ניסוי הגלאוקומה נגרמת על ידי הזרקת Ocular של מיקרוסכמות מגנטית

סיכום

אנו מציגים שיטה להשראת לחץ תוך עיני מוגבר (IOP), על ידי הזרקת מיקרוספירות מגנטיות לעין העכברוש, כדי ליצור מודל של גלאוקומה. זה מוביל לעליית לחץ חזקה, ולמוות עצבי נרחב. פרוטוקול זה קל לביצוע, אינו דורש זריקות חוזרות ומייצר עליות IOP יציבות לאורך זמן.

תקציר

ההתקדמות בהבנת הפתופיזיולוגיה, ומתן טיפולים חדשים לגלאוקומה תלויה במודלים טובים של המחלה בבעלי חיים. אנו מציגים כאן פרוטוקול להעלאת הלחץ התוך עיני (IOP) בחולדה, על ידי הזרקת מיקרוספירות מגנטיות לחדר הקדמי של העין. השימוש בחלקיקים מגנטיים מאפשר למשתמש לתפעל את החרוזים לזווית האירידו-קרנית, ובכך לספק חסימה יעילה מאוד של זרימת נוזלים מהרשת הטרבקולרית. זה מוביל לעלייה ארוכת טווח ב-IOP, ובסופו של דבר למוות עצבי בשכבת תאי הגנגליון (GCL) כמו גם לפתולוגיה של עצב הראייה, כפי שניתן לראות בחולים עם המחלה. שיטה זו פשוטה לביצוע, מכיוון שהיא אינה דורשת מכונות, מיומנויות כירורגיות מומחים או שעות רבות של תרגול כדי לשכלל אותה. יתר על כן, עליות הלחץ חזקות מאוד, ובדרך כלל אין צורך בהזרקה חוזרת של המיקרוספירות המגנטיות בניגוד לכמה דגמים אחרים המשתמשים בחרוזי פלסטיק. בנוסף, אנו מאמינים ששיטה זו מתאימה להתאמה לעין העכבר.

מבוא

גלאוקומה ראשונית היא מחלה הרסנית עין משפיעה על 60.5 מיליון אנשים מוערכים ברחבי העולם ^1, מה שעלול להוביל לאובדן ראיית חי שינוי ועיוורון ^2. מחקר על מנגנוני המחלה, ופיתוח תרופות חדשניות לגלאוקומה, תלויים בדגמים טובים של המחלה אשר לשחזר כמה מסימני ההיכר של פתולוגיה.

אנו מציגים כאן מודל גלאוקומה עכברוש על פי השיטה של et al Samsel. ³ המטרה הכוללת של שיטה זו היא להגביר את לחץ התוך עיני (IOP) בעיניים על ידי הזרקת microspheres המגנטי ללשכה הקדמית, ומשתמש בטבעת מגנטית, ישיר אותם לזווית iridocorneal. זה פוגע ביצוא ימי, אשר מגדיל את לחץ התוך עיני, שהוביל לניזק עצבי ואובדן תא. הפרוטוקול פותח כדי לנסות לספק מודל פשוט, מושרה של גלאוקומה.

פרוטוקול זה יכול להיות כמה יתרונותעל טכניקות קיימות. מודלים עכבר גנטיים כגון DBA / י 2 זמינים, שאינו דורשים הליכים ליזום; עם זאת אלה עשויים להיות תחילתה צפויה של התקדמות המחלה ^4. בניגוד לכך, מודלים מושרה, שרובם מסתמכים על ניתוח הרמת IOP במכרסמים, יש את היתרון שייזום יכול להיות נשלט על ידי המשתמש. חלק מהשיטות הללו יכול להיות חסרונות משלהם לעומת זאת, כולל להיות מאתגרים מבחינה טכנית ^5, ויכול לדרוש הליכים מרובים כדי לשמור על לחץ תוך עיני מוגבר ^6.

