הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישת Bioreporter תא כל להערכת תחבורה וזמינות ביולוגית של מזהמים אורגניים במערכות לא רוויים מים

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52334

⸱

24 בדצמבר 2014

 ,  ,  , 
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ, 2Department of River Ecology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

במאמר זה

סיכום

Assay bioreporter התא שלם עם sartisoli Burkholderia RP037-mChe פותח כדי לזהות שברים של מזהמים אורגניים (כלומר, fluorene) זמינים לשפלת חיידקים לאחר תחבורה פעילה על ידי mycelia גישור נקבוביות אוויר מלא במערכת מודל בלתי רוויה מים.

תקציר

זמינות ביולוגית של מזהמים היא תנאי מוקדם לפירוק הביולוגי היעיל שלהם באדמה. עם זאת, הריכוז הממוצע בתפזורת של מזהם אינו מדד מתאים לזמינותו; הזמינות הביולוגית תלויה במקום זאת באינטראקציה הדינמית של העברת מסה פוטנציאלית (שטף) של תרכובת לתא מיקרוביאלי וביכולתו של האחרון לפרק את התרכובת. בחלקים בלתי רוויים של האדמה, הוכח כי תפטיר מתגבר על מגבלות הזמינות הביולוגית על ידי הובלה וניוד פעיל של תרכובות אורגניות בטווח של סנטימטרים. בעוד שניתן לכמת בקלות את היקף ההובלה המבוססת על תפטירים באמצעים כימיים, אימות הזמינות הביולוגית המזהמת לתאי חיידקים דורש שיטה ביולוגית. בהתמודדות עם אילוץ זה, בחרנו בפלואורן PAH (FLU) כתרכובת מודל ופיתחנו מיקרוקוסמוס מודל בלתי רווי של מים המקשר בין מקור נקודת שפעת מופרד מרחבית לבין חיידק הביו-מדווח המשפיל FLU Burkholderia sartisoli RP037-mChe על ידי רשת תפטירים של Pythium ultimum. מכיוון שהביו-ריפורטר מבטא eGFP בתגובה לשטף ה-PAH לתא, ניתן לנטר חשיפה ופירוק של שפעת חיידקית ישירות במיקרוקוסמוס באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). ניתוחי CLSM ותמונות חשפו עלייה משמעותית בביטוי eGFP בנוכחות P. ultimum בהשוואה לבקרות ללא תפטיר או שפעת, ובכך הצביעו על זמינות ביולוגית של שפעת לחיידקים לאחר הובלה בתיווך תפטיר. תוצאות CLSM נתמכו על ידי אנליזות כימיות במיקרוקוסמוס זהה. המיקרוקוסמוס שפותח הוכיח את עצמו כמתאים לחקירת זמינות ביולוגית של מזהמים ולדמיין במקביל את האינטראקציות המעורבות בין חיידקים לתפטירים.

מבוא

אדמה מאוכלסת בצפיפות על ידי מגוון רחב של מיקרואורגניזמים 1,2 כגון חיידקים. עם זאת, תנאים בבית גידול זה הם מאתגרים, במיוחד במונחים של מים זמינות 3. חיידקים זקוקים באופן קבוע כדי לחפש תנאים אופטימליים בסביבות הטרוגניות 4, אבל היעדר סרטי מים רציפים וכתוצאה מכך הניידות הוגבלה 5 מעכב אותם כדי להפיץ באופן חופשי. כמו כן, שיעורי דיפוזיה של מומסים (למשל, חומרים מזינים) הם הורידו בתנאים בלתי רוויים 6. לפיכך, חיידקים וחומרים מזינים לעתים קרובות מופרדים פיזי ונגישות תזונתית מוגבלת 3. כתוצאה מכך, וקטור תחבורה לתרכובות כימיות שאינו דורש מים שלב רציף יכול לעזור להתגבר על מגבלות אלה. למעשה, מיקרואורגניזמים רבים כגון פטריות וoomycetes פיתחו צורת צמיחת פילמנטיות מאפשרת להם לגדול דרך נקבובי אוויר מלא ובכך להגיע וmobilizing גם פיזי מופרד חומרים מזינים 7 ו -8 חומרי פחמני על פני מרחקים ארוכים. הם עשויים אפילו לשמש כוקטורי תחבורה ביולוגיים אשר מספקים סוכרים ומקורות אנרגיה אחרים לחיידקי 9. ספיגה והובלה ביצורים mycelial גם הוכחו למזהמים אורגניים הידרופובי כגון פחמימנים ארומטיים polycyclic (PAH) בPythium ultimum 10 או בפטריות mycorrhizal arbuscular 11. מאז PAH הם מזהמי מים נמצאים בכל מקום ומסיסים היטב 12 באדמה, תחבורה בתיווך mycelia עשויה לסייע להגביר את הזמינות הביולוגית מזהם לdegraders חיידקים פוטנציאלי. למרות שהסכום הכולל של מזהם ניתן לכמת באופן ישיר על ידי אמצעים כימיים 10, הזמינות הביולוגית של מזהמים מועברים על ידי mycelia לחיידקי מפרקים ואורגניזמים אחרים לא ניתן להעריך בקלות.

