מאמר שיטה

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

DOI:

10.3791/52423

⸱

19 בפברואר 2015

 , 
1Centre for Vascular Research, University of New South Wales, 2School of Medical Sciences, University of New South Wales

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת ברציפות תהליכי הידבקות התא ודה-הידבקות עם רזולוציה גבוהה זמנית באופן בלתי פולשני על ידי עכבת תא-מצע והדמיה תא חי ניתוחים. גישות אלה חושפות את הדינמיקה של תהליכי הדבקת תא / דה-הידבקות מופעלים על ידי שינוי מטריצה ​​והיחסים הזמני שלהם לאירועי איתות הידבקות תלויה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הידבקות תא-מטריצה ​​ממלאת תפקיד מרכזי בשליטה מורפולוגיה של תאים ואיתות. גירויים המשבשים הידבקות תא-מטריצה ​​(למשל, Myeloperoxidase וחמצון שינוי מטריצה ​​אחר / אנזימים שפורסמו במהלך דלקת) הם מעורבים במפעילים שינויים פתולוגיים בתפקוד התאי, פנוטיפ וכדאיות במספר המחלות. כאן, אנו מתארים כיצד עכבת תא-מצע וגישות הדמיה תא חיות יכולים להיות מועסקות בקלות לכמת במדויק את השינויים בזמן אמת בהידבקות תא ודה-הידבקות הנגרמת על ידי שינוי מטריצה ​​(תוך שימוש בתאי האנדותל וMyeloperoxidase כגירוי שינוי המטריצה ​​pathophysiological) עם רזולוציה גבוהה זמנית ובאופן לא פולשני. מערכת עכבת תא-מצע xCELLigence רציפות מכמתת את האזור של הידבקות תא-מטריצה ​​על ידי מדידת העכבה החשמלית בממשק שהתא-המצע בתאים שגודלו במערכי microelectrode זהב. ניתוח תמונה של זמן לשגות בידולtial סרטי ניגוד להפרעות מכמת שינויים באזור המוקרן של תאים בודדים לאורך זמן, המייצג את השינויים באזור מגע התא-מטריקס. שני טכניקות מדויקים לכמת שינויים מהירים לתהליכי הדבקה סלולרית ודה-הידבקות. עכבת תא-מצע על מערכי biosensor microelectrode מספקת פלטפורמה למדידות תפוקה גבוהה חזקה,. הדמיה תא חי מנתחת לספק פירוט נוסף לגבי האופי והדינמיקה של השינויים מורפולוגיים לכמת ידי מדידות עכבת תא-מצע. גישות משלימות אלה מספקות תובנות חדשות חשובות איך שינוי חמצוני-זרז Myeloperoxidase של רכיבי מטריצה ​​תאיים subcellular מפעיל שינויים מהירים בהידבקות תא, מורפולוגיה ואיתות בתאי האנדותל. גישות אלה חלות גם על לימוד דינמיקת הידבקות סלולרית בתגובה לגירויי שינוי מטריצה ​​אחרות ובתאים הקשורים חסיד (לדוגמא, תאי אפיתל).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנשי קשר דבק יציבים בין תאים והחוץ-התאי המקיף אותם נדרשים לשמירה על הומאוסטזיס רקמות. לדוגמא, הדבקת תא האנדותל למטריצת subendothelial בכלי דם משחקת תפקיד קריטי בשמירה על שלמות שכבת האנדותל ותפקודו homeostatic כחסם רגולטורים, חדיר למחצה כלי דם 1. Cytoskeleton אקטין מצמיד מכאנית לדבק מולקולות מטריצה ​​באתרים של הידבקות התא-מטריקס ואנשי קשר דבק בממשק שהתא-המטריצה ​​לשחק תפקיד חשוב בקביעת המיקום של קרום התא על ידי התנגדות כוחות המתיחה actomyosin מרכזית מכוונות. גירויים תאיים המשנים הידבקות תא-מטריצה ​​בהכרח לשנות את מאזן כוחות בממשק שהתא-מטריקס, אירוע שהוא במהירות "חשו" על ידי חלבוני איתות מכאניים רגישה, וכתוצאה מכך התמרה של "מחוץ-באיתות". הימור הצטלבות זותאי Ween ומטריצת החוץ תאי המקיפה אותם ממלאות תפקיד מרכזי בשליטה צורת תא, תנועתיות, פונקציה, שגשוג והישרדות 2.

