קסון5582
Thy-1 YFP H עכברימעבדות ג'קסון3782
כלוב פאי עכברBraintree ScientificMPC 2 סט
60 מ"מ 2 צלחת פטריקורנינג430166לבידוד מח עצם
Falcon 40 μ מסנן תא mפישר סיינטיפיק08-771-1לבידוד מח עצם
1 x 15 מ"ל ו- 1 x 50 מ"ל צינור חרוטיפישר סיינטיפיקלבידוד מח עצם
21 מחט מדBD305177לבידוד מח עצם
1 מ"ל מזרקBD309628לבידוד מח עצם
מאגר ליזה ACKGibcoA10492-01לעצם בידוד מח עצם
HBSSCorning Cellgro21-022-CVלבידוד מח עצם
RPMI מדיהSigmaR8758לבידוד מח עצם
F4/80 נוגדןEbioscience12-4801 PEלאימות FACS של כימרות
מזרק אינסולין 30 מדBD328280להזרקת וריד זנב
מהדקי חוט השדרהNarshingeSTS-Aלהדמיה
אורתו-ג'ט אבקת אקריליק דנטליתLang REF1320שיניים להדמיה
Ortho-Jet נוזל אקרילי דנטליLang REF1404להדמיה
ספוגי ג'לטין ג'ל קצףפייזר9034201להדמיה
4-0 תפרי אתילוןאתילון1667Gלניתוח
קליפס רפלקס, 7 מ"מקנט סיינטיפיקINS750344לניתוח. עיקור לפני השימוש
מספריים איריסכלי מדע עדינים14061-09לניתוח
45/5 מלקחיים, DumoxelFine ScienceTools 11251-35לניתוח
RongeursFine Science Tools16021-14לניתוח
30 מדמחט BD305106ליצירת חורי גישה במלקחיים
דומונט #4 טיפים לביולוגיהDumont11242-40לניתוח
נהגי מחטיםכלים מדעיים עדינים12002-12לניתוח
מישל פצע קליפ מלקחייםקנט INS700753מדעי לניתוח
מסיר קליפ פצעיםכלי מדע עדינים12033-00לניתוח
טבעות O למלקחייםכלי מדע עדינים11200-00לניתוח, לעתים קרובות מסופק עם מלקחיים #4, יכול גם יש להזמין בנפרד
גוזם בעלי חיים נטען אלחוטיסדרת Wahl8900לניתוח
Vetbond3M1469SBלניתוח
תמיסת בטדין (תמיסה מקומית של 10% פרובידין-יוד)Purdue Products L.P.NDC 67618-150-08לניתוח
קרם מסיר שיער Nairכנסייה & דווייט ושות', בע"מNRSL-22329-05לניתוח
איזופלורןבאטלר שייןNDC 11695-6776-2תרופות – לניתוח
מרקאיןהנרי שייןNDC 0409-1587-50תרופות – לניתוח 1.0 מ"ג/ק"ג הניתן תת עורי
בופרנקסהנרי שיין121-7793תרופות – לניתוח בופרנורפין 0.1 מ"ג/ק"ג
aCSFכימיקלים מסיגמא119 מ"מ NaCl
26.2 מ"מ NaHCO3
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1.3 mM MgCl2
10 mM גלוקוז		לניתוח
מפרוטוקולי קולד ספרינג הארבור
TRITC-dextan 150,000 MWSigmaT1287למתן תוך ורידי לסימון כלי דם

מקורות

  1. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  2. Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11 (5), 572-577 (2005).
  3. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760(2012).
  4. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
  5. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  6. Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8 (3), 58081(2013).
  7. Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (12), (2012).
  8. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18 (1), 166-171 (2012).
  9. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6 (3), (2011).
  10. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  11. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591 (19), 4895-4902 (2013).
  12. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  13. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
  14. Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24 (1), 13-17 (2003).
  15. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
  16. Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28 (38), 9330-9341 (2008).
  17. Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
  18. Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29 (2), 9967-9976 (2009).
  19. Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182 (2), 275-287 (2003).
  20. Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158 (2), 351-365 (1999).
  21. Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29 (43), 13435-13444 (2009).
  22. Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6 (7), 1000113(2009).
  25. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  26. Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (7), 676-685 (2001).
  27. Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14 (9), 1098-1100 (2011).
  28. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  29. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  30. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (1152).
  31. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  32. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  33. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  34. Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53 (4), 382-391 (2006).
  35. Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5 (10), 13693(2010).
  36. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  37. Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
  38. Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4 (4.6), (2008).
  39. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
  40. Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. , 4208(2012).
  41. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  42. Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89(2012).
  43. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
  44. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
  45. Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
  46. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
  47. Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030(2013).
  48. Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326 (5952), 592-596 (1126).
  49. Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5 (8), e12021(2010).
  50. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  51. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  52. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  53. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8 (3), e58544(2013).
  54. Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. , Abstracts. San Diego. (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GFP

מאמרים קשורים