הפרוטוקול הבא מציג שיטה להערכת ההשפעה של myceליה על זמינות ביולוגית מזהם לdegraders חיידקים באופן ישיר; הוא מאפשר איסוף מידע על השפעת spatiotemporal של מזהמים על מערכות אקולוגיות של חיידקים. אנו מתארים כיצד להגדיר את מערכת מיקרוקוסמוס בלתי רוויה משוכללת מחקה ממשקי אוויר-מים בקרקע על ידי קישור מקור נקודת PAH מופרד פיזי עם חיידקי bioreporter PAH-משפיל באמצעות וקטורי תחבורת mycelial. בגלל תחבורה מוטסת מודרה, את ההשפעה של תחבורה מבוססת mycelial על זמינות ביולוגית PAH לחיידקים ניתן ללמוד בדרך מבודדת. בפירוט רב יותר, RP037-mChe sartisoli fluorene שלוש טבעות PAH, האורגניזם mycelial Pythium ultimum וbioreporter חיידק Burkholderia 13 יושמו בsetups מיקרוקוסמוס תאר. B. החיידק sartisoli RP037-mChe נבנה במקור כדי ללמוד והנתיבים phenanthrene לתא 14 ומביע משופר חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) כתוצאה משטף PAH להתא, ואילו fluorescing האדום mCherry בא לידי ביטוי constitutively. מידע מפורט על בניית הכתב ניתן על ידי Tecon et al. 13 בבדיקות ראשוניות, עולה כי אין החיידק שחייה ורק יכולת רץ איטית מאוד. זה היה יכול להעביר לאט בעובש של ultimum Pythium כאשר מיושמים כהשעיה צפופה על גבי העובש. מאז חיידקים היו משובצים בagarose בפרוטוקול הבא, הגירה על העובש לא התרחשה.

באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר (CLSM), ניתן דמיינו חיידקי bioreporter ישירות במיקרוקוסמוס וביטוי של eGFP ניתן לכמת ביחס לכמות תאים (הפרופורציונלית לאות mCherry) בעזרת ImageJ התוכנה. זה מאפשר השוואת זמינות ביולוגית איכותית בתרחישים שונים (כלומר, גבוה או נמוך יותר). שפעת נמצאה זמין ביולוגי לאחר תחבורת mycelial על ידי פ ' ultimum (כלומר, זההיה גבוה יותר מאשר בבקרה שלילית). יתר על כן, הפרוטוקול מתאר כיצד לכמת את הסכום הכולל של תחבורה בתיווך mycelia באמצעים כימיים וכדי לוודא את הזמינות הביולוגית מזהם באמצעות סיבים מצופים סיליקון זכוכית (סיבי SPME) במיקרוקוסמוס הזהה. תוצאות באמצעות התקנת מיקרוקוסמוס זה פורסמו ונדונו לשילוב של פ ultimum, fluorene ו- B. sartisoli 15 RP037-mChe. כאן, במוקד נמצא על תיאור מפורט ושיטת זיהוי בעיות הפוטנציאליות של הפרוטוקול כדי לספק את הידע הזה ליישומים נוספים פוטנציאליים. יישומים נוספים עשויים להיות כרוכים בפטריות שונות, מיני חיידקים (למשל, מאתרים מזוהמים), ומזהמים אחרים (למשל, חומרי הדברה) או זיהום אספקה ​​(למשל, קרקעות בגיל).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מנות, צ'יימברס שקופיות והדגירה