בניגוד לכך, השיטה מושרה המפורטת בכתב היד הזה היא טכניקה פשוטה, יעילה, ושחזור שמייצרת עליות יציבים, חזקות בלחץ, עם צורך מינימאלי לreinjection. בנוסף, הוא אינו כרוך בציוד יקר, ורק דורש מיומנויות כירורגיות בסיסיות לביצוע. פרוטוקול זה יכול להיות מתאים לקוראים שמחפשים להגדיר פחות תובעני מבחינה טכנית מושרהמודל גלאוקומה במעבדה שלהם.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים שנערכו בהתאם לועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC), ואושרו בהסכם עם הנחיות משרד פן בריטניה (http://goo.gl/FLkirW, גישה 10 ^ביוני האחרון , 2014) והצהרת Arvo לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר Vision (http://goo.gl/4LFOjD, הגישה האחרונה 10 ^ביוני, 2014).

1. Ocular Hypertension אינדוקציה

1. לגרום לגלאוקומה ניסיונית על ידי הרמת לחץ התוך עיני (IOP) באמצעות הזרקה חד-צדדית של microspheres פאראמגנטיים לתוך התא הקדמי של חולדות בראון נורבגיה, המבוסס על השיטה של et al Samsel. ³ חולדות פיגמנט אחרות עשויות להיות מתאימות, אם כי אלה היו צריכים להיות מאומתים ראשון על ידי המשתמש.
2. נקבת g 250-300 הביתחולדות לשעבר מגדל בראון נורבגיה במתמדת תאורה נמוכה סביבה (40-60 סוויטה דה לוקס) כדי למזער את התנודות יומי בלחץ התוך העיני ^7, עם גישה כלרצונך מזון ומים.
3. לקחת מידות IOP בסיסיות בבעלי חיים ער ⁸ לפני ההרדמה והזרקת חרוז, באמצעות tonometer ריבאונד מכויל לשימוש בעיני העכברוש ^9. IOP הוא נלקח כממוצע של חמש קריאות.
4. לטשטש חולדות עם 37.5 מ"ג / קילוגרם קטמין, ו0.25 מ"ג / קילוגרם medetomidine hydrochloride נמסר intraperitoneally. לאשר עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקסים הרגל האחורית של החיה, לפני Povidone יישום יוד (ראה שלב 1.5), והזרקת חרוז (ראה שלב 1.8). לנהל 0.5% hydrochloride proparacaine לשיכוך כאבים.
   הערה: אל להרחיב את התלמיד בכל שלב. זה יעזור לי חרוזים להתיישב טובים יותר לזווית iridocorneal, ולמנוע מחייבים את העדשה. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של קרנית בעין הנגדית המופעל un.
5. Wאפר עין האופרטיבית עם 5% יוד povidone במים ¹⁰ דקות 5 לפני הזריקה.
6. לאחר 5 דקות, פתיל יוד povidone את השימוש בגזה סטרילית, ולשטוף את העיניים עם 0.9% תמיסת מלח סטרילית. שמור את העיניים לחות במהלך הרדמה עם יישום רגיל של תמיסת מלח סטרילית.
7. מניחים מגנט טבעתי סביב העין.
8. הזרק 25 μl של תמיסה המכילה 30 מ"ג / מיליליטר של גמא-הקרנה מעוקרת 8 מיקרומטר microspheres המגנטי בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ללשכה הקדמית, באמצעות מחט משופעת 33 G.
   1. להכין חרוזים, לשטוף מחדש על ידי מתלים, אז צנטריפוגה 3 פעמים ב10,000 XG למשך 5 דקות עם 1 מיליליטר HBSS, לפני קבלת 30 מ"ג / מיליליטר הפתרון הסופי. לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל דרך.
