הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב

11K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52431

⸱

5 בפברואר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

במאמר זה

סיכום

ביטוי משותף של חלבונים הוא אלטרנטיבה רבת עוצמה לבנייה מחדש במבחנה של קומפלקסים של חלבונים, והוא מסייע בביצוע בדיקות ביוכימיות וגנטיות in vivo. כאן אנו מדווחים על השימוש בביטוי משותף של חלבונים ב-Escherichia coli כדי להשיג קומפלקסים של חלבונים, ולכוונן את תדירות המוטציות של התאים.

תקציר

אנו מדווחים כאן כי הביטוי של קומפלקסים חלבונים in vivo ב-Escherichia coli יכול להיות נוח יותר מניסויי בנייה מחדש מסורתיים במבחנה. בפרט, אנו מראים כי המסיסות הירודה של תת-היