מאמר שיטה

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl ערוצים ומסועים

DOI:

10.3791/52369

⸱

20 באפריל 2015

 , 
1Department of Anesthesiology, Weill Cornell Medical College, 2Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 3Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטאוליפוזומים משמשים לחקר תעלות מטוהרות וטרנספורטרים שהוקמו מחדש בסביבה ביוכימית מוגדרת היטב. מודגם הליך ניסיוני למדידת פליטה בתיווך חלבונים אלה. מתוארים השלבים להכנת פרוטאוליפוסומים, ביצוע ההקלטות וניתוח נתונים כדי לקבוע כמותית את התכונות הפונקציונליות של החלבון המשוחזר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

15 השנים האחרונות התאפיינו בפיצוץ ביכולת לבטא יתר ולטהר חלבוני ממברנה מאורגניזמים פרוקריוטיים כמו גם מאאוקריוטים. עלייה זו מונעת בעיקר על ידי הדחיפה המוצלחת להשיג מידע מבני על חלבוני הממברנה. עם זאת, היכולת לחקור תפקודית חלבונים אלה לא התקדמה באותו קצב ולעתים קרובות מוגבלת למבחנים איכותיים בעלי ערך כמותי מוגבל, ובכך מגבילה את התובנות המכאניסטיות שהם יכולים לספק. מתוארת בדיקה לחקירה כמותית של פעילות ההובלה של תעלות Cl או טרנספורטרים משוחזרים. הבדיקה מבוססת על מדידת קצב הפליטה של Cl- מפרוטאוליפוזומים לאחר הוספת K+ ionophore valinomycin כדי להעתיק את פוטנציאל הממברנה. אלקטרודה רגישה ליונים משמשת למעקב אחר מהלך הזמן של פליטת יונים מפרוטאוליפוזומים שהורכבו מחדש עם החלבון הרצוי. השיטה מתאימה מאוד למחקרים מכניסטיים, מכיוון שהיא מאפשרת קביעה כמותית של תכונות מפתח של החלבון המשוחזר, כגון קצב ההובלה היחידתי שלו, חלק החלבון הפעיל והמסה המולקולרית של היחידה הפונקציונלית. ניתן להשתמש בבדיקה גם כדי לקבוע את ההשפעה של תרכובות מולקולות קטנות המעכבות/מפעילות ישירות את החלבון המחודש, כמו גם כדי לבדוק את ההשפעות המווסתות של הרכב הממברנה או ריאגנטים משני שומנים. במידת האפשר, השוואה ישירה בין תוצאות שהושגו בשיטה זו נמצאה בהתאמה טובה לאלו שהושגו באמצעות גישות אלקטרופיזיולוגיות. הטכניקה מודגמת באמצעות CLC-ec1, מחליף H+/Cl-מסוג CLC, כמערכת מודל. ניתן להשתמש בבדיקת הפליטה כדי לחקור כל ערוץ/טרנספורטר מוליך Cl, ועם שינויים מינימליים, ניתן להתאים אותה לחקר כל חלבון מעביר יונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשני עשורים האחרונים את יכולת ביטוי יתר ולטהר חלבוני קרום תחבורה גדלה באופן דרמטי: תעלות יונים, מובילים ראשיים ומשניים כעת מטוהרים באופן שיגרתי ממערכות ביטוי Heterologous כמו גם מקורות טבעיים. גישות חדשות כדי לפקח על ביטוי, לשפר ולהקל על החילוץ ולשפר את היציבות של חלבונים אלו נמצאות בעיצומה פיתחו 1-5. פריצות דרך טכנולוגיות אלה כבר סייעו במפעילים הפיצוץ של מידע מבני ברמה האטומית על חלבוני קרום ש, בתורו, העמיקו את ההבנה של הבסיסים המבניים של תפקידם שלנו. בניגוד לכך, היכולת שלנו לחקור את התכונות פונקציונליות של החלבונים המטוהרים לא גדלה באותו קצב, כך שבמקרים מסוימים מידע מבני ברזולוציה גבוהה מלווה בנתונים פונקציונליים איכותיים, הגבלת היכולת שלנו לבדוק כמותית תחזיות המבוסס על מבנה וכך. לפיכך, development של מבחני פונקציונליים כמותי ולהכליל הוא צעד מפתח כלפי הבהרת היסודות מכניסטית של תפקוד חלבון קרום.