  1. הכן את החומר הבא לכל מיקרוקוסמוס: פלסטיק אחד גדול תחתון פטרי צלחת (ד = 10 סנטימטרים), אחד שונה (ראה שלב 1.2) פלסטיק קטן תחתון פטרי צלחת (d = 5 סנטימטרים) עם מכסים והחלק תא ספירה אחת עם שלושה חללים.
  2. קח את המספר הרצוי של חלקים תחתון צלחת פטרי (d = 5 סנטימטרים). הסר חלק מגדותיו עם מסור כדי שיתאים לשקופית (אורך קצה 26 מ"מ) בדיוק. כדי לעקר את המערכת, לספוג תחתית צלחת פטרי ומכסים ב -70% אתנול O / N ולייבש אותם לפחות שעה 2 בזרימה ממשלה תחת UV-אור. אחסן את צלחות פטרי במכל פלסטיק סגור היטב, שגם נחשף לקרינת UV-אור עבור 2 שעות.
  3. נגב את המספר הרצוי של שקופיות עם אתנול 70% ואוויר יבשים אותם. לעטוף שקופיות בנייר אלומיניום ומכניס אותם בתנורי מופל במשך 5 שעות ב 450 מעלות צלזיוס כדי להסיר זיהומים אפשריים.
  4. הכן תאי דגירה זכוכית עם מכסים. לנקות עם 70% אתנול ולחשוף תאים פתוחים לUV-אור לפחות 2 שעות בזרימה ממשלה.
    הערה: ייבוש גדול (קוטר כ -30 סנטימטרים) עם מכסים עשוי לשמש למטרה זו; כל ייבוש עשוי לאכלס עד עשרה setups מיקרוקוסמוס.

2. הכנת מדיה ותרבויות

  1. כדי להפעיל 20 מיקרוקוסמוס המקביל, לקבל משינוי tryptone-שמרים בינוניים (MTY) 14, כ -150 מיליליטר של 21C 16 בינוניים מינימאליים (MM), 5 מיליליטר של אגר בינוני המינימלי של 100 מיליליטר (MMA; 0.5%, w / v), שלוש צלחות אגר דקסטרוז תפוחי האדמה (PDA; 1.5%, w / v) לפ ultimum, ארבע צלחות ריקות, צלחת PDA אחד המכילה 2 מ"ג L -1 cycloheximide, ארבע צלחות agarose (3%, w / v) המכיל 0.3 גרם מיליליטר -1 פחם פעיל ו -40 מ"ג של שפעת ב2 חלקי מ"ג.
  2. הכן MTY המכיל L מ"ג -1 50 של kanamycin (kanamycin הוא required לשמור eGFP פלסמיד כתב) וMM המכיל 10 אצטט מ"מ לגידול חיידקים. השתמש MM ללא אצטט להכין 0.5% MMA לקיבוע של חיידקים במיקרוקוסמוס ויוצקים צלחות (כל 20 מיליליטר) של מחשב כף יד 1.5% לגידול של setups ultimum ומיקרוקוסמוס Pythium.
  3. לחסן כמה העובש של פ ultimum על שלוש צלחות PDA טריות והדגירה בחושך ב 25 מעלות צלזיוס במשך כ -72 שעות. ואז לוודא שהצלחות הן מגודל לחלוטין על ידי תפטיר טרי ורך.
  4. התחל שתי תרבויות של B. sartisoli RP037-mChe ב 50 מיליליטר של MTY ממניות גליצרול. לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם התנועה סיבובית בקבוק 230 סל"ד O / N.
  5. צפיפות תרבות מדד אופטית (OD) בשעה 578 ננומטר ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך 10 דקות (לsartisoli B. RP037-mChe, OD הצפוי 578 הוא כ 1.0 ותאים נמצאים בשלב מעריכי). בטל supernatant מחדש להשעות התאיםבכמות מתאימה של MM להגיע OD 578 של 0.4. לחסן 20 מיליליטר של MM המכיל 50 מ"ג L -1 kanamycin עם 400 μl של תאי resuspended. לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם התנועה סיבובית בקבוק 230 סל"ד O / N.
  6. למדוד OD 578 של התרבות בMM (לsartisoli B. RP037-mChe, OD הצפוי 578 הוא כ 0.2 ותאים נמצאים בשלב מוקדם מעריכי). תרבות צנטריפוגה XG ב 2000 עבור 10 דקות מחדש להשעות את התאים בכמות מתאימה של MM להגיע OD של 0.4. מערבבים 50 μl של ההשעיה התא עם 500 μl של חם MMA, נוזל בצינורות 2 מיליליטר ולאחסן ב -50 ° C עד שימוש. השתמש 150 μl של תאים בMMA לכל מיקרוקוסמוס.
  7. יוצקים צלחות של ג'ל agarose המכיל פחם פעיל. להמס agarose (3%; w / v) במים מזוקקים כפולים. מערבבים היטב עם פחם פעיל (0.3 g מיליליטר -1) ויוצקים את התערובת לתוך צלחות פטרי פלסטיק(ד = 10 סנטימטרים).