תהליכים מגוונים פיתו-פיסיולוגי (התפתחות עוברית, דלקת, תיקון פצע וגרורות סרטן) מתאפיינים בעיצוב מחדש דינמי של מצעי מטריצת דבק על ידי חמצון מטריצה-משפילה ו / או אנזימים 3,4. לדוגמא, דבק חלבוני מטריצת subendothelial בכלי דם (למשל, פיברונקטין) הם מעורבים כמטרות עיקריות לשינוי או השפלה במחלות דלקתיות אדם בשל הייצור המקומי של חמצון תגובתי (למשל, חומצת hypochlorous, HOCl) על ידי האנזים המופק מויקוציטים Myeloperoxidase (MPO), אשר מצטבר בתוך subendothelium במהלך מחלת כלי דם דלקתית (איור 1) 5-9. שינויים בהידבקות תא-מטריצה ​​הנגרמים על ידי חמצון נגזר MPO וגירויים שינוי מטריצה ​​אחרים ליקאיליי למלא תפקידים חשובים בשינוי הומאוסטזיס כלי דם במהלך מגוון רחב של תהליכים פתולוגיים; למשל, על ידי שינוי איתות תא האנדותל, מורפולוגיה וכדאיות, אשר בתורו מדאיגה את תפקוד האנדותל ושלמות מחסום. עם זאת, תגובות האיתות מורפולוגיים ותא של תאים חסיד לשינויים מטריצה ​​תאיים הן רק מתחילות להיות מובנות.

כדי להבין כיצד שינויי מטריצה ​​לנהוג שינויים בדינמיקת הידבקות תא ומסלולי תא איתות הידבקות תלויה, טכניקות נדרשות במדויק לכמת שינויים בהידבקות התא-מטריקס בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה זמנית. כאן אנו מתארים עכבת תא-מצע משלים וטכניקות הדמיה תא חיות שעומדות בקריטריונים הללו ולספק פלטפורמה לכמת הידבקות תא ותהליכי דה-הידבקות באופן לא פולשני.

אנו מראים כיצד עכבת תא-מצע אלה וappro הדמיה תא החיכאבים יכולים להיות מועסקים בקלות ל( i) לפקח על הדינמיקה של קובץ מצורף תא והפצה (כלומר, דה נובו הידבקות תא) על גבי מצעי מטריצת ילידים שונה ו( ii) כדי למדוד את הדינמיקה של ניתוק תא-מטריצה ​​(כלומר, דה-הידבקות ) על ידי תאים חסיד החשופים לגירויי שינוי מטריצה. מערכת biosensor עכבת תא-מצע xCELLigence מספקת מדידה רציפה של אזור מגע תא-מטריצה ​​על ידי כימותי עכבה חשמלית על פני השטח של מערכי microelectrode זהב 96-היטב ומבטאת מדידות עכבה חשמליות אלה, כמו "מדד תא ', ערך ממדים ש במידה רבה יחסי לאזור של תא-מצע ליצירת קשר 10 (איור 2), בעוד גם להיות רגישים לשינויים במרחק הממוצע בין קרום התא (בידוד) ופני האלקטרודה 11. עלייה נוספת בערכי מדד תא השיגה גם על היווצרות tha קשר תאי תאים הצמודt להגביל זרם paracellular, 11 תנאים שאינם גוברים בתוך הניסויים שתוארו במחקר זה. מדידה של האזור המוקרן של תאים בודדים לאורך זמן על ידי ניתוח תמונה של התערבות ההפרש לעומת זאת זמן לשגות סרטים (DIC) מספקת מידה משלימה של שינויים בתחום קשר עם תא-מצע ומספק מידע נוסף לגבי האופי והדינמיקה המדויק של שינויים מורפולוגיים לכמת ידי גישת עכבת תא-מצע.