   2. להזרקה, להיות זהיר, כדי למנוע החדרת המחט לאיריס, כדי למזער את הסיכון של טראומת קשתית. זה ניתן למנוע על ידי orientating המחט משיקה למשטח קרני, כמקביל לאיריס ככל האפשר. זה גם יעזור לי כדי להקטין את איבוד חרוז מאתר ההזרקה.
      הערה: הזרק חרוזים בקצב מהיר כדי להבטיח חלוקה שווה סביב זווית iridocorneal, שהוא קריטי להעלאת לחץ תוך עיני. בנוסף, חרוזים חנות, מחטים וטבעות מגנטיות בנפרד, כך שהחרוזים לא יוצרים אשכולות, מה שהופך אותם קשה לטעון לתוך המזרק ולהזריק, והמחט אינה הופכת להיות ממוגנטת.
9. השאר את המחט במקום 1 דקות לאחר הזרקה על מנת להבטיח כי חרוזים להתיישב לתוך זווית iridocorneal לעכב ניקוז המימי מmeshwork trabecular. מעט זווית המחט לאחר חרוזים יש בתחילה התיישבה כדי לאפשר זליגה מסוימת של מימית, כדי למזער את העלייה חולפת בלחץ התוך עיני. בסופו של הניתוח לשטוף את המחט דרך עם פוספט הראשון שנאגרו (PBS), ולאחר מכן 70% אתנול, ואחריו מים מזוקקים, על מנת להבטיח את משך שימוש במחט בהליכים נפרדים. לחלופין, אפשר להשתמש במחטים חד פעמיות אם שילוב מד והמזרק הנכון זמין. אופציונליות: מחטים עשויות להיות מחודדות באמצעות beveller להאריך את השימוש בם.
10. בשלב זה במידת צורך, להסיר את המגנט, ולהשתמש בו כדי לצייר חרוזים לתחומי כיסוי חלקי.
11. השאר את המגנט במקום סביב העין ללאחר הזרקה 10 דקות נוספת כדי להבטיח חרוזים להתיישב גם לזווית iridocorneal.
12. הרדמה הפוכה באמצעות 0.25 מ"ג / קילוגרם hydrochloride atipemezole.
13. לנהל כלורמפניקול, או משחה אנטיביוטית אחרת, למשל gentamycin או טרמיצין topically כדי למנוע זיהום, ושל 0.5% hydrochloride proparacaine לשיכוך כאבים. השאר בעלי חיים להתאושש על מחצלת חום עד שהן חוזרים לתנועה, ולאחר מכן להעביר לתיבה חמה ואספקה ​​עם תזונה נוספת, כגון תוסף מזון או דיאטה רגילה טבולה עד להחלמה מלאה. שיכוך כאבים מערכתיים או מקומיים יש לתת לבעלי חיים בו מוצגות סימנים של כאב 24 שעות לאחר ניתוח. אם thesסימפטומים דואר להתמיד למרות טיפול, בעלי החיים צריכים להיות שלוקטו בצורה אנושית.
14. השתמש בעין הנגדית כשליטת unoperated.
15. קח מדידות לחצו תוך עיניות כל 2-3 ימים לאחר מתן חרוז, וכל 2-3 ימים לאחר מכן באמצעות tonometer ריבאונד מכויל לשימוש בעיני העכברוש ^9.
16. הקריטריונים להכללת עיניים בלימודים יכולים להיות: אם 1) IOP מוגבה מעל הלחץ הנגדי על ידי שליטת 5 מ"מ כספית, ו -2) לא יעלו על 60 מ"מ כספית.
17. עיניים שבו חוזר לנקודת התחלת הלחץ (בדרך כלל על ידי לאחר הזרקת שבוע 1) לא צריך להיות כלולה בלימודים, אך זה אפשרי חרוזים מחדש להזריק בעיניים שאינם מצליחים לפתח גבוה IOP אם תרצה בכך.
18. להרדים בעלי חיים על ידי CO ₂ מחנק בסוף הניסוי.
19. לנתח את העיניים ועצבי ראייה, ולתקן בparaformaldehyde 4% (PFA) לילה לניתוח היסטולוגית נוסף.

