Assay bioreporter התא שלם עם sartisoli Burkholderia RP037-mChe פותח כדי לזהות שברים של מזהמים אורגניים (כלומר, fluorene) זמינים לשפלת חיידקים לאחר תחבורה פעילה על ידי mycelia גישור נקבוביות אוויר מלא במערכת מודל בלתי רוויה מים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישת Bioreporter תא כל להערכת תחבורה וזמינות ביולוגית של מזהמים אורגניים במערכות לא רוויים מים
במאמר זה
סיכום
תקציר
זמינות ביולוגית של מזהמים היא תנאי מוקדם לפירוק הביולוגי היעיל שלהם באדמה. עם זאת, הריכוז הממוצע בתפזורת של מזהם אינו מדד מתאים לזמינותו; הזמינות הביולוגית תלויה במקום זאת באינטראקציה הדינמית של העברת מסה פוטנציאלית (שטף) של תרכובת לתא מיקרוביאלי וביכולתו של האחרון לפרק את התרכובת. בחלקים בלתי רוויים של האדמה, הוכח כי תפטיר מתגבר על מגבלות הזמינות הביולוגית על ידי הובלה וניוד פעיל של תרכובות אורגניות בטווח של סנטימטרים. בעוד שניתן לכמת בקלות את היקף ההובלה המבוססת על תפטירים באמצעים כימיים, אימות הזמינות הביולוגית המזהמת לתאי חיידקים דורש שיטה ביולוגית. בהתמודדות עם אילוץ זה, בחרנו בפלואורן PAH (FLU) כתרכובת מודל ופיתחנו מיקרוקוסמוס מודל בלתי רווי של מים המקשר בין מקור נקודת שפעת מופרד מרחבית לבין חיידק הביו-מדווח המשפיל FLU Burkholderia sartisoli RP037-mChe על ידי רשת תפטירים של Pythium ultimum. מכיוון שהביו-ריפורטר מבטא eGFP בתגובה לשטף ה-PAH לתא, ניתן לנטר חשיפה ופירוק של שפעת חיידקית ישירות במיקרוקוסמוס באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). ניתוחי CLSM ותמונות חשפו עלייה משמעותית בביטוי eGFP בנוכחות P. ultimum בהשוואה לבקרות ללא תפטיר או שפעת, ובכך הצביעו על זמינות ביולוגית של שפעת לחיידקים לאחר הובלה בתיווך תפטיר. תוצאות CLSM נתמכו על ידי אנליזות כימיות במיקרוקוסמוס זהה. המיקרוקוסמוס שפותח הוכיח את עצמו כמתאים לחקירת זמינות ביולוגית של מזהמים ולדמיין במקביל את האינטראקציות המעורבות בין חיידקים לתפטירים.
מבוא
אדמה מאוכלסת בצפיפות על ידי מגוון רחב של מיקרואורגניזמים 1,2 כגון חיידקים. עם זאת, תנאים בבית גידול זה הם מאתגרים, במיוחד במונחים של מים זמינות 3. חיידקים זקוקים באופן קבוע כדי לחפש תנאים אופטימליים בסביבות הטרוגניות 4, אבל היעדר סרטי מים רציפים וכתוצאה מכך הניידות הוגבלה 5 מעכב אותם כדי להפיץ באופן חופשי. כמו כן, שיעורי דיפוזיה של מומסים (למשל, חומרים מזינים) הם הורידו בתנאים בלתי רוויים 6. לפיכך, חיידקים וחומרים מזינים לעתים קרובות מופרדים פיזי ונגישות תזונתית מוגבלת 3. כתוצאה מכך, וקטור תחבורה לתרכובות כימיות שאינו דורש מים שלב רציף יכול לעזור להתגבר ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מנות, צ'יימברס שקופיות והדגירה
- הכן את החומר הבא לכל מיקרוקוסמוס: פלסטיק אחד גדול תחתון פטרי צלחת (ד = 10 סנטימטרים), אחד שונה (ראה שלב 1.2) פלסטיק קטן תחתון פטרי צלחת (d = 5 סנטימטרים) עם מכסים והחלק תא ספירה אחת עם שלושה חללים.
- קח את המספר הרצוי של חלקים תחתון צלחת פטרי (d = 5 סנטימטרים). הסר חלק מגדותיו עם מסור כדי שיתאים לשקופית (אורך קצה 26 מ"מ) בדיוק. כדי לעקר את המערכת, לספוג תחתית צלחת פטרי ומכסים ב -70% אתנול O / N ולייבש אותם לפחות שעה 2 בזרימה ממשלה תחת UV-אור. אחסן א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות שהוצגו כאן כבר פורסמה קודם לכן 15. נא עיין במאמר לדיון מכניסטית וסביבתי מפורט.
לאחר הקלטת תמונה באמצעות CLSM, הקרנת עוצמה מקסימלית ניתן לבצע באמצעות תוכנת מיקרוסקופ המתאימה או ImageJ כדי לקבל רושם ראשוני חזותי של המדגם וקבוצת הביקורת (איור 2). מאוחר יותר, ערכות נתונים עשויים להיות מוקרנות באופן שונה כדי להראות תכונות משמעותיות על ידי תוכנת הדמיה ספציפית. הבקרה החיובית <.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התקנת מיקרוקוסמוס הציגה הוכיחה מתאימה ללמוד את הזמינות הביולוגית של כימיקלים מופרדים מרחבית למשפילה אורגניזמים לאחר הספיגה והובלה בmycelia. תחבורת גז שלב פוטנציאלית של תרכובות נדיפות באופן חלקי מנוע ויכול להיות דמיינו תאי bioreporter חיידקים ללא הכנת מדגם משוכללת ובכך עם הפרעה מינימאלית של המערכת רגישה. באותו הזמן, אנליזה כימית של המדגם יכולה להתנהל בקלות ומאפשרת לשליטה טובה של התוצאות שנרכשו ולכימות של התחבורה הכוללת. עם זאת, כמה נקודות צריכים לשקול בזהירות לפני ותוך כדי ביצוע הנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.