באופן ספציפי, אנו מתארים את יישום גישות אלה כדי לפקח איך תיווך MPO חמצון של חלבוני מטריצת subendothelial דבק (למשל, פיברונקטין) (i) מפחית את הידבקות דה נובו של תאי האנדותל הושעו על פיברונקטין מטוהר ו( ii) מפעיל דה התא-מטריקס -adhesion בתאי האנדותל עם הידבקות הוקמה על פיברונקטין. על ידי ביצוע איתות תא מקביל מנתח לאורך זמן באמצעות Biochem הרלוונטימבחני iCal (למשל, מערבי סופג), יחסי זמן וסיבתי בין תהליכי ההדבקה / דה-הידבקות ושינויים הקשורים באירועי תא איתות הידבקות תלויה ניתן לקבוע.

גישות אלה שמשו לאחרונה על מנת להוכיח כי חמצון חוץ-תאי זרז ידי הפקדות subendothelial של MPO מפעיל אובדן מהיר בהידבקות תא-מטריצה ​​של תאי האנדותל המונעת על ידי כוחות התכווצות actomyosin קיים מראש 9. חשוב לציין, בכך שיאפשר קשר הזמני בין שינויים בשתי הידבקות התא ותא הידבקות תלויה איתות שייקבע, גישות אלה זיהו כי שינוי מטריצה ​​מושרה MPO ודה-הידבקות סלולרית מפעיל שינויים במסלולי הידבקות תלויה חשובים תא איתות כוללים קינאז Src שרשרת זירחון paxillin + התלוי ושרירן אור II זרחון (איור 1) 9. מצב זה של איתות חיזור תלוי, involving ההפעלה של אירועי איתות תאיים על ידי תגובות חמצון תאיים המשבשות הידבקות התא-מטריקס, מייצג מצב רומן של תא איתות מכונה "מחוץ-באיתות חיזור" (איור 1) 9.

באופן כללי, biosensor אלה משלימים עכבת תא-מצע וגישות הדמיה תא חיות צריכים להיות בעל ערך בחשיפה כמה שונה גירויי שינוי מטריצה ​​או סוכנים לנהוג שינויים בדינמיקת הידבקות תא, מורפולוגיה ואיתות בתוך תא-סוגים שונים חסיד כפופים למגוון רחב של הגדרות ניסיוניות.

הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לכמת את ההשפעה של חמצון מטריצת תיווך MPO על דה נובו הידבקות אנדותל תא (ניסוי 1) ודה-הידבקות אנדותל תא (ניסוי 2) תהליכים. MPO נקשר בשקיקה לפיברונקטין וחלבוני subendothelial דבק אחרים חוץ-תאיים וes מי חמצן (H 2 O 2) להמיר יוני כלוריד (Cl -) לחומצה מאוד תגובתי חמצון chlorinating hypochlorous (HOCl), אשר מגיבה באופן מקומי עם חלבוני מטריצה ​​אלה ומשבשים מאפיינים דבקים הסלולרי שלהם (איור 1) 8,9, 12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבית תאי האנדותל 1. הכללי

  1. תרבות תאי שור אב העורקים אנדותל (קטעים 4-9) על צלוחיות תרבית רקמת ג'לטין מצופה (משטח תרבית רקמת מעיל עם 0.1% w / v ג'לטין PBS ב RT במשך 15 דקות) בEGM-2 תקשורת (עם כדור EGM-2 ערכה המכילה 5% בסרום שור עוברי, גורמי גדילה וכל תוספים הניתנים על ידי היצרן, פרט להידרוקורטיזון).
  2. כאשר תאים הם כמעט ומחוברות (בערך 3 ימים לאחר זריעה לאחר 1: 4 מפוצל), תאי קציר על ידי טיפול עם 0.05% w / v טריפסין / 0.02% w / v EDTA ב PBS על 37 מעלות צלזיוס. לאחר שרוב התאים יש מנותק, להוסיף EGM-2 מדיה מלאה כדי להרוות את טריפסין ולאחר מכן צנטריפוגות (100 XG, 5 דק ').
  3. הכן תאים למחקרים על הידבקות דה נובו של תאי האנדותל לפיברונקטין (ניסוי 1: סעיף 2) ודה-ההידבקות הבאה של תאי האנדותל עם הידבקות הוקמה על המצע הזה (ניסוי 2: סעיף 3).
    1. לשטוף נקטףתאים פעם אחת עם הסרום חופשי בינוני 199 המכיל 1% w / v אלבומין בסרום שור (BSA) ומחדש צנטריפוגות (100 XG, 5 דק ').
    2. להשעות מחדש תאים ב% סרום ללא בינוניים 199 המכילים 1 w / v BSA ב 2.5 x 10 5 תאים / מיליליטר (מדידות עכבת תא-מצע) או 5 x 10 5 תאים / מיליליטר (הדמיה תא חי ניתוחים) ולשמור על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
      הערה: תגובות ההידבקות של תאים רגישות מאוד להבדלי טמפרטורה (למשל, בשל השפעות הסעה) כך שכל הציוד והפתרונות המשמשים לטיפול ובטיפול בתאים במהלך הפרוטוקולים הבאים צריכים להישמר בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס.

