קרוב אינפרא אדום (ניר) אור מגביר את הביטוי של דה מרקר של פונקצית מיטוכונדריאלי בעכבר שיווי המשקל החושי האפיתל

ירידת ביצועי איזון ונפילות שלאחר מכן הם נפוצות, ותכונות למרבה הצער לעתים קרובות הגדרה של הזדקנות טבעית ^1. ההשפעה של ירידה זו יכולה להיות גם פיזית וחברתית, ומפחית באופן משמעותי את איכות חיים של אנשים מבוגרים. בתגובה, טיפולים ושיקום פיזיים היו מוקד המחקר לנפילות, אך לא היו קשורים עם ירידה עקבית בשכיחות של נפילות חוזרות ונשנות. במקביל, עבודה חוקרת שינויים במערכת ההיקפית או מרכזית שיווי המשקל (המערכת אחראית ללשמור על איזון) היא נדיר, ואסטרטגיות טיפוליות פוטנציאל מיקוד מערכות אלה וסיבות הגורמות לחוסר איזון מוגבל.

מחקר שנערך לאחרונה על הפרעות ניווניות גיל הקשורים כוללים התנוונות הקשורות לגיל מקולרי ^2-4, המודלים למחלת אלצהיימר ^5-8, ומחלת פרקינסון ^9-12 הראה השפעות נוירו של simple יישום לא פולשנית של אינפרא אדום הקרוב אור (ניר). יתר על כן, במערכת שיווי המשקל, ניר נעשה שימוש כדי להגדיל את הפעילות של תאי עצב הביא עיקריים שיווי המשקל במבחנה ^13. בעוד המנגנון של אור ניר אינו מובן היטב, רוב המחקרים משתמשים בניר הציעו שניר מגרה IV המיטוכונדריה המורכב (מונואמין ג ציטוכרום) ^14-17 כדי להקל על חילוף חומרים תאיים. בהאפיתל החושית שיווי המשקל צלחת subcuticular של תאים לי שיער סוג היא צפופה במיטוכונדריה ¹⁸ ובתור שכזו עשויה לייצג אתר של פעולה לטיפול בניר טיפולי.

כאן, משטר קצר, לא פולשנית טיפול בtranscranially מיושם ניר, שניתן להשתמש כדי למדוד את חילוף החומרים תאיים (ובמשתמע, פונקציה של המיטוכונדריה) בהאפיתל החושית שיווי המשקל העכבר מתואר. דן גם היא הכנה של האפיתל החושית שיווי המשקל והוא הראה כי ניר מגביר את הביטוי של ubiquitoשלנו נוגד חמצון (סופראוקסיד דיסמוטאז 1) בהאפיתל החושית - הראה בעבר להיות חשוב להישרדות תא שיער שבלול ^19.

הצהרת אתיקה: כל הנהלים המפורטים להלן אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת האתיקה בעלי החיים סידני.

1. בעלי חיים

הערה: 1 ו -8 - עכברי 9 חודשים ישנים (C57 / BL6) התקבלו ממרכז המשאבים לבעלי החיים (פרת ', אוסטרליה). עכברים שוכנו במתקן Bosch מכרסם באוניברסיטת סידני.

1. עכברי בית בכלובי עכבר סטנדרטיים ב12/12 hr מחזור אור / חושך עם גישה כלרצונך מזון ומים.
2. עכברי Divide בכל קבוצת גיל לאינפרא אדום קרוב (ניר) שטופלו, או טיפול דמה קבוצות (שליטה) להשוואה.

2. קרוב אינפרא אדום (ניר) הקרנה ושאם טיפול

1. לגלח את הפרווה באזור הראש והצוואר של העכבר עם מכונת גילוח חשמלי, ככל האפשר, כדי למנוע צמיחה מחודשת של שיער מהירה לפני השלמתו של משטר הטיפול. על מנת לשמור על הסטטוס-הפתוגן ללא של העכברים, להשתמש אתנול 70%לנקות מכשירים בין בעלי חיים גילוח וחיטוי וטרינרי F10 בין בעלי חיים מכלובים נפרדים. האם 2 זה - 3 ימים לפני תחילת טיפול ולכן בעלי החיים הם לא-מטופלים מעל.
2. לרסן את העכבר על ידי הלחיצה על הקצה הפרוקסימלי של הזנב ולאפשר לו להירגע בכף העליונה מחד או ספסל כדי למזער את הלחץ שעלולה להוביל לתוצאות שווא.
3. החזק את ניר (670 ננומטר) LED (דיודה פולטת אור) מכשיר 1 - 2 סנטימטרים מהאזור החשוף (מגולח) והפעל את ההתקן למשך 90 שניות (איור 1 א).
   הערה: שינוי הטמפרטורה כתוצאה מחשיפת 90 שניות נמדדה כ< 0.2 מעלות צלזיוס במי 100 מיליליטר.
4. חזור על שלבים 2.2-2.3 לקבוצת טיפול דמה של בעלי חיים, אלא להשאיר את המכשיר כבוי (איור 1).
5. חזור על שלבים 2.2-2.3 לקבוצת הטיפול החסומה-ניר של בעלי חיים, אלא לכסות את המכשיר בנייר אלומיניום.
6. חזור על שלבים 2.2-2.5 יומיים בapproximatדואר 24 מרווחי שעות במשך 5 ימים רצופים.
7. חלץ את האפיתל שיווי המשקל חושי (3 cristae והמקולה 1 utricular) משני האוזניים שבלאחר טיפול היום החמישי (ראה סעיף 3 להלן).

