ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

המיטוכונדריה הם אתרי ייצור האנרגיה העיקריים בתא ויש לי תפקידים חשובים בהזדקנות, כמו גם גיל הקשורות בהפרעות שונות כמו מחלות לב וכלי דם, מחלת אלצהיימר, סוכרת, סרטן, השמנת יתר ו. פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת מספק ניתוח ישיר של שרשרת הובלת אלקטרונים פונקציה (ETC) ותרם באופן משמעותי להבנת ביולוגיה של המיטוכונדריה שלנו ותפקידה בבריאות ובחוליים. מיטוכונדריה המבודדת משמשות ללמוד היבטים שונים של יו-אנרגיה כמו, תחבורת מצע, פעילות synthase ATP, דליפת פרוטון, וכו 'המתודולוגיה שתוארה בכתב היד הזה כבר מותאמת כדי לאפשר ניתוח respirometric של מיטוכונדריה מבודדת מביופסיות רקמות שריר שלד התקבלו מבני אדם. פרוטוקול הביופסיה שתואר בכתב היד הזה נוצל על ידי צוות שלנו במשך 12 השנים האחרונות. הקבוצה שלנו ביצעה מעל 700 נהלים במבוגרים בגילים שונים,עד 90 שנים ישנות, ועם תנאי מחלה כרוניים שונים ללא כל בעיות בטיחות שליליות. היבט מרכזי של פרוטוקול זה הוא שזה תוכנן במיוחד כדי לנצל את הכמויות מינימליות של רקמה, ובכך להקל על השימוש בה במחקרים קליניים.

פרוטוקולים שונים פותחו לבידוד המיטוכונדריה. פרננדז-Vizarra et al. ^1,2 תאר שיטה לבידוד המיטוכונדריה מרקמות עכברוש שונות, כמו גם תאים בתרבית. גרסיה-Cazarin et al. ³ דיווח שיטה לבידוד המיטוכונדריה משרירי שלד מחולדה ועכבר. שיטה לבידוד המיטוכונדריה ממוח חולדה כבר דווח על ידי איגלסיאס-גונזלס et al. ⁴ גרוס, et al. ⁵ דיווחו שיטה של בידוד המיטוכונדריה באמצעות barocycler ו / או מגרסת PCT. לאחרונה, פרנקו ואח '. ⁶ דווח שיטה של בידוד המיטוכונדריה מועשר באמצעות אנטי-TOM22 חרוזים מגנטיים.

בעוד הפרוטוקולים הללו להניב תוצאות מצוינות, דרישות גודל רקמה הן גבוהות בהשוואה לשיטה שתוארה בכתב היד הזה. לדוגמא, גרוס et al. ⁵ השתמש 1.5-1.8 גרם של שריר הגסטרוקנמיוס, וכ -2 גרם של רקמת הכליה. באופן דומה, פרנקו ואח '. ⁶ משמש 500 רקמת כבד עכבר מ"ג. מניסיוננו, תשואות אופייניות צפויות מביופסיה מחט percutaneous של שרירי שלד (lateralis vastus) נעות 100-200 מ"ג. היכולת להעריך את התפקוד המיטוכונדריה 20-50 מ"ג של רקמת שריר באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן מאפשרת למשתמשים לבצע הערכות מרובות לביופסיה ודגימות חנות לשימוש עתידי בניסויי ביולוגיה מולקולריים אחרים. זוהי תכונה קריטית במחקר קליני ומחקרים אחרים הדורשים שימוש חרוץ של דגימות. יש לציין כי בעבר המיטוכונדריה קפוא לא טובה ללימוד נשימה בשילוב בשל outer נזק קרום המיטוכונדריה ואובדן פעילות ציטוכרום C. השיטה שלנו הותאמה ושונה מהשיטה שפורסמה על ידי צ'פל ופרי ^7.

שימוש בשיטות שתוארו בכתב היד הזה, יש לנו לאחרונה דווח כי פרופיל respirometric של מיטוכונדריה מבודדת מvastus אדם lateralis מתואם ישירות עם יכולת פיזית, נמדדה כמהירות הליכה ^8.

הערה: הפרוטוקול המתואר אושר על ידי מועצת המנהלים מוסדי הסקירה של בית הספר ווייק פורסט לרפואה. הסכמה מדעת הושגה בכתב. כל המשתתפים היו מבוגרים בריאים מבוגרים (65-79 שנים) משני המינים, עם BMI שנע 23-35.