2. ניסוי 1: הידבקות תא כימות De Novo האנדותל על פיברונקטין Native וחמצון-MPO (עכבת Cell-מצע)

הערה: ניסוי 1 בוחן את המידה שבה תיווך MPO חמצון של פיברונקטין פוגע ביכולתה לתמוך דה נובו הדבקה של תאי האנדותל מושעים.

  1. פיברונקטין מעיל על מערכי זהב 96-גם תא-מצע microelectrode העכבה. להוסיף פיברונקטין שור 80 μl / היטב מטוהר בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS, דגירה של שעת 2 ​​ב 37 ° C ולהסיר את הפתרון.
  2. דגירה משטחים מצופה פיברונקטין עם MPO כדי לאפשר את הכריכה של MPO לפיברונקטין המשטח מחויב. להוסיף 80 μl / היטב MPO נויטרופילים האנושי המטוהר בטמפרטורה של 20 ננומטר בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) והדגירה של 0.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  3. לשטוף משטחים פעמיים עם HBSS כדי להסיר כל MPO מאוגד.
  4. להוסיף H 2 O 2 (0-10 מיקרומטר ריכוז סופי) לבארות הצלחת מערך microelectrode מכילות 80 μl / טוב HBSS ליזום MPO-זרז, חמצון פיברונקטין HOCl תלוי ודגירה עבור שעות נוספות 0.5 על 37 מעלות צלזיוס.
  5. כדי לבחון את ההשפעה של מעכבים או מאפננים של תגובות היו זרז-MPO רלוונטיים (למשל, אנזים MPO חלופימצעים, מעכבי אנזים או חומרים נוגדי חמצון; ראה 9 לפרטים נוספים), להוסיף אלה לHBSS מייד לפני H 2 O 2 בנוסף.
  6. לאחר 0.5 שעות, טיפול במשטחים עם מתיונין כדי להרוות מיני משטח-כבול שייר חמצון, כלומר, chloramines הנכנס חלבון תגובתי, שיכול להפעיל את פעילות סלולרית של בלבול. להוסיף מתיונין 10 מ"מ ב -80 μl HBSS לכל טוב והדגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  7. בלוק משטחים עם BSA. להוסיף 80 μl / טוב של BSA על 0.2% w / v בPBS, דגירה של שעת 2 ​​ב 37 ° C ולהסיר את הפתרון.
    הערה: אזורי משטח ציפוי שיורי יתמכו הידבקות תא וחסימה אלה עם חלבון הלא דביק (כלומר, BSA) מבטיחה כי תגובות הידבקות סלולריות תלויות אך ורק על מטריצת התא מודבק המטוהרת המועסקות, במקרה זה פיברונקטין.
  8. לשטוף משטחי פעמיים עם HBSS.
    הערה: אף אחד מטיפולי השטח שקדמו ניכר משפיעה הקראת תא-מצעGS.
  9. תאי האנדותל מושעים זרע (להוסיף 200 μl / גם בקירוב 2.5 x 10 5 מיליליטר תאים /, שהוכן ב199 בינוניים BSA 1% המכילים סרום ללא; ראה 1.3) על גבי משטחי פיברונקטין מצופה האם של חמצון-MPO או.
  10. מייד לאחר זריעת תאים (כלומר, לפני כל מצורף תא והפצה), הר צלחת מערך microelectrode על יציאת החממה (שוכנת בחממה 37 ° C בנוכחות של 5% CO 2).
    1. שימוש בתוכנת המכשיר באופן מיידי לקחת "ריק" קריאה לנורמליזציה עכבת תא-מצע שלאחר מכן ("מדד תא ') ערכים לערכי הרקע הראשוניים שהתקבלו בהעדר תא-הידבקות.
    2. ליזום רכישת נתונים רציפים מדד תא (מינימום של קריאה / min מדד תא אחד).
  11. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור שעה 2, פרק זמן שבי מצורף תא מקסימאלי ומתפשטים מושגת; זה בא לידי ביטוי על ידיplateauing של ערכי מדד תא (ראה איור 3 א).
    הערה: הניסוי הקודם (ניסוי 1) בוחנת כיצד חמצון בתיווך MPO הראשוני של פיברונקטין מגביל את יכולתם של תאי האנדותל להקים הידבקות תא על מצע זה. הניסוי (ניסוי 2) הבא בוחן כיצד חמצון פיברונקטין תיווך MPO מקדם ירידה בהידבקות תא-מטריצה ​​(כלומר, דה-הידבקות) בתאי האנדותל עם הידבקות הוקמה על המצע הזה. הטיפולים בשני ניסויים אלה הם למעשה זהים, פרט לעיתוי של חמצון בתיווך MPO פיברונקטין (כלומר, לפני הידבקות תא - ניסוי 1; לאחר הידבקות תא - ניסוי 2).