3. מיקרוקוסמוס הרכבה

הערה:. התקנת מיקרוקוסמוס השלמה מתוארת באופן סכמטי באיור 1 עיין באיור 1 עבור כל הצעדים הבודדים הבאים. השלבים הבאים מתארים את הכנת מדגם (SAM) עם וקטורי תחבורת mycelial ושלוש הגדרות שונות שליטה (AIR CON, נג CON, POS CON). ניתן למצוא סיכום של כל המערכים השונים בטבלה 1.

  1. קח מספר רצוי של צלחות פטרי ושקופיות ולחשוף אותם לאור UV תחת זרימת ממשלה למשך 30 דקות.
  2. מניחים את צלחת פטרי הקטנה בתוך אחד הגדול ולהתאים את החלק דרך הפער של צלחת פטרי הקטנה. קח לדוגמא אחד מהשעית התא החמה בMMA ולהוסיף 150 μl לתוך חלל אמצע שקופית אחת. חזור על פעולה זו עד לחללי אמצע כל השקופיותמלא בMMA. חכה 5 דקות לMMA כדי לחזק.
  3. השתמש דקור פקק 1 סנטימטר לאגרוף החוצה כתמים עגולים מצלחת PDA ריקה. הנח תיקון אחד במרחק של 2 מ"מ בסמוך לMMA בתוך צלחת פטרי הקטנה. הוסף את זה כדי לקדם את צמיחת mycelial בהתקנה (PDA 3 באיור 1).
  4. חותך תיקוני מחשב כף יד מעוגלים כמו מחסומים מכאניים. השתמש בחלק תחתון צלחת פטרי הקטנה נקי וסטרילי ולחץ אותו לתוך צלחת PDA. השתמש במרית כדי לחתוך עוד טבעת קטנה במרחק של 0.5 סנטימטרים לתוך אגר שתוצאת PDA-טבעת.
    1. לגזור חתיכה שמתאימה בדיוק לפער של צלחת פטרי הקטנה בהתקנת מיקרוקוסמוס, ולמקם אותו בתוך הפער על גבי השקופית. ודא שהמרחק בין MMA ומחסום PDA החוזר הוא כ -2 מ"מ. סגור את המכסה של צלחת פטרי הקטנה בעדינות הטביעה אותו בתוך מחסום PDA.
    2. חזור על שלבים 3.4 ו3.4.1 עם צלחת PDA המכילה 2 ליטר g -1של cycloheximide.
      הערה: זו הגדרת השליטה לתחבורה אווירית (AIR CON) לתאי bioreporter, מאז mycelia מעוכבת על ידי cycloheximide ולא לגדול יותר MMA.
  5. השתמש דקור פקק 1 סנטימטר לאגרוף החוצה כתמים עגולים של צלחת PDA ריקה. שימוש נוסף דקור פקק 0.5 סנטימטר לחתוך את האמצע של התיקון הראשון. הנח את כף יד-הטבעת הקטנה וכתוצאה מכך במרחק של 1 מ"מ בסמוך למחסום PDA (מחשבי כף יד 1 באיור 1).
  6. הוסף 2 מ"ג של שפעת לתוך החור של מחשב כף יד 1. השתמש דקור פקק 1 סנטימטר לחתוך את תיקוני חוזר מצלחות PDA מגודל עם פ ultimum ולמקם את תיקון אחד (PDA 2 באיור 1) תחתונה כלפי מטה על טבעת PDA כך שמחצלת mycelial עומדת בפני גבישי השפעת.
    1. חזור על השלב הקודם מבלי להוסיף גבישי שפעת.
      הערה: זו הגדרת בקרה השלילית (NEG CON) כדי לקבוע רקעהקרינה של תאי bioreporter.
  7. השתמש דקור פקק 1 סנטימטר לאגרוף החוצה כתמים עגולים מאגר המכילים פחם פעיל. הנח ארבעה תיקונים בכל התקנת מיקרוקוסמוס כדי להקטין את ריכוז שפעת הגזים (איור 1) נוסף.
  8. הכן בקרה חיובית (POS CON). הוסף כמה גבישי שפעת 200 μl של השעיה תא MMA ולשים אותו בחלל אחד שקופית ריקה.
  9. מניחים צלחת פטרי (ד = 10 סנטימטרים) עם קצת אבקה של פחם פעיל בחלק התחתון של תא הדגירה כדי למזער ריכוז שפעת גזים בתא. כמו כן, מקום 04:56 50 כוסות מיליליטר עם מים סטריליים בתחתית כדי לשמור על לחות גבוהה בחדר.
    1. העבר את הגדרות מיקרוקוסמוס לתאי דגירה דגירה של 25 מעלות צלזיוס למשך 96 שעות. דגימות מקום באופן אקראי בתאי הגידול השונים שלא לכלול השפעות מיקום.
      הערה: AP זמן דגירה זהplies לפ oomycete ultimum. זה יכול להיות שונה עבור אורגניזמים אחרים.