1. ביופסיה של שריר שלד

1. כפי שתואר לעיל, ⁹ לבצע את כל הביופסיות בשעתי הבוקר המוקדמות לאחר O / N מהיר. שאל את הנושאים להימנע מנטילת אספירין, מרשם ותרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידים מעבר לדלפק, או תרכובות אחרות שעשויים להשפיע על דימום, טסיות דם, או שטפי דם בשבוע שלפני הביופסיה. שאל את המשתתפים להימנע גם מכל פעילות מאומצת במשך לפחות 36 שעות לפני הביופסיה.
   הערה: שריר מתקבל מvastus lateralis באמצעות טכניקת ביופסית מחט percutaneous עם מחט מלעורית בהרדמה מקומית עם לידוקאין 1%. אין סיבוכים רפואיים או oיס דיווח על תופעות לוואי מהתהליך שהתרחשו ביחידת המחקר הקלינית שלנו.
2. הערה: הליך הביופסיה תאר מותאמת מזה של Bergstrom ^10.
   1. בקצרה, באופן מקומי לנהל בלטפל ידוקאין 1% לא לחדור לשריר. בצע את זה עם תקופת ההמתנה 10 דקות כדי לאפשר אלחוש מספיק.
   2. קח את הביופסיות מהבטן של השריר (אזור אמצע השריר בין ההכנסה ומוצא) הימנעות אזורי subfascial וmyotendonous.
      1. השתמש במחט מלעורית (מכשיר לשימוש חוזר יניקה סייעה בצד חיתוך חלון וגליל חיתוך פנימי) ומעקב "פופ" fascial או התנגדות של fascia כמדריך.
      2. לאמוד את העומק עם מחט ההרדמה, ואז שוב מרגיש את זה עם להב סכין המנתחים הצר ולעשות חתך 4-5 מ"מ דרך fascia. לקדם את המחט דרך החתך עד שמוכנס לתוך השריר.
      3. אסוףדגימות מרובות עם החלון פנו לכיוונים שונים. החל יניקה רציפה באמצעות מזרק 60 סמ"ק תוך קידום ונסיגת דגימות שריר לתוך מחט percutaneous 03:58 פעמים בכיוונים שונים. להפסיק את השאיבה ולהסיר את המחט.
         הערה: כל מעבר (הכנסה והוצאה של מחט) לא צריכה לקחת פחות מדקה.
      4. יש לך עוזר להפעיל לחץ משרד לנקב אתר במשך 5 דקות כדי להקים עצירת דימום. נתק מחט מצינור יניקה ולהסיר בזהירות דגימות שריר מהחלון והחבית.
   3. הפוך לעבור שני אם יש צורך יותר שרירים על ידי חזרה על ההליך לעיל.
   4. הסר את כל קרישי דם גלויים ממדגם השרירים באמצעות מלקחיים, לשקול את המדגם, ואת המקום באופן מיידי בצינור המכיל DPBS קר כקרח.
      הערה: התשואה הממוצעת באמצעות מתודולוגיה זו היא 150 ± 20 מ"ג.

2. בידוד מיטוכונדריאלי

3. כביסה המיטוכונדריה

1. צנטריפוגה supernatant מהצעד מעל גיל 10, 000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להשעות את גלולה ב 4 מיליליטר של חיץ CP II ו צנטריפוגות נוספת ב10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: במקרים נדירים, גלולה דקה של דם נוצר מתחת לגלולה של המיטוכונדריה. במקרה זה, להסיר את גלולה המיטוכונדריה על ידי שאיפה עדינה עם חיץ CPII. ניתן להימנע בשלב זה על ידי שטיפה יסודית דם בשלב 2.
2. להשעות את גלולה שהתקבלה ב2ml שלי CP חיץ. בשלב זה להשתמש aliquot קטן מהשעיה זו להערכת חלבון. Resuspend המדגם שנותר בCP אני חיץ צנטריפוגות כאמור לעיל. להשעות את גלולה הסופית בסכום מינימאלי (200 μl) של מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS).
   הערה: חלבון assayed בשלב זה כי אני CP חיץ אין BSA, ואילו MAS בי הדגימות תהיה מאוחר יותר הופסקה אין לי BSA בזה.

4. הערכת תוכן מיטוכונדריאלי על ידי מדידת ריכוז חלבון באמצעות ערכת assay חלבון BCA

class = "jove_content"> הערה: השתמש ריכוז זה כדי לחשב את כמות המיטוכונדריה המשמשת לטעינה על microplate 24 גם למדידות respirometric, או לניסויי כתם מערביים. קח בחשבון את הגורם לדילול (10) לחישוב ריכוז החלבון.

5. בצעו את מבחני XF כפי שתואר על ידי רוג'רס, GW, et al. ¹²

הערה: דמיין את צריכת שיעור O ₂ (OCR) בpmoles O ₂ / min, או רמות מוחלטות של O ₂ ו- pH בפלט נתונים.