2. הערכת נזק לרשתית Neuron שימוש TUNEL Staining

1. כדי לכמת תאים אפופטוטיים בהר שלם retinasuse assay dUTP ניק תיוג בתיווך transferase deoxynucleotidyl המסוף (TUNEL), על פי הוראות היצרן.
2. לנתח את הרשתית מכוס עין, לשטוף 3 x 5 דקות בשיעור של 0.3% Triton X-100 בפוספט שנאגרו מלוח (T-PBS).
3. Permeabilize הרקמה ב 3% T-PBS עבור שעה 2.
4. טרום לאזן רשתית באיזון הצפת למשך 10 דקות, לפני הדגירה בפתרון תגובת TUNEL עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס.
5. שטוף את הרקמה למשך 3 x 5 דקות בשיעור של 0.3% T-PBS, לשטוף בשיעור של 0.3% T-PBS המכיל 5 מיקרומטר DAPI, ושטוח הר בתקשורת הרכבה.
6. כדי לכמת גרעינים חיוביים TUNEL להשתמש מיקרוסקופ confocal לקחת 10 מיקרומטר Z- ערימות דרך שכבת תא גנגליון בהגדלה 20X. קח 3 תמונות בכל אחד 4 עלי הכותרת, באתרים קרובים לעצב הראייה, באמצע הפריפריה-, ובפריפריה הרחוקה של הרשתית, נותן סך של 12 תמונות לכל mount, דגימה כ -7,000 תאים. קריטריונים מורפולוגיים מופלים שאינו עצבי (אנדותל וגליה) תאים מהתאים עצביים.
7. אזורי בחירה להדמיה באמצעות רק ערוץ DAPI, וחוקרי מסכה לקבוצות טיפול.

3. הערכת נזק לעצב הראייה באמצעות toluidine הכחול מכתים

1. תקן את עצבי ראייה הלילה בפתרון של Karnovsky ב 4 מעלות צלזיוס.
2. פנק את הדגימות עבור שעה 2 ב 1% (w / v) tetroxide אוסמיום ולאחר מכן ליבש באתנול 100%.
3. דגירה עצבי ראייה בפרופילן אוקסיד למשך 30 דקות, ואת המקום בתערובת 50:50 של פרופילן אוקסיד: לילה araldite.
4. לשנות את הפתרון הזה ל -100 araldite%, ואחריו דגירה הלילה בשעה 60 ° C.
5. קטעי Cut semithin (0.75 מ"מ עובי) וכתם עם toluidine 1% כחולים / בורקס (TB) ב 50% אתנול לפני הבדיקה על ידי מיקרוסקופ אור.

4. ניתוח סטטיסטי

1. לבצע ana הסטטיסטיlyses באמצעות חבילת תוכנת סטטיסטיקה מתאימה. דו כיוונית ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של ניומן-קאול ניתן להשתמש כדי לחשב מובהקות סטטיסטיות לIOP משתנה על פני זמן.
2. ערך p של פחות מ 0.05 עשוי להיחשב משמעותי.

תוצאות

הזרקה של חרוזים מגנטיים לזווית iridocorneal מושרה באופן עקבי עלייה ממושכת ויציבה בלחץ (איור 1), שהייתה לצפות בקלות בנקודת הזמן הראשונה, 3 ימים לאחר ההזרקה. יתר על כן, העלייה בלחץ נשמרה לאורך תקופת הניסוי, ועל אף שכמובן הזמן שלנו סיימו בגיל 18 ימים לאחר הזרקה, אחרים דיווחו כי לחץ נמשך לטווח ארוך ^3. IOP הממוצע בממוצע לכל אורכו של הניסוי לשליטה, עיניים הזריקו-לא-חרוז הייתה 19.7 ± 0.3 מ"מ כספית, לעומת 40.5 ± 2.8 מ"מ כספית לעיניים-הזריק חרוז (P <0.001). בנוסף, שיא לחץ תוך עיני מוגבר מ22.8 ± 0.3 מ"מ כספית ל49.9 ± 2.3 מ"מ כספית.