3. הפקת רקמות ²⁰

1. הכן 300 מיליליטר של מבוסס גליצרול מלאכותי נוזל השדרתי (ACSF) בהיקף של (מ"מ): 26 NaHCO _3, גלוקוז 11, 250 גליצרול, 2.5 KCl, 1.2 Nah ₂ PO _4, 1.2 MgCl _2, ו -2.5 CaCl _2. לפני התוספת של CaCl _2, גז הפתרון עם carbogen (95% O _2, 5% CO ₂₎ להקים pH של 7.4 ולהימנע ממשקעי סידן (עננות). צ'יל הפתרון במקפיא C -80 ° במשך 45 דקות כדי שslurry קרח נוצר.
2. הכן את חיץ תמוגה בידוד RNA בmicrotubes בורג בראש שכותרתו (מפסיק הנפץ של עפעפיים כאשר לחץ צינור שינויים בין ההקפאה והפשרה בחנקן נוזלי) על פילהוראות היצרן או נהלי מעבדה רגילים. יש לי חנקן נוזלי מוכן בבקבוק דיואר אלומיניום.
   הערה: השתמש בבגדים וeyeware מגן בעת ​​טיפול בחנקן נוזלי. ודא שחנקן נוזלי משמש בחדר מאוורר היטב כנפח של צורת הגז שלה הוא כ -700 פעמים כי המצב הנוזלי שלה ויכול לגרום לחנק.
3. עמוק לטשטש עכברים עם קטמין (400 מ"ג / קילוגרם) באמצעות הזרקה תוך הצפק. לאפשר לרפלקס האחורי-האיבר להתפוגג לחלוטין כסימן לכך שעכברים בהרדמה מלאה.
4. לערוף עכברים עם מספריים נירוסטה חדים ולעשות חתך לאורך עור sagittal של הגולגולת באמצעות סכין גילוח (מעוגל # 22). בשלב זה ובכל רחבי הצעדים 3.5-3.9, לשמור על קמרון הגולגולת, מוח, ומכשירי שיווי המשקל הבסיסיים מגניב ככל האפשר על ידי יישום רגיל של ACSF קר כקרח על הרקמה.
5. באמצעות הזרוע המחודדת של מספריים דפוס סטנדרטיים לעשות smalחתך l בגולגולת בLambda ולחתוך לאורך תפר sagittal.
6. חלק בעדינות זרוע אחת של rongeurs רדוד מתחת לעצם הקודקודית שמירת הלהב הקרוב ככל האפשר אל פני השטח הנחות של העצם ללא גרירת המוח. בטוח ולהתרחק עצם הקודקודית רוחבי והעצם העורף בדיעבד, עד שהמוח חשוף.
7. השתמש במרית נירוסטה קטנה ולהרים את המוח מקדמי והפוסות גולגולת אמצע לחשוף את עצב השמיעה ושיווי המשקל (CN VIII). Transect העצב כדי למנוע מתחים מיותרים על האקסונים הביא העיקריים שמעצבבים ישירות את תאי שיער שיווי המשקל.
8. הסר את המוח בטוטו לאחר חיתוך רוחב של CN VIII.
9. שים לב המבוך הגרמי המכיל את השבלול ואיברי שיווי המשקל ההיקפיים בהפוסות גולגולת האמצע. לעשות שני חתכים קטנים ליד כל מבוך גרמי, ולהסיר את כל המבנה על ידי לחיצה על התעלה חצי עגולה הקדמית ומושך מאוחר יותרברית.
10. מייד לטבול במבוכים נכרתו בצלחת לנתח מכילה פתרון ACSF קר כקרח (כמתואר בשלב 3.1) ואילו מרוסס ברציפות עם carbogen.
11. תחת סטראו, החזק את המבוך על ידי השבלול ולאבטח אותו לתחתית הצלחת עם מלקחיים.
    1. שימוש במלקחיים ישר קנס לגרד פתח קטן בעצמות מעל ampulla הקדמי תעלה חצי עגולה (SSC).
    2. בעדינות להגדיל פתיחה זו על ידי להגיע מייד מתחת לעצם ומצליף כלפי חוץ רחוק מampulla. נהג במשנה זהירות כאן לא לדחוף מלקחיים לתוך הפתח ולפגוע במבוך הקרומי השביר להלן. המשך בדרך זו עד utricle, הקדמי וampullae לרוחב כל חשופים. אם אפשר להסיר את ampulla האחורי גם.
12. באמצעות מלקחיים עדינים, בעדינות להרים את utricle וampullae מהמבוך הגרמי עד שהם מנותקים לחלוטין. במידת האפשר, להחזיק אותםעל ידי תעלות בצורת חצי עיגול הקשורים בם כדי למנוע נזק לאפיתל החושי. במקרים מסוימים, החלק הפרוקסימלי של הצינור בצורת חצי עיגול הקרומי ייתכן שיהיה הצורך לגזור במספריים איריס לשחרר ampullae מהעצם.
13. באופן מאובטח לתפוס את איברי שיווי המשקל בין קצה המלקחיים והמקום למאגר תמוגה הכין קודם לכן בשלב 3.2. מערבולת בעדינות את המלקחיים סביב במאגר כדי להבטיח איברי שיווי המשקל שמנותקים מהמלקחיים. בדקו זה המקרה על ידי הבאת המלקחיים תחת stereomicroscope.
    1. לדפוק על מכסה microtubule ולהקפיא את המדגם בחנקן נוזלי באופן מיידי.