3. ניסוי 2: כימות תא האנדותל De-הידבקות מפיברונקטין בתגובה לחמצון פיברונקטין תיווך MPO (עכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי)

  1. פיברונקטין מעיל על microelectrode זהב 96-היטבrrays למדידות עכבת תא-מצע (להוסיף 80 μl / טוב של פיברונקטין בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS ו דגירה של שעה 2 ב 37 ° C) או תרבות מנות תא עם רצפת זכוכית 35 מ"מ לניתוחי הדמיה תא חיים (להוסיף 2 מיליליטר / צלחת של פיברונקטין בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS ו דגירה של השעה 2 ב 37 ° C).
  2. בלוק משטחים עם BSA. להוסיף BSA על 0.2% w / v ב PBS בכרכים מצויינים ב3.1 דגירה במשך שעה 2 ב 37 ° C.
  3. דגירה משטחים עם MPO כדי לאפשר את הכריכה של MPO לפיברונקטין. הוסף 20 ננומטר MPO האנושי מטוהר בHBSS בכרכים מצויינים ב3.1 ודגירה של 0.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. לשטוף משטחים פעמיים עם HBSS כדי להסיר כל MPO מאוגד.
  5. תאי זרע מושעים האנדותל (שהוכנו בבינוני 199 המכילים 1% w / v BSA סרום ללא; ראה 1.3) על גבי משטחי פיברונקטין האם MPO נושאות או מצופים.
    1. הוסף 200 μl / גם ב 2.5 x 10 5 תאים / מיליליטר ל- 96 מערכי microelectrode עכבת תא-מצע היטב.
    2. הוסף 2 מיליליטר / צלחת ב 5 x 10 5 תאים / מיליליטר לכוס 35 מ"מ תחתית תרבות מנות תא.
  6. מייד לאחר זריעת תאים (כלומר, לפני כל מצורף תא והפצה):
    1. הר 96 צלחות גם מערך microelectrode על יציאת חממת עכבת תא-מצע (שוכנת בחממה 37 ° C בנוכחות של 5% CO 2) ולקחת קריאות 'ריקות' ליזום רכישה רציפה של נתוני מדד תא (סעיף השווה 2.10 ).
    2. מ"מ זכוכית העברת 35 תחתית תרבות מנות תא 37 ° C חממה בנוכחות של 5% CO 2.
  7. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 כדי לאפשר התקשרות מקסימלי תא והפצה (סעיף השווה 2.11).
  8. בקצרה להסיר (קריאות מדד תא הפסקה בשלב זה) 96 צלחת מערך microelectrode טובה או זכוכית 35 מ"מ תחתית צלחת תרבית תאים מן החממה 37 ° C, להסיר supernatant תא ולהוסיף התחממנו (37 ° C) HBSS (כרכים כpצעד אה 3.1).