1. השתמש 1x MAS להכין תרכובות להיות מוזרק. הוסף ריכוז 10x של התרכובות לספירה היציאות לתת ריכוז סופי כדלקמן: נמל, ADP ['אדנוזין 5 -diphosphate, 2 מ"מ, 50 μl]; היציאה B, oligomycin (2 מיקרומטר, 55 μl); הנמל C, FCCP [4 phenylhydrazone קרבוניל ציאניד (trifluoromethoxy), 6 מיקרומטר, 60 μl]; והיציאה D, 2 מיקרומטר antimycin-A (65 μl). הכןנפח מספיק של תרכובות למספר הנדרש של בארות.
2. לקבוע את הכמות האופטימלית של המיטוכונדריה על ידי טיטרציה. לדוגמא, עומס 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה בכל טוב ב-50 μl נפח של MAS 1x קר כקרח המכיל מצע. כדי למזער את השונות בין בארות, לדלל 10x המיטוכונדריה ראשון במצע 1x MAS + קר. בשלב הבא, לספק 50 μl של השעיה זו היטב כל אחד (מלבד בארות תיקון רקע).
3. צנטריפוגה הצלחת XG ב 2000, 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, בעדינות להוסיף 450 μl של succinate 1x MAS + (10 מ"מ) וrotenone (2 מיקרומטר) (תנאים ראשוניים; ראה להלן) זה טוב. הצג את המיטוכונדריה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח עמידה הומוגני וללפני העברת הצלחת למנתח XF.
   הערה: תנאים הראשוניים המשמשים יהיה תלוי אם הנשימה היא מונעת על ידי שני המורכבים ETC או מורכב II. לנשימה מונחה השנייה מורכבת, להשתמש succinate (10 מ"מ) וrotenone (2 מיקרומטר) כתנאים ראשוניים. בלוקים Rotenone אני וsuccinate המורכבים מספק דלק למורכב II (dehydrogenase succinate). ללמוד נשימה מונעת על ידי מורכב, השתמש באחת פירובט וmalate, כל בריכוז סופי של 5 מ"מ או גלוטמט וmalate כל בריכוז סופי של 10 מ"מ כתנאים ראשוניים. האחרון יכול לסייע בהבחנה בין תפקוד לקוי של מעגל חומצת tricarboxylic ותחבורה מצע. ללמוד נשימה מונעת על ידי גם אני וגם מורכב השני מורכבים, כולל פירובט וsuccinate ללא rotenone או malate כתנאים ראשוניים. השתמש קרניטין palmitoyl כמצע לβ-חמצון.
4. רצף למדוד את הנשימה המיטוכונדריאלי בזמן אמת באמצעות respirometer ידי תכנות כפי שתואר קודם לכן ^12. השתמש בהגדרות לrespirometer ניתן בטבלה 2.
   הערה: הסבר קצר על מדינות נשימה המיטוכונדריאלי שונות הן כדלקמן:
o 4 הנגרמת על ידי oligomycin; 3U מדינה = נשימה כשהתיר מקסימאלי מגורה על ידי FCCP uncoupler; נשימה = נשימה שאינה המיטוכונדריה הנותרת לאחר מורכב עיכוב III על ידי antimycin-. כמו כן יש לציין כי, באורך של מדידת OCR בשילוב עם ריכוז המיטוכונדריה יכול להשפיע על נתונים על ידי המדלל את החמצן בתקופות המדידה.

6. מערבי כתם

הערה: קבע את סמן המיטוכונדריה COX IV וGAPDH רקמה השלם על ידי מערבי סופג כדי להבטיח העשרה של המיטוכונדריה במדגם הסופי

1. הפרד את המיטוכונדריה מבודדת ותמצית רקמה שלמה על ידי ג'לים polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן 12%.
2. העבר את החלבונים על הממברנה פלואוריד polyvinylidene (PVDF).
3. דגירה עם נוגדן COX IV (1: 20,000), ואחריו peroxidase חזרת (HRP) -conjugated נוגדנים משני. לקביעת GAPDH, להפשיט את הכתם ובדיקה עם נוגדנים חד שבטי GAPDH (1: 2,000).
   הערה: אם הבדלים בזיהום ER הם בעלי העניין, כוללת סמני ER כגון ERp72, calnexin, או calreticulin בניתוח.

איור 1 מתאר תרשים זרימה מפורטת של כל הפרוטוקול.