כאן אנו מתארים assay זרימה שיכול לשמש כדי לקבוע כמותית תכונות פעילות מרכזית של Cl מטוהר ומחדש - ערוצים ומובילים. העקרונות שבבסיס assay ניתן להכליל את מגוון רחב של מערכות תחבורה, כמו גם לחלבוני הובלת יון שאינו. ליפוזומים מחדש עם Cl מטוהרים - ערוץ / מובילים בנוכחות Cl גדול - שיפוע (איור 1 א ', ב'). Cl - זרימה היא ביוזמת התוספת של ionophore כדי לאפשר לשטף דלפק-יון, במקרה שלנו K + ionophore valinomycin, אשר לדחוק את המתח שהוקם על ידי Cl - השיפוע ולהגדיר את פוטנציאל הקרום הראשוני לפוטנציאל שיווי המשקל של K + 6,7. ללא tהוא ionophore לא Cl נטו משמעותי - בזרימת מתרחשת, כפי שהוא מונע על ידי הדור של פוטנציאל הטרנסממברני. הנתונים מתואר כמותית על ידי שני פרמטרים הניתנים למדידה (איור 1 ג): τ, מתמיד של Cl זמן - בזרימת, וf 0, את החלק היחסי של יפוזומים לא מכילים חלבון פעיל. מτ וf 0 Cl יחידתי - שיעור תחבורה, את החלק היחסי של חלבונים פעילים והמסה המולקולרית של המתחם הפעיל ניתן לגזור 8. הטכניקה מודגמת כאן על ידי שימוש proteoliposomes מחדש עם CLC-ec1, H CLC-סוג מאופיין היטב + / Cl - מחליף של מבנה ותפקוד ידועים. assay זה להכליל בקלות לערוצים או מובילים עם הסלקטיביות יונית שונה או שפעילותם תלויה בנוכחות של מתח ו / או ligands. יתר על כן, assay זה יכול לשמש כדי לקבוע אם מולקולות קטנות משפיעות ישירות על החלבון מחדש,כדי לכמת את ההשפעות של תרכובות וכיצד הרכב קרום או חומרים כימיים המשנה את שומנים בדם משפיעים על התפקוד של הערוצים ומובילים מחדש אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה ליפידים

  1. Aliquot שומני כמות הרצויה לתוך צינור זכוכית שקוף. השימוש E. תמצית coli קוטב שומנים בדם, אבל רוב יצירות שומנים ניתן להשתמש. אם השומנים הם בצורת אבקה, resuspend אותם בכלורופורם לריכוז של 20 מ"ג / מיליליטר. ייבש את השומנים בRT תחת N 2 גז עד שכל הממס התאדה.
  2. Resuspend השומנים בפנטן ולייבש אותו שוב זרם יציב של הגז N 2 כדי להסיר עקבות שאריות של כלורופורם. יבש עד שכל הממס התאדה. בעוד ייבוש, בעדינות לסובב את הצינור כך שהשומנים מופץ בסרט אחיד המכסה את השליש התחתון של הצינור ולא מסה צפופה ויוצרת בתחתית.
  3. הוסף את חומר הניקוי המכיל חיץ הכינון מחדש (300 מ"מ KCl, 50 חומצת לימון מ"מ, 25 מ"מ K 2 4 HPO, pH 4.5, 35 מ"מ בחורים) לפזר את השומנים. להשתמש בחומרי ניקוי עדינים אחרים בשלב זה אם החלבון הוא גרוע סובלני לבחורים.
  4. Resuspenד השומנים לבהירות באמצעות sonicator אמבט מים. לטבול את הצינור במרכז האמבטיה sonicator מים בכוח מרבי בפולסים קצרים (30 דקות שניות-1) עם (דקות שניות-1 30) קצרות עוצר. הפתרון צריך להיות ברור.
    הערה: התואר האחרון של בהירות השיג תלויה בהרכב השומנים הספציפי בשימוש. איזו וריאציה בשלב זה, אצווה לתצווה אפילו בין שומנים להלכה זהים, הוא גם אפשרית. האובך שיורית הוא עקב פיזור אור על ידי חלקיקים גדולים בהשעיה, אשר ניתן להסירו על ידי צנטריפוגה.
  5. דגירה שומני resuspended ב RT עבור 20-60 דקות.

2. כינונה Proteoliposome

הערה: מספר אסטרטגיות יכולה להיות מועסקות על מנת להכניס את חלבון אבקת-solubilized ליפוזומים. לCLC-ec1 דיאליזה עובדת היטב, ולכן השיטה של בחירה 6,9,10.