    הערה: HBSS מועסק כאשר לומדים-זרז MPO תגובות חמצון במקום תקשורת והתרבות השלמה כמו זה האחרון מכיל מיני החמצן שמפריעים לתגובות החמצון.
  9. כדי לבחון את ההשפעה של מעכבים / מאפננים של תגובות היו זרז-MPO (מצעי אנזים חלופיים, מעכבי אנזים או נוגדי חמצון) או מעכבי איתות תא (לדוגמא, blebbistatin 40 מיקרומטר לעכב התכווצות actomyosin), להוסיף האלה עכשיו.
  10. מייד למקם את צלחת מערך microelectrode בחזרה ל( קריאות מדד תא להתחיל מחדש בשלב זה) 37 ° C או יציאת חממת זכוכית 35 מ"מ תחתית צלחת תרבית תאים בחזרה לתוך חממת 37 ° C, ולאפשר לתאים לאזן ב HBSS ל0.5 שעות.
    הערה: לאחר איזון 0.5 שעות בHBSS, ערכי מדד התא יתייצבו על ערכים מעט נמוכים יותר; כאשר מראש דוגרים תאים עם מצעי אנזים, אנזים ומעכבי תא איתות או נוגדי חמצון, להבטיח t שראשוןhese אינו משפיע באופן משמעותי את הערכים שהתקבלו לאחר איזון.
  11. ליזום זרז-MPO, חמצון פיברונקטין HOCl תלוי ודה-הידבקות.
    1. ללימודי עכבת תא באמצעות צלחות מערך microelectrode 96 גם:
      1. הסר את צלחת מערך microelectrode מן החממה ולהשהות מדידות מדד תא.
      2. הוסף 2 O 2 (ריכוז סופי של 0-10 מיקרומטר) H לHBSS ולערבב בעדינות על ידי pipetting חזר.
      3. מייד, מחדש הר מערך microelectrode חזרה אל נמל 37 ° C החממה ולהתחיל מחדש את רכישת קריאת מדד תא.
    2. ללימודי הדמיה תא חיים באמצעות צלחת תרבית תאי זכוכית תחתית 35 מ"מ:
      1. הסר את צלחת התרבות מן החממה והר על במה מחוממת 37 מעלות צלזיוס של מיקרוסקופ confocal הפוך מצוידים בעדשה אובייקטיבית 63X מים עם אופטיקה דסק"ש המתאימה להקלטת סרטי תא חיים.
      2. להתמקד בתאים ולייעל אופטיקה דסק"ש (תאורת קוהלר, פיגור שהטיה ומצלמה לקזז / רווח, לפרטים, ראה 13).
      3. ליזום סרט דסק"ש ולהקליט קריאות בסיס של תאים שלא טופלו דקות 1.
      4. הוסף 2 O 2 (ריכוז סופי של 0-10 מיקרומטר) H ולערבב בעדינות על ידי pipetting חזר. Re-להתמקד מיקרוסקופ (במידת צורך) ולהמשיך בסרטי הקלטה של ​​דסק"ש התאים שטופלו במשך תקופת הזמן הנדרשת.