4. הפקת RNA וRT-PCR

1. עקוב שיטות סטנדרטי להפקת שליח RNA (mRNA) על פי הוראות יצרן או פרוטוקולי מעבדה מועדפים.
   הערה: ערכה מסחרית שנוצלה RNAs ספק לעזור לבודד תשואות קטנות של mRNA שימשה בזהפרוטוקול. כרכי elution תחתון ניתן להשתמש כדי להגדיל את הריכוזים סופיים של mRNA.
   הערה: בקרות שליליות "אין אנזים" (NECs) ובקרות "אין תבנית ה- DNA" (NTCs) גם יש להשלים כדי להבטיח תוקפו של השפעות שנצפו.
2. ליישם שיטות סטנדרטית של שעתוק לאחור של mRNA ל- DNA משלים (cDNA) והגברה של גני המטרה ^21-23.

כדי להשוות את ההשפעה של טיפול בניר צעיר (4 שבועות) ומעלה (8-9 חודשים) עכברים מדדנו את הביטוי של סופראוקסיד דיסמוטאז נוגד חמצון 1 (SOD-1) בצעיר (n = 16) ומעלה (n = 20) עכברים שטופלו היו ניר, שטופל דמה, או חסום-ניר. איור 2 מראה גידול משמעותי בביטוי β-אקטין מנורמל SOD-1 של יותר מ פי 2 בבעלי חיים צעירים שטופל ניר בהשוואה לבעלי חיים שטופל בדמה צעיר (P <0.01) ובעלי חיים חסומים-ניר צעיר (p <0.01). בעלי חיים שטופלו ניר מבוגר הראו גם יותר מ 2-לקפל-רגולציה של SOD-1 בהשוואה לבעלי חיים מבוגרים חסומים-ניר (p <0.05).

איור 1. ניר טיפול. () ניר LED מכשיר החזיק 1-2 סנטימטר מעל האזור המגולח על ראשו של העכבר למשך 90 שניות בכל יום במשך 5 ימים רצופים בגיד קרינהעכברי טד. (B) ניר LED מכשיר החזיק מעל עכברים שטופל בדמה באותה הדרך אבל עם המכשיר כבוי למשך 90 שניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. ניתוח של ביטוי גנים SOD-1 לאחר 5 ימים רצופים של טיפול ניר (90 שניות / יום). האפיתל החושית שיווי המשקל היה לקצור ביום החמישי והגן נוגד חמצון ספציפי חקר לבאמצעות RT-PCR. גן SOD-1 מנורמל לβ-אקטין תחילת המחקר ובצפיפות שנערכה באמצעות v1.48 ImageJ. עד-רגולציה משמעותית (p <0.01) ביטוי SOD-1 נצפתה בבעלי חיים שטופלו ניר צעירים בהשוואה לשתי צעירים שטופל דמה ובקרות צעירות חסומות-ניר (4 שבועות). וגידול משמעותי (p60 #; 0.05) בביטוי SOD-1 נצפו גם בבעלי חיים מבוגרים שטופל ניר בהשוואה לבעלי חיים מבוגרים חסומים-ניר (8-9 חודשים). כל הגרפים מראים את שינוי הקיפול של ביטוי גנים SOD-1 לעומת השליטה טופל הדמה הצעירה. הנתונים מייצגים ממוצע ± SD. כל הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני ומשמעות סטטיסטית נקבעה באמצעות ההשוואה מרובה של Tukey פוסט-הוק בדיקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.