  1. הוסף את החלבון המטוהר לחלבון הרצוי לשומנים בדם (P / L) יחס (באו לידי ביטוי במיקרוגרם o f חלבון / מ"ג שומנים בדם). הבחירה של יחס P / L תלויה במטרת הניסוי.
    1. אם המטרה היא להעריך את הפעילות של החלבון של עניין, מחדש בP הגבוה L's על מנת למקסם את / האות, כמו כל liposome מכיל מספר עותקים של החלבון. כדי לכמת את הפעילות ו / או שיעור תחבורה אחיד של החלבון, מחדש במשטר דילול Poisson בP הנמוך / L's, כך שכל שלפוחית ​​מכילה חלבון על 1 ממוצע. ראה שלב 7 ודיון ליותר בניתוח המעמיק של מתי להשתמש בכל משטר.
  2. כדי לקבוע את ערכי P / L אופטימליים למשטרים השונים, לבצע טיטרציה של הפעילות מלאה כפונקציה של ריכוז חלבון 8,11-13. עם זאת, לכל חלבון שהמשקל המולקולרי (MW, בא לידי ביטוי בKDA) של היחידה הפעילה ידוע ערכי L / P הבאים יכולים לשמש כguesstimates ראשוני:
    pg "/>
    figure-protocol-1
  3. טען את החלבון ותערובת שומנים בצינור דיאליזה טרום רטוב או קלטת. מניחים את מכשיר הדיאליזה בכוס המכילה 500-1,000x היקף חיץ הכינון מחדש שומנים (כלומר, חיץ L 1 ל1 מיליליטר של resuspension שומנים בדם) תחת ערבוב עדין.
    1. חיץ שינוי 3-4 פעמים במרווחים> 3 שעות. בכל החלפת פתרון, לשטוף את הקלטת / צינורות ואת הכוס עם מים מזוקקים ולמלא את הכוס עם חיץ הכינון מחדש טרי. כולל 1-2 O מרווחי N / לשינוי הפתרון. המספר ומשך הזמן המדויק של שינויי הפתרון תלוי בשומנים המדויקים וחומרי הניקוי המשמשים.
  4. לאחר השלב האחרון הוא מלא, להסיר את יפוזומים מספינת הדיאליזה, aliquot אותם בצינורות ופלאש להקפיא אותם בנוזל N 2 או הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס.

3. הקלטת Set-up

הערה: הגדרת הקלטה (איור 2 א) מורכב משני תאים (צילינדרי תחתית שטוחה, ~ 3-4 מיליליטר נפח), Cl - (ראה להלן) אלקטרודה, מטר pH עם אנלוגי או פלט דיגיטלי חשמל, digitizer, ומחשב עם תוכנת רכישה מתאימה.

  1. חבר את Cl - אלקטרודה למטר pH, הפלט של מטר pH לdigitizer אשר מחובר למחשב. מניחים את האלקטרודה ההתייחסות בחדר אחד וחוט הקידוד מחדש באחר (איור 2).
    הערה: הקוטביות של החוטים נכונה אם ΔV קאל (ראה שלב 6.4 ו -7.2) הוא חיובי.
  2. מניחים את התאים על צלחת ומערבבים עם בר ומערבב בחדר ההקלטה (איור 1). ודא שהבר והמערבב לא נוגע באלקטרודה.
  3. חבר את התאים באמצעות גשר אגר (איור 2) (100 מ"מ KCl ו -2% Agarose). אחסן את הגשרים אגר ב100 מ"מ KCl.

    4. 4. הכנת Cl - אלקטרודה

    1. קח אלקטרודת תפקוד שאינו ישנה ו-possibly-. לשבור את ציפוי הזכוכית כדי לחשוף את חוטי הכסף לחלוטין.
    2. מוציא בזהירות את הציפוי מחוטי הכסף באמצעות להב סכין מנתחים. נקה את החוטים באמצעות כמויות עצומות של H 2 O וEtOH.
    3. מקום בתמיסה רוויה של FeCl 3 (או אקונומיקה) עד חוטים מכוסה במעיל כהה אחיד של AgCl.