כדי לקבוע אם ההעלאה בIOP מובילה למוות של תאי הגנגליון ברשתית, ביצענו צביעת TUNEL על רשתית, והיסטולוגיה על סעיפי עצב ראייה רוחביים (איור 2). ברשתית צפינו עלייה בצביעת TUNEL (איור 2 א) בעיניים מוזרק חרוז עם IOP הגבוה. מספר הגרעינים אפופטוטיים עלה כ -15 מתקפלים, מ -1.6 ± 0.5 תאים בבקרה הנגדית, ל24.5 ± 0.5 תאים ברשתית עם יתר לחץ דם (איור 2; P <0.05). יתר על כן, בעיניים שבחרוזים מגנטיים הוזרקו אבל לחץ לא גדל (כנראה עקב חסימה חלקית של זווית iridocorneal), מספרם של תאי TUNEL חיוביים לא היו שונה באופן משמעותי מאלה של בקרות uninjected (P> 0.05). הדבר מצביע על כך המוות של תאים היה קשור לעלייה בלחץ, לא בשל רעילות ישירה של microspheres המגנטי. לבסוף, חקרנו פתולוגיה עצב ראייה במודל הגלאוקומה, וראיתי הצטברות של toluidine כחול ברבים מהאקסונים, המצביעים על ניוון של תהליכים אלה סלולריים (איור 2 ג).

"Src =" יור 1 "/> / קבצים / ftp_upload / 52,400 / 52400fig1highres.jpg
איור 1. העלאת לחץ התוך עיני באמצעות microspheres המגנטי. הזרקה של microspheres המגנטי ללשכה הקדמית מושרה עלייה חזקה, משמעותית בלחץ התוך עיני (IOP) בהשוואה לשליטה הנגדית, עיניים-מוזרק אינם. יחידות ציר Y = מילימטר כספית (ממ"כ). = נתונים ממוצע ± SEM. * = P <0.001; = 12. דמות N זה שונה מFoxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1,379-1,390.

איור 2. העלאת IOP על ידי הזרקה של microspheres המגנטי לזווית iridocorneal, הנגרמת מוות עצבי בשכבת תא גנגליון (GCL). (א) נציג תמונות של רשתית משליטה (משמאל) וגלאוקומה (מימין) העיניים מוכתמות לגרעינים אפופטוטיים ידי TUNEL (ירוק;חצים לבנים) וDAPI (כחול), המציינים את מספר הגרעינים אפופטוטיים מוגבר כIOP עלה. (ב) כימות של תאים חיוביים TUNEL בGCL, מראים כי עיניים עם IOP הגבוה (באמצע), היו תאים באופן משמעותי יותר אפופטוטיים בהשוואה ל שליטה (משמאל). בניגוד לכך, בעיניים מוזרק חרוז שבו לחץ לא עלה (מימין), ללא גידול משמעותי בהכתמת TUNEL נצפה. = נתונים ממוצע ± SEM. * = P <0.05; N = 7 - 8 (ג) נציג תמונות של צביעת עצב ראייה, דגי עלייה בהצטברות כחולה toluidine (חיצים שחורים) באקסונים פגועים מהגלאוקומה (מימין), אבל עיניים לא שולטות (משמאל).. ברים סולם = 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מאל Foxton et., Am. J. Pathol 182 (4):. 1,379-1,390.