4. Confocal סריקת לייזר מיקרוסקופית

  1. באופן אידיאלי להשתמש התקנת CLSM עם מיקרוסקופ הזקוף.
    הערה: ייתכן שיהיה מצויד בלמשל הצעת לייזרים קונבנציונליים, 488, 561 וקווי 633 nm לעירור או עם מקור לייזר לבן מתכונן.
  2. השתמש בהגדרות הבאות לאוסף של תמונות: עירור: 490 ננומטר (eGFP) ו585 ננומטר (mCherry) בעוצמת הלייזר המתאימה (עירור סימולטני); טווחי פליטה: 500-550 ננומטר (eGFP) ו605-650 ננומטר (mCherry); עדשה אובייקטיבית: immersible 63X NA 0.9 מים (בשל מרחק העבודה הארוך שלה); גודל צעד לZ- ערימות: 0.5 מיקרומטר.
  3. התקנת מיקרוקוסמוס פתוחה ולהשתמש באזמל כדי להסיר 1 PDA, 2, 3 ומחסום PDA. שים להחליק את מכסה זכוכית על גבי MMA ולחץ אותו בעדינות כדי להסיר בועות אוויר. שקופית הר על הבמה מיקרוסקופ. להוסיף טיפה של מים על גבי התלוש דואר כיסוי ולהשתמש בהגדרות mCherry למצוא תאי bioreporter במדגם.
  4. קבל סקירה מהירה של המדגם ולייעל את יחס אות לרעש באמצעות ערוץ זוהר-על מתחת לשולחן בדיקה לאדומה (mCherry) וירוק (eGFP). בחר מיקום אקראי במדגם לנתח הקרינה bioreporter.
    הערה: העובש עשוי להראות autofluorescence בטווח של פליטת bioreporter (למשל, autofluorescence הירוק) 17. הקפד לבחור אזורים ללא העובש אם זה המקרה.
  5. להגדיר ולהקליט Z- ערימות לכל תפקיד בירוק (eGFP) והאדום ערוץ (mCherry). למנוע הלבנה של המדגם על ידי חשיפה ארוכה לepifluorescence אור או אור הלייזר.
    1. חזור על שלב קודם לעשר עמדות אקראיות, תחולקנה באופן שווה.
  6. חזור על כל השלבים באמצעות אותן ההגדרות עבור כל הדגימות של מסלול המבחן (SAM), AIR CON, נג CON וPOS CON.