    5. הכנת Unilamellar שלפוחית

    1. בלילה שלפני הניסויים, להתנפח 1 גרם של Sephadex G-50 חרוזים ב 15 מיליליטר של חיץ חיצוני (1 מ"מ KCl, 150 מ"מ K 2 SO 4, חומצת לימון 25 מ"מ, pH 4.5) עם רעד עדין (לא לעורר) ל לפחות 3 שעות בRT לפני השימוש. כל ניסוי דורש ~ 3 מיליליטר של חרוזים נפוחים. שמור את חרוזים הנפוחים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לכל היותר.
    2. , בעוד ליפוזומים הם מפשירים בRT לשפוך בכל עמודה ~ 3 מ 'l של G-50 חרוזים נפוחים. לתת להם להתייבש על ידי זרימת כוח הכבידה בRT; זה בדרך כלל לוקח 1-2 דקות.
    3. הכן שלפוחית ​​unilamellar באמצעות משייכת proteoliposomes 11 פעמים באמצעות מיני-Extruder באמצעות חתך 0.4 מ 'טפלון.
    4. מניחים את הטור בצינור עגול תחתית פלסטיק. ספין העמודות כדי להסיר פתרון עודף. צנטריפוגה למשך 20-30 שניות ב1,400 XG בצנטריפוגה קלינית.
    5. זורק זרימת דרך, עמודת מקום בצינור זכוכית 13 x 100 מ"מ ולהוסיף של שלפוחית ​​extruded 100 μl לעמודה. ספין עמודת דקות 1 ב XG 500 בצנטריפוגה קלינית.
    6. לאסוף ~ 200 μl של זרימה דרך שיתווסף לתא ההקלטה בשלב 6.5.

    6. בזרימת מדידה

    1. מקום 2 מיליליטר של 100 מ"מ KCl בהתייחסות הקאמרית (קרקע) ו -1.8 מיליליטר של החיץ החיצוני (1 מ"מ KCl, 150 מ"מ K 2 SO 4, 25 חומצת לימון מ"מ, pH 4.5) לתא ההקלטה. חוסר האיזון האוסמוטי הקל בין הפנימיופתרונות חיצוניים אינו משפיעים על
    2. הפעל את תכנית הרכישה. בואו הבסיס לאזן, זה עלול לקחת כמה דקות.
    3. ברגע שהאות מגיעה לבסיס יציב (ליפוזומים מוכנים ועמודות ייבוש), להתחיל בהקלטה (איור 3 א).
    4. הוסף 15 μl של פתרון מ"מ KCl 10 לכייל את המערכת (איור 2 א).
    5. הוסף ליפוזומים. קפיצה קטנה עשויה להיות גלויה בשל ההסרה חלקית של Cl החיצוני - מproteoliposomes (איור 3 א). חכה עד תחילת המחקר מייצב.
    6. להוסיף Valinomycin (1 μl ב1 מ"ג / מיליליטר בEtOH) ליזום בזרימת (איור 3 א).
    7. בואו הזרימה מיצתה את עצמו הזמן עד שהוא מישורים (איור 3 א).
    8. הוסף 40 μl 1.5 M β-octylglucoside (β-OG) שהוכן במאגר החיצוני לפזר כל יפוזומים (איור 3 א). לסיים את ההקלטה.

    7. נתוניםnalysis

    1. לייצא את קובץ זכר בפורמט ASCII או טקסט ולייבא אותו לתכנית הניתוח של בחירה.
    2. מדוד את מתח בנקודות הבאות (איור 3 א):
      בתחילת ההקלטה (V 0);
      לאחר תוספת של דופק הכיול (V cal);
      לאחר תוספת של יפוזומים (שאיבת V);
      בסופו של הזרימה (סנפיר V);
      לאחר תוספת של חומרי ניקוי (tot V);
      Baseline המתחים כך שV 0 = 0.
    3. השתמש במשוואת נרנסט-פלאנק כדי לקבוע את הערך הניסיוני של figure-protocol-2 על ידי מדידה
      figure-protocol-3
      איפה כרך קאל הוא הנפח של דופק הכיול בμl, 1,800 הוא קאמרי הנפח בתחילת הניסוי בא לידי ביטוי ב1; l, [Cl] קאל / בהוא Cl - ריכוזים של דופק הכיול ולמאגר החיצוני במ"מ וΔV cal הוא הקפיצה בmV נמדדה לאחר דופק הכיול.
      הערה: קביעה אמפירית זה של α משרתת שלוש מטרות: הוא מבטיח כי המערכת מגיבה כראוי, מציעה מידה מסוימת של העקביות של התגובה של המכשיר בין ניסויים, כמו גם לבדוק שאין טעויות נעשו בהתהוות הפתרון.
    4. חשב את ריכוזי Cl לאחר כל שלב באופן הבא:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
      figure-protocol-6
      הגורם 3/400 מגיע מהירידה בשיעור דופק כיול 15 μl לתוך הנפח הסופי 2,000 μl.
    5. Calculאכלתי את השינויים ב[ Cl] בכל שלב, שאיבת ΔCl / סנפיר / tot.
    6. המרת V (t) בCl (t) עם
      figure-protocol-7
      ישירות לקבוע את הערכים [Cl] בנקודות הקריטיות ולהשוות אותם לערכים מחושבים כבקרה פנימית.
    7. לנרמל את העקבות כך ששאיבת rel = 0 Cl וCl rel tot = 1
      figure-protocol-8
    8. להתאים את מהלך הזמן בזרימת למשוואה הבאה:
      figure-protocol-9
      כאשר L הוא שיעור Cl - הדליפה שנקבע באופן ניסיוני על ידי מדידת Cl - זרימה מיפוזומים ללא חלבון מוכן באותם תנאים וτ הוא מתמיד של התהליך הזמן.
    9. לחשב v, המהירות ההתחלתית:

