כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא
במאמר זה
סיכום
תקציר
אינטראקציות RNA / חלבון הן קריטיות למסלולים רגולטוריים שלאחר תעתיק. בין מחייב חלבוני RNA cytosolic המאופיין ביותר חלבונים רגולטוריים ברזל, IRP1 וIRP2 הם. הם נקשרים לגהץ אלמנטי תגובה (IRES) בתוך האזורים מתורגמים (UTRs) של כמה mRNAs היעד, ובכך לשלוט בתרגום mRNAs או יציבות. אינטראקציות IRE / IRP נחקרו בהרחבה על ידי Emsa. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול Emsa לניתוח פעילות IRE מחייב של IRP1 וIRP2, שניתן להכליל על מנת להעריך את פעילותם של חלבוני קושרי RNA אחרים גם כן. Lysate חלבון גולמי המכיל חלבון קושר RNA, או הכנה מטוהרת של חלבון זה, הוא מודגרות עם עודף של 32 בדיקה RNA שכותרתו P, המאפשר להיווצרות מורכבת. הפרין מתווסף מונע חלבון שאינו ספציפי לבדיקה מחייבת. בהמשך לכך, התערובת מנותחת על ידי אלקטרופורזה שאינו denaturing על ג'ל polyacrylamide. הבדיקה בחינםנודד במהירות, תוך תצוגות מורכבות RNA / חלבון ניידות מפגרת; לכן, ההליך המכונה גם "פיגור ג'ל" או assay "bandshift". לאחר השלמת אלקטרופורזה, ג'ל הוא מיובש ומתחמי RNA / חלבון, כמו גם בדיקה בחינם, מזוהים על ידי autoradiography. המטרה הכללית של הפרוטוקול היא לזהות ולכמת IRE / IRP ואינטראקציות RNA / חלבון אחרות. יתר על כן, Emsa יכול לשמש גם כדי לקבוע סגוליות, זיקה מחייבת, והרכב של האינטראקציה RNA / חלבון נחקרים.
מבוא
Emsa פותח במקור כדי ללמוד את הקשר בין חלבוני קושרי DNA עם רצפי DNA היעד 1,2. העיקרון דומה לאינטראקציות RNA / חלבון 3, המהווה את המוקד של מאמר זה. בקצרה, RNA טעון שלילי ויהגר להאנודה שבאינה denaturing אלקטרופורזה בpolyacrylamide (או agarose) ג'לי. הגירה בתוך ג'ל תלוי בגודל של RNA, באופן פרופורציונלי למטען שלה. ספציפי מחייב של חלבון לRNA משנה הניידות שלה, והפליטים המורכבים איטי יותר בהשוואה לRNA החופשי. זאת בעיקר כתוצאה מגידול במסה המולקולרית, אלא גם לשינויים בקונפורמציה תשלום ואולי. ניצול RNA שכותרתו בדיקה מאפשר ניטור קל של "פיגור ג'ל" או "bandshift". שימוש של 32 בדיקות RNA שכותרתו P ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוצדורות עם עכברים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים מאוניברסיטת מקגיל (פרוטוקול 4966).
1. הכנת תמציות חלבון מתאים בתרבית
- שטוף תאים בתרבית פעמיים עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט קר כקרח (PBS).
- לגרד תאים חסיד עם או שוטר גומי או מגרד תא פלסטיק ב 1 מיליליטר של השעיה PBS, העברה קרה כקרח לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
- ספין בmicrocentrifuge למשך 5 דקות ב 7....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בדיקה IRE radiolabeled הוכנה, כפי שמתוארת בסעיפים 3 ו -4 לפרוטוקול. הרצף של החללית היה 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; נוקלאוטידים המודגשים מייצגים שאריות מזווגים C והלולאה, שהם תכונות IRE קריטיות. הרדיואקטיביות הספציפית של החללית הייתה 4.5 x 10 9 עותקים לדקה / מיקרוגרם של RNA.
כדי להעריך את ההשפעות של הפרעות ברזל על IRE מחיי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בזאת, אנו מתארים פרוטוקול שפותחה כדי לחקור את פעילות IRE מחייבת של IRP1 וIRP2, ואנו מראים נתונים נציג. באמצעות בדיקות שונות, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם ללימוד מחייב חלבוני RNA אחרים. שלב קריטי הוא בגודל של החללית. שימוש בבדיקות ארוכות, שהוא נפוץ כאשר אתר הקישור המדויק אינו ידוע, יכול לגרום למתחמי RNA / חלבון שאינו נודד באופן שונה מRNA החופשי. במקרה זה, מומלץ להסיר RNA מאוגד על ידי טיפול עם RNAse T1 (שלב 6.6). האיכות של החללית היא גם מאוד חשובה. התוצאות הטובות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (MOP-86514).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| לופפטין | SIGMA | L2884 | |
| PMSF | SIGMA | 78830 | |
| בדיקת חלבון BioRad | BIORAD | 500-0006 | |
| T7 RNA פולימראז | Thermoscientific | EPO111 | |
| מעכב RNase | Invitrogen | 15518-012 | |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | ||
| נוזל נצנוץ | בקמן קולטר | 141349 | |
| הפרין | SIGMA | H0777 | |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 | |
| שם הציוד | |||
| רקמות Ruptor | Qiagen | 9001271 | |
| מונה נצנוץ | בקמן קולטר | LS6500 | |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 | |
| 20 בארות מסרקים | BIORAD | 165-1868 | מרווחים בעובי 1.5 מ"מ |
| BIORAD | 165-1849 | ||
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
מקורות
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