ניתוח 5. תמונה

הערה: כדי לנתח אדומה (mCherry) וירוק הקרינה (eGFP) בZ- ערימות נרשמו, בין אפשרויות אחרות ImageJ התוכנה החופשי 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) יכול להיות בשימוש.

  1. הקפד להתקין את תוסף logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
  2. קובץ פתוח בImageJ. בחר "ערוצים לפצל" וערוץ ירוק קרוב. השתמש ב'אזור mCherry 'מאקרו מסופק כקובץ קוד משלים לכמת אזור של הקרינה אדומה בZ- מחסנית. התאם את הגדרות המועדפות במאקרו (מסומן באותיות מודגשות).
    1. פלט הוא שולחן עם פיקסלים שנמדדו מעל הסף (ומעל לגודל המינימאלי המוגדר) בערימת Z-.
      הערה: הסכום של כל הערכים הוא המספר הכולל של פיקסלים אדומים (אזור) בערימה.
  3. קובץ פתוח בImageJ. בחר "ערוצים לפצל" וערוץ אדום קרוב. השתמש במאקרו 216; int eGFP 'מסופק כקובץ קוד משלים לכמת עוצמת הקרינה ירוקה בערימת Z-. התאם את הגדרות המועדפות במאקרו (מסומן באותיות מודגשות).
    1. פלט הוא שולחן עם העוצמות והאזור הממוצעים של כל האובייקטים הירוקים מעל הסף (ומעל לגודל המינימאלי המוגדר) בZ- מחסנית. כדי לחשב את עוצמת הכוללת של פיקסלים ירוקים בערימה, להכפיל כל משמעות עוצמתם בשטח המקביל.
  4. לחשב את האינדוקציה היחסית eGFP (rel eGFP):
    figure-protocol-1 (1)
    הערה: מאחר mCherry בא לידי ביטוי constitutively, הערך כתוצאה של rel eGFP הוא מדד יחסי לסכום של eGFP בא לידי ביטוי בכמות מסוימת של תאים. אנא להתייחס גם לטבלה 3 לקבלת מידע נוספת על חישוב rel eGFP.
"> 6. כימות כימית tle

הערה: גם setups מיקרוקוסמוס ניתן להשתמש כדי לבצע כימות כימיות של כמויות שפעת translocated עם או בלי כיור מזהם א-ביוטי.

  1. לעטוף 15 בקבוקוני מיליליטר זכוכית, GC מיליליטר 1 בקבוקונים / MS ומוסיף ברדיד אלומיניום. מלא מתאדה מנות עם Na 2 SO 4; למקם את כל בתנורי מופל במשך 5 שעות ב 450 מעלות צלזיוס כדי להסיר זיהומים אפשריים. אחסן בתוך Na 2 SO 4 של ייבוש הופעל.
  2. חותך סיבי זכוכית מצופה PDMS לאורך סנטימטר 0.5. לשטוף סיבים ידי ניעור ארבע פעמים שעה 2 במתנול הטרי. חזור על השלבים כביסה עוד ארבע פעמים עם מים ultrapure וסיבים נקיים חנות במי ultrapure בבקבוקון זכוכית אטומה.
  3. הכן 1.5 L של טולואן / אצטון (3: 1, v / v) L 10 מיקרוגרם מכיל -1 phenanthrene-ד 10.
  4. בצע את השלבים 1, 2 ו -3 לפרוטוקול. הכן מיקרוקוסמוס ללא ביאורתאי eporter ללמוד תחבורת שפעת (SAM (-) וAIR CON (-)) ועם תאי bioreporter (SAM) כדי לוודא השפלה שפעת.
    1. אופציונאלי (ללא תאי bioreporter): שלושה PDMS מקום מצופה סיבי זכוכית (בדרך כלל משמש לניסויי SPME) ככיור מזהם מלאכותי וכמותיים בתוך MMA של SAM (-) באמצעות מלקחיים בסדר.
    2. הסר סיבי זכוכית באמצעות מלקחיים עדינים ולהעביר כל אחד לתוך בקבוקון / MS GC עם הוספה.
    3. הוסף 200 μl של טולואן ולנער אנכי O / N ולנתח באמצעות GC / MS. השתמש בהגדרות הניתנות בטבלה 2.
  5. העבר את MMA מחלל האמצע לתוך בקבוקון זכוכית 15 מ"ל ולהוסיף על שלוש מריות של Na 2 SO 4. מערבבים בעזרת מרית ביסודיות ולהוסיף 10 מיליליטר של ממס. מערבולת את התערובת ולנער אופקי O / N בחושך.
    1. העברה 1001; l מדגם לתוך בקבוקון GC / MS עם הוספה. הוסף 10 μl של acenaphthylene-ד 08 (-1 L 10 מ"ג) ולנתח באמצעות GC / MS באמצעות אותה התכנית כפי שמתואר ב6.4.3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות שהוצגו כאן כבר פורסמה קודם לכן 15. נא עיין במאמר לדיון מכניסטית וסביבתי מפורט.