      איפה סנפיר ΔCl בא לידי הביטוי בmillimolar וV הוא הנפח של החדר בμl.
    10. לחשב את שיעור תחבורה / מוליכות
      figure-protocol-10
      איפה p הוא P / L, MW הוא המשקל המולקולרי של המתחם הפעיל בא לידי ביטוי בkDa

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול מפורט וחזק כדי למדוד Cl - תחבורה בתיווכו של CLC-ec1 המטוהר, H פרוקריוטים CLC הסוג + / Cl - מחליף, מחדש ביפוזומים. ייצוג סכמטי של הניסוי מוצג באיור 3 Proteoliposomes מחדש עם CLC-ec1 מטוהר ומכיל Cl הפנימי גבוה -. שקוע בפתרון אמבטיה המכיל Cl הנמוך -. תחת Cl תנאים אלה נטו - בזרימת נמנעת על ידי ההצטברות של מטען החיובי ביפוזום (איור 3 א). תוספת של Valinomycin מאפשרת K ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו תיארנו פרוטוקול מפורט למדידת Cl - תחבורה בתיווכו של ערוצי אניון סלקטיבי מטוהרים או מובילים מחדש ביפוזומים. הדוגמא בה השתמשה הייתה H + / Cl פרוקריוטים - מחליף CLC-ec1. עם זאת, מתודולוגיה ניתן להתאים בקלות ללמוד ערוצים מגודר על ידי ligands 12,13,15, מתח 11,12, או ספורטיבי סלקטיביות anionic שונה 15,16 על ידי החלפת Ag: אלקטרודה AgCl עם אחד מתאים ליונים תחת שיקול. אלקטרודות סלקטיבית ליונים אחרים מאשר Cl -,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי GM085232 מענקים של NIH ופרס חוקר אירמה ט. הירשל/מוניק וייל-קולייר (ל-A.A.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ליפוזומיקטור, אוונטי פולאר ליפידים בע"מ  אוונטי פולאר ליפידים בע"מ610200
IEC Centra CL2 ספסלתרמו מדעי
אוריון מחקר דגם 701A מדניתן למצוא אותם באיביי.
בדיקת pH לא פונקציונליתכל בדיקת מד pH עם חוטי כסף תעבוד. יש להסיר את ציפוי הזכוכית/פלסטיק ולנקות את החוטים.
DI-710 Data LoggerDATAQ מכשירים
תוכנת רכישה WinDAQמכשירי DATAQ פירס
עמודי פלסטיק חד פעמיים, זרימת כוח משיכה, 2 מ"לפירס (תרמו מדעי)29922
צינורות תרבות KIMAX, חד פעמי, זכוכית בורוסיליקטקימבל צ'ייס73500-13100
סט מכבש עם מחזיק/בלוקחימוםאוונטי פולאר ליפידים בע"מ610000
מחשב
pH-mV דיגיטלי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
  2. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
  3. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  4. Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
  5. Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
  6. Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
  7. Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
  8. Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
  9. Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
  10. Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
  11. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
  12. Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
  13. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367(2013).
  14. Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
  15. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
  16. Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
  17. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
  18. Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
  19. Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
  20. Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
  21. Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
  22. Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
  23. Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
  24. Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084(2013).
  25. Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7(2004).
  26. Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
  27. Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CLC ec1

מאמרים קשורים