פרופילי כתם מערביים של COX IV / GAPDH (איור 2) מתארים את הביטוי של חלבון המיטוכונדריה, COX IV, והסמן שאינה המיטוכונדריה, GAPDH. ביטוי של שני COX IV וGAPDH ניכרים בכל lysate השריר. לאחר המיטוכונדריה מבודד באמצעות הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה, להקות COX IV עדיין ניכרו תוך GAPDH נעדר באותו החשיפה. חשיפות ארוכות יותר עשויות לחשוף להקת GAPDH קלושה. כתמים אלה מצביעים על כך שיש לי מיטוכונדריה המבודדת זיהום שאינה המיטוכונדריה מינימאלית. יתר על כן, ביטוי COX IV במיטוכונדריה המבודדת הוא עקבי בין דגימות.

איור 3 מראה פרופילים אופייניים respirometric מונעים על ידי מורכב II (succinate וrotenone) באמצעות 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה. כצפוי, OCR הכולל הוא גדל wה- i כמויות גדולים יותר של מיטוכונדריה. היחס מחושב הנשימה השליטה (RCR) assay זה הוא 7.95, מצביע על כך שההכנה של המיטוכונדריה היא באיכות גבוהה. יתר על כן, 3U המדינה OCR הוא מעט גבוה יותר מזה של המדינה 3, המאשר את איכות של המיטוכונדריה.

על מנת להשוות עקביות של תוצאות כאשר פרופיל כמויות שונות של מיטוכונדריה, ביצענו ניתוח שונה (ניתוח שונה) וחישבתי את הסכום של ריבועים (SS) כערכים בפועל של שונות באמצעות 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה נטען ל היטב (איור 4). SS מוצג למדינה 2, 3 מדינה, 3U המדינה, antimycin, וRCR. למדינת 2 ומדינת 3 מדידות, דרך אחד ANOVA היה מובהק סטטיסטי (p <0.01 וp <0.05, בהתאמה). באופן דומה, הדרך אחד ANOVA היה משמעותי מבחינה סטטיסטית לantimycin וRCR (p <0.01 וp <0.0001, בהתאמה. אין הבדל משמעותי ראה 3U המדינה בין קבוצות. Thתוצאות מצביעות על כך שESE 5.0 מיקרוגרם של מיטוכונדריה לכל גם נתן SS הנמוך ביותר בהשוואה לריכוז אחר והוא את הכמות האופטימלית לשימוש במערכת XF 24 עם האוכלוסייה של משתתפים שלנו.

איור 5 משמש כמדריך כדי לציין כיצד ניתן לצפות מדי חלבון המיטוכונדריה מבוסס על גודל מדגם שריר הראשוני. כצפוי יש קשר חזק בין כמות השריר (מ"ג) מעובד והתוכן הכולל של המיטוכונדריה החלבון (מ"ג) של המדגם הסופי.

שולחן פתרון 1. ומתכונים חיץ.

טבלת 2. מערבבים, למדוד, ולערבב הגדרת מחזור לrespirometer.

איור 1. תרשים זרימה של כל הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg "/>
איור 2. כתם מערבי נציג לרקמת שריר שלד כולו, כמו גם מיטוכונדריה מבודדת. תמצית רקמה שלמה, כמו גם מיטוכונדריה מבודדת היו immunoblotted עם נוגדן COX IV כסמן המיטוכונדריה ונוגדן GAPDH לשליטה שאינה במיטוכונדריה. אין להקת GAPDH נצפתה במיטוכונדריה המבודדת המצביעה על זיהום קטן או לא ממקורות שאינן במיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. פרופיל respirometric נציג של מיטוכונדריה מבודדת מvastus אדם lateralis. שלושה ריכוזים של מיטוכונדריה המבודדת, 5.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו1.0 מיקרוגרם מחדש המשמש assay זה. ריכוזים סופיים של תרכובות לאחר זריקות נמל היו 2 מ"מ ADP (יציאה); 2 oligomycin מיקרומטר (יציאה ב '); 6 מיקרומטר FCCP (C נמל); ו -2 מיקרומטר antimycin (D נמל). RCR שחושב לטווח זה היה 7.95. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. הסכום של ריבועים. הסכום של ריבועים למדינות השונות במיטוכונדריה הנשימה וRCR באמצעות 5.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו1.0 מיקרוגרם מיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ig5highres.jpg "/>
איור 5. זה יכול לשמש כמדריך להעריך את כמות חלבון המיטוכונדריה שניתן לצפות על סמך ניתוח רגרסיה שרירים מדגם משקל ההתחלתי:. מהסכום של שריר (מ"ג) ותשואה הכוללת של המיטוכונדריה חלבון (מ"ג). כצפוי, קיים קשר חיובי ישיר בין כמות השריר וחלבון המיטוכונדריה הכוללת שהושג.

המחבר, ג'ורג' רוג'רס, הוא עובד של Seahorse Bioscience המייצרת את המכשיר המשמש במאמר זה. דמי הגישה הפתוחה נתמכו על ידי Seahorse Biosciences.