לאחר הקלטת תמונה באמצעות CLSM, הקרנת עוצמה מקסימלית ניתן לבצע באמצעות תוכנת מיקרוסקופ המתאימה או ImageJ כדי לקבל רושם ראשוני חזותי של המדגם וקבוצת הביקורת (איור 2). מאוחר יותר, ערכות נתונים עשויים להיות מוקרנות באופן שונה כדי להראות תכונות משמעותיות על ידי תוכנת הדמיה ספציפית. הבקרה החיובית <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התקנת מיקרוקוסמוס הציגה הוכיחה מתאימה ללמוד את הזמינות הביולוגית של כימיקלים מופרדים מרחבית למשפילה אורגניזמים לאחר הספיגה והובלה בmycelia. תחבורת גז שלב פוטנציאלית של תרכובות נדיפות באופן חלקי מנוע ויכול להיות דמיינו תאי bioreporter חיידקים ללא הכנת מדגם משוכללת ובכך עם הפרעה מינימאלית של המערכת רגישה. באותו הזמן, אנליזה כימית של המדגם יכולה להתנהל בקלות ומאפשרת לשליטה טובה של התוצאות שנרכשו ולכימות של התחבורה הכוללת. עם זאת, כמה נקודות צריכים לשקול בזהירות לפני ותוך כדי ביצוע הנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