דיון

כאן אנו מדגימים שיטה לגרימת IOP הגבוה בחולדה, על ידי הזרקת microspheres המגנטי לתוך התא הקדמי של העין. שיטה זו היא פשוטה לביצוע, ודורשת מומחיות כירורגית קטנה, או שעות של תרגול ועידון. יתר על כן, ההליך הוא אפקטיבי; לעתים רחוקות דורש יותר מאשר זריקה אחת של חרוזים כדי לגרום לעלייה חזקה, חזקה בלחץ (reinjection שיעור של כ -10%). זה עשוי לספק יתרון על פני שיטות מושרה קיימות, כגון וריד episceral המאתגר מבחינה טכנית טרשת נפוצה מודל ^11, או פרוטוקול photocoagulation לייזר ^6, אשר יכול לדרוש הליכים מרובים כדי לשמור העלו IOP.

על מנת שהשיטה כדי להצליח עם זאת, יש כמה קריטי צעדים קטנים שיש לנקוט. ראשית כדאי להשתמש במגנט בצורה טבעתי לצייר חרוזים לזווית iridocorneal. צעד זה הוא שינוי של הפרוטוקול המקורי, wherדואר חרוזים הוזרקו לתוך התא הקדמי, ולאחר מכן עברו ביד חופשית סביב העין ^3. באמצעות מגנט טבעתי אומר שmicrospheres צריך להתיישב באופן שווה סביב הזווית, הדורש חלוקה מחדש ידנית מינימאלית. שנית, שיעור ההזרקה צריך להיות מהיר - איטי מדי והחרוזים בעיקר יצטברו בצד אחד של הזווית, שהובילו לכיסוי חלקי, ובאופן פוטנציאלי אין עלייה בלחץ. באופן כללי אם כי, השיטה היא פשוטה מספיק שהמשתמש יכול בקלות לבצע שינויים בפרוטוקול, כגון שינוי הגודל או הנפח של חלקיקי microsphere, אולי כדי לנסות לשנות את מידת גובה IOP.

עם זאת, חסרון פוטנציאלי אחד של השיטה הוא שיש אחד מעט שליטה על היקף יתר לחץ דם, אשר בכ 5-10% מהמקרים שצפינו עלה מעל 60 מ"מ כספית. עלייה מוגזמת בIOP יכולה להיות מאוד הרסנית לרקמת רשתית, ועלולה להפוך את חקר המנגנונים ויומשעמם של מוות של תאים מאתגרים. עם זאת, השיטה מייצרת פתולוגיה עצבית עקבית, הן בעצב הרשתית ואופטי, שניתן להשפיע פרמקולוגית ^12. זה עלול להפוך את המודל אטרקטיבי לפיתוח תרופות חדשניות לטיפול בגלאוקומה. בנוסף, מאחר שהחרוזים מופנים לזווית iridocorneal, זה משאיר חזותי הציר חופשי להדמית חיה של דיסק הרשתית או אופטי. אנו צופים כי מודל זה יותאם ומשמש ליישומים עתידיים במינים אחרים, כוללים עכבר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
250 - 300 גרם נקבה חומה נורווגיה חולדות מגדל לשעבר	הרלן בריטניה	203
טונומטר ריבאונד Tonolab	Tiolat	TV02
Ketaset (קטמין)	פורט דודג' בריאות בעלי חיים	BN1000118	37.5 מ"ג/ק"ג
דומיטור (מדטומידין הידרוכלוריד)	אוריון פארמה	140-999	0.25 מ"ג/ק"ג
פובידון יוד	Ecolab	BN4369LE10	5% בתמיסת מלח H2O
Minim	Bausch and Lomb	PL00033/5017
מגנט טורואידלי	סופר-מגנט	R-10-07-03-N
מיקרוספירות מגנטיות	Bangs Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G מחט משופעת	המילטון	7747-01	מחט מותאמת אישית
Luer tip מזרק	המילטון	80601
Antisedan (atipemezole hydrochloride)	Orion Pharma	141-003	0.25 מ"ג/ק"ג
משחת כלורמפניקול	Medicom	18956-0005
ערכת צביעה TUNEL	Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield מדיית הרכבה	Vector Labs	H-1000