4. ניתוח נתונים והצגה

  1. נתוני עכבת תא-מצע
    1. נתוני יצוא גלם (מדד תא לעומת זמן) לגיליון אלקטרוני.
    2. ללימודי תא דה-הידבקות (ניסוי 2: סעיף 3), לנרמל את הנתונים על-ידי הגדרת ערכים שנרשמו ערב תחילתו של חמצון פיברונקטין תיווך MPO בשווי של 1 (כלומר, מייד לפני התוספת של H 2 O 2 ב3.11 .1.1).
      הערה: הדבר מבטיח כי ביחסשינויים בערכי מדד תא שהושרו על ידי חמצון פיברונקטין תיווך MPO אינם רעול פנים על ידי הבדלים ראשוניים קטנים בערכי מדד תא מוחלטים בין בארות.
      1. הנתונים הנוכחיים כחלקות מדד מנורמל תא (ציר y) לעומת זמן (ציר x).
  2. נתוני הדמיה תא חי (מחקרי תא דה-הידבקות בניסוי 2: סעיף 3)
    1. פתח דסק"ש לחיות סרטי הדמיה תא נרשמו מייד לפני ואחרי תחילתו של חמצון פיברונקטין תיווך MPO בתכנית ניתוח תמונה סטנדרטי (לדוגמא, תוכנת ImageJ).
    2. לפחות בשני סרטי דסק"ש נפרדים באופן אקראי לבחור תאים מרובים ולמדוד האזור המוקרן במסגרות רציפות (לדוגמא, במרווחים דק '1) על ידי התחקות ידנית קצה הקרום שלהם וכימותי מספר הפיקסלים סגורים.
    3. נתוני שטח תא יצוא נתונים גולמיים (אזור תא מוקרן לעומת זמן) לגיליון אלקטרוני Excel ולנרמל על ידי קביעת ערכים שנרשמו בסמוך להייזום של חמצון פיברונקטין תיווך MPO בשווי של 1 (כלומר, מייד לפני התוספת של H 2 O 2 ב3.11.2.3).
    4. הנתונים הנוכחיים כעלילה של אזור המנורמל תא (ציר y) לעומת זמן (ציר x).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימות של תא דה-הידבקות האנדותל מפיברונקטין בתגובה לחמצון בתיווך MPO פיברונקטין (ניסוי 2). הזריעה של מתלי תא האנדותל על ילידי תוצאות פיברונקטין פיברונקטין (MPO חינם) או MPO נושאות בקובץ מצורף תא מקסימאלי ומתפשטים בזמן אמת בתוך 2 שעות, כפי שיישפט על ידי plateauing של ערכי מדד תא במדידות עכבת מצע תא (איור 3 א). שלב ראשוני זה של קובץ מצורף תא והפצה הוא במידה ניכרת מופחת כאשר חמצון פיברונקטין תיווך MPO הוא שיזם לפני זריעת תאים בניסויים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הידבקות תא-מטריצה ​​ותהליכי דה-הידבקות ניתן לכמת בצורה מדויקת בזמן אמת עם רזולוציה גבוהה זמנית באמצעות עכבת תא-מצע והדמיה תא חי ניתוחים. גישות אלה בזמן אמת מספקות יתרון גדול על פני נקודת סיום הניתוח של הידבקות תא, המספק פתרון זמני עני. על ידי במדויק כימות תגובות דה-הידבקות מהירות עם רזולוציה גבוהה זמנית, ניתוחים אלו יכולים לספק תובנות קריטיות לאיך מורפולוגיים תגובות לשינויים מטריצה ​​מוסדרות וכיצד הם משפיעים על תהליכים בתא איתות הידבקות תלויה, שנמדדו במבחני ביוכימיים רלוונטיים באמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אי לנו גילויים לעשות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט של המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) 568721 (SRT) ובחלקה על ידי מענק מחקר של הפקולטה לרפואה של UNSW (MDR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
96 באר מערך מיקרואלקטרודות עכבת מצע תא זהבACEA Biosciences / RocheE-Plate 96צלחת חד פעמית המשמשת לביצוע בדיקות מבוססות תאים במערכת xCELLigence
blebbistatinSigmaB0560מעכב סלקטיבי של תאי אנדותל אבי העורקים של מיוזין II שאינו שריר
, שימור בהקפאה LonzaBW-6001
אלבומין סרום בקרסיגמא05470
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162ערכת מדיה לצמיחת תאי אנדותל
פיברונקטין, אבקה ליופיליתסיגמאF-4759מפלזמת בקר
פלואורודיש 35 מ"מ צלחת תרבית תאים עם תחתית זכוכיתWorld Precision InstrumentsFD35-100צלחת חיתוך תאים עם תחתית זכוכית באיכות אופטית להדמיית
ג'לטין מעור בקרSigmaG9391תת-שכבה של תרבית תאים
Hank's Balanced SaltSolution Life Technologies14025076
מי חמצןMerck107298
Medium-199Life Technologies11150-059מדיה סלולרית ללא סרום
מתיוניןSigmaM9500מרווה מחמצנים כלוריים הנוצרים על ידי מיאלופרוקסידאז
מיאלופרוקסידאז, לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים אנושייםMillipore475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence Cell Substrate מערכת עכבהACEA Biosciences / Rocheמורכב ממנתח RTCA, תחנת MP RTCA (צלחות מרובות) ויחידת בקרת RTCA
Trypsin-EDTA (0.5%)Gibco15400-054 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  3. Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
  4. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
  5. Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
  6. Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
  7. Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
  8. Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
  9. Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
  10. Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
  11. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
  12. Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
  13. Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
  14. Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
  15. Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
  16. Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time lapseDICCell Index

מאמרים קשורים