מימון על ידי הקרן הגרמנית לאיכות הסביבה (DBU) מוכר. המחברים מודים ל-Ute Kuhlicke על העזרה הטכנית בניתוח CLSM ול-Birgit Würz, Rita Remer ו-Jana Reichenbach על עזרה ניסויית מיומנת. המחברים רוצים להודות במיוחד לפרופ' יאן רולוף ואן דר מיר ולד"ר רובין טקון על הדיון הפורה ועל מתן זן הביו-ריפורט. הוא תורם לתוכנית המחקר 'כימיקלים בסביבה' (CITE) של אגודת הלמהולץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ קונפוקליLeicaTCS SP5X, LAS AF - גרסה 2.6.1; או שווה ערך CLSM
GC HP 7890 Series GC ו- Agilent 5975C MSDAgilentניתן להשתמש ב- GC/MS שווה ערך
בעמודה נימית GC J& רוחב 121-5522                         Agilent
Cork BorerFisher Scientific12863952או כל כיסוי אחר
מחליקMarienfeld107222ביצועים גבוהים, מס' 1.5H
GC/MS instertsWICOMWIC 47080
GC/MS בקבוקונים 2 מ"לWICOMWIC 41150
מכסים / מחיצה לבקבוקוני מכסה בורגDIONEX49463 / 049464 
מכסים לבקבוקוני GC/MSWICOMWIC 43948/B
שקופיות אובייקטיביותMenzelסיבי
זכוכית מצופים PDMS רגילים PolymicroTechnologies, Inc.V (PDMS) = 13.55  ±   0.02  ומיקרו; l  m-1
Petri כלים קטנים / גדוליםגריינר633-102 / 628-102
בקבוקוני פקק בורג 40 מ"לDIONEX48783ניתן להשתמש בבקבוקוני זכוכית אחרים
בקבוקוני פקק בורג 60 מ"לDIONEX48784ניתן להשתמש בבקבוקוני זכוכית אחרים
Acenaphthylene d08Dr. EhrenstorferC 20510100
אצטוןקארל רוט9372.2
פחם פעילסיגמא-אולדריץ'242276-1 ק"ג
אגרוזקארל רוט2267.4
פלואורןפלוקה46880
קנמיצין סולפטקארל רוטT832.250 מ"ג L-1
מתנולקארל רוטP7171
<חזק>בינוני מינימלי: 100 מ"ל <חזק>תמיסה 1 + 25 מ"ל <חזק>תמיסה 2 + 5 מ"ל <חזק>תמיסה 3 ad. 1,000 מ"ל aqua dest
<חזק>תמיסה 1
אמוניום גופרתיקארל רוט3746.15 גרם L-1 
מגנזיום כלוריד x 6  H2OCarl Roth2189.11 גרם L-1
סידן חנקתי x 4  H2OCarl RothP740.10.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphateCarlRoth P030.155.83 g L-1Monopotassium
phosphateCarl Roth3904.120 גרם L-1
<חזק>תמיסה 3 (pH 6.0)
דיסודיום EDTAMERCK10841802500.8 גרם L-1
Iron(II) כלוריד x 4  H2OMERCK10386102500.3 גרם L-1
Cobalt(II) כלוריד x 6  H2OCarl RothT889.34 מ"ג L-1
Manganese(II) כלוריד x 1  H2OCarl Roth4320.210 מ"ג L-1
Copper(II) סולפטCarl RothP023.11 מ"ג L-1
נתרן מוליבדט x 2  H2OCarl Roth0274.13 מ"ג L-1
Zinc chlorideMERCK10881602502 מ"ג L-1
ליתיום כלורידCarl RothP007.10.5 מ"ג L-1
Tin(II) כלוריד x 2  H2OCarl Roth4473.10.5 מ"ג L-1
חומצה בוריתRiedel-de-Haen                         1,16061 מ"ג L-1
אשלגן ברומידקרל רותA137.12 מ"ג L-1
אשלגן יודידקארל רות'6750.12 מ"ג L-1
בריום כלורידקארל רות4453.10.5 מ"ג L-1
MMAמינימלי בינוני + אגרוז 0.2%
פננתרן d10Dr. EhrenstorferC 20920100
<חזק>אגר דקסטרוז תפוחי אדמה: 24 גרם L-1 מרק + בקטו-אגר 1.5%; pH 6.8
מרק דקסטרוז תפוחי אדמהDifco / בקטון דיקינסון254920
בקטו-אגרDifco / בקטון דיקינסון214040
נתרן אצטט x 3 הידרו.קארל רוט6779.1
נתרן גופרתיMERCK1066495000
טולואןMERCK1083252500
<חזק>mTY בינוני: 3 גרם  L-1 תמצית שמרים, 5  ז  L-1 בקטו טריפטון ותמצית שמרי NaCl 50 מ"מ
Merck1037530500
TryptoneServa4864702
נתרן כלוריCarl Roth3957.1
ImageJ עם תוסףhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ו-http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum זן 67-1התקבל ממעבדתו של ד"ר כריסטוף קיל; המחלקה למיקרוביולוגיה בסיסית, אוניברסיטת לוזאן, שוויץ
Burkholderia sartisoli RP037-mCheהתקבל ממעבדתו של פרופ' יאן רולוף ואן דר מיר; המחלקה למיקרוביולוגיה בסיסית, אוניברסיטת לוזאן, שוויץ
' ' logi tool

מקורות

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת ביו-רפורטרמיקרוסקופיית סריקה בלייזר קונפוקליתהובלה ברשת מיצלייםBurkholderia sartisoliPythium ultimumזמינות ביולוגית של פלואורןניתוח ביטוי EGFPהערכת הובלת מזהמיםתוכנה לניתוח תמונות
גישת Bioreporter תא כל להערכת תחבורה וזמינות ביולוגית של מזהמים אורגניים במערכות לא רוויים מים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.