תודות
מימון על ידי הקרן הגרמנית לאיכות הסביבה (DBU) מוכר. המחברים מודים ל-Ute Kuhlicke על העזרה הטכנית בניתוח CLSM ול-Birgit Würz, Rita Remer ו-Jana Reichenbach על עזרה ניסויית מיומנת. המחברים רוצים להודות במיוחד לפרופ' יאן רולוף ואן דר מיר ולד"ר רובין טקון על הדיון הפורה ועל מתן זן הביו-ריפורט. הוא תורם לתוכנית המחקר 'כימיקלים בסביבה' (CITE) של אגודת הלמהולץ.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Leica | TCS SP5X, LAS AF - גרסה 2.6.1; או שווה ערך CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC ו- Agilent 5975C MSD | Agilent | ניתן להשתמש ב- GC/MS שווה ערך | |
| בעמודה נימית GC J& רוחב 121-5522 | Agilent | ||
| Cork Borer | Fisher Scientific | 12863952 | או כל כיסוי אחר |
| מחליק | Marienfeld | 107222 | ביצועים גבוהים, מס' 1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS בקבוקונים 2 מ"ל | WICOM | WIC 41150 | |
| מכסים / מחיצה לבקבוקוני מכסה בורג | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| מכסים לבקבוקוני GC/MS | WICOM | WIC 43948/B | |
| שקופיות אובייקטיביות | Menzel | סיבי | |
| זכוכית מצופים PDMS רגילים Polymicro | Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 ומיקרו; l m-1 | |
| Petri כלים קטנים / גדולים | גריינר | 633-102 / 628-102 | |
| בקבוקוני פקק בורג 40 מ"ל | DIONEX | 48783 | ניתן להשתמש בבקבוקוני זכוכית אחרים |
| בקבוקוני פקק בורג 60 מ"ל | DIONEX | 48784 | ניתן להשתמש בבקבוקוני זכוכית אחרים |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| אצטון | קארל רוט | 9372.2 | |
| פחם פעיל | סיגמא-אולדריץ' | 242276-1 ק"ג | |
| אגרוז | קארל רוט | 2267.4 | |
| פלואורן | פלוקה | 46880 | |
| קנמיצין סולפט | קארל רוט | T832.2 | 50 מ"ג L-1 |
| מתנול | קארל רוט | P7171 | |
| <חזק>בינוני מינימלי: 100 מ"ל <חזק>תמיסה 1 + 25 מ"ל <חזק>תמיסה 2 + 5 מ"ל <חזק>תמיסה 3 ad. 1,000 מ"ל aqua dest | |||
| <חזק>תמיסה 1 | |||
| אמוניום גופרתי | קארל רוט | 3746.1 | 5 גרם L-1 |
| מגנזיום כלוריד x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 גרם L-1 |
| סידן חנקתי x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl | Roth P030.1 | 55.83 g L-1Monopotassium |
| phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 גרם L-1 |
| <חזק>תמיסה 3 (pH 6.0) | |||
| דיסודיום EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 גרם L-1 |
| Iron(II) כלוריד x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 גרם L-1 |
| Cobalt(II) כלוריד x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 מ"ג L-1 |
| Manganese(II) כלוריד x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 מ"ג L-1 |
| Copper(II) סולפט | Carl Roth | P023.1 | 1 מ"ג L-1 |
| נתרן מוליבדט x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 מ"ג L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 מ"ג L-1 |
| ליתיום כלוריד | Carl Roth | P007.1 | 0.5 מ"ג L-1 |
| Tin(II) כלוריד x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 מ"ג L-1 |
| חומצה בורית | Riedel-de-Haen | 1,1606 | 1 מ"ג L-1 |
| אשלגן ברומיד | קרל רות | A137.1 | 2 מ"ג L-1 |
| אשלגן יודיד | קארל רות' | 6750.1 | 2 מ"ג L-1 |
| בריום כלוריד | קארל רות | 4453.1 | 0.5 מ"ג L-1 |
| MMA | מינימלי בינוני + אגרוז 0.2% | ||
| פננתרן d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| <חזק>אגר דקסטרוז תפוחי אדמה: 24 גרם L-1 מרק + בקטו-אגר 1.5%; pH 6.8 | |||
| מרק דקסטרוז תפוחי אדמה | Difco / בקטון דיקינסון | 254920 | |
| בקטו-אגר | Difco / בקטון דיקינסון | 214040 | |
| נתרן אצטט x 3 הידרו. | קארל רוט | 6779.1 | |
| נתרן גופרתי | MERCK | 1066495000 | |
| טולואן | MERCK | 1083252500 | |
| <חזק>mTY בינוני: 3 גרם L-1 תמצית שמרים, 5 ז L-1 בקטו טריפטון ותמצית שמרי NaCl 50 מ"מ | |||
| Merck | 1037530500 | ||
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| נתרן כלורי | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ עם תוסף | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ו-http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum זן 67-1 | התקבל ממעבדתו של ד"ר כריסטוף קיל; המחלקה למיקרוביולוגיה בסיסית, אוניברסיטת לוזאן, שוויץ | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | התקבל ממעבדתו של פרופ' יאן רולוף ואן דר מיר; המחלקה למיקרוביולוגיה בסיסית, אוניברסיטת לוזאן, שוויץ |
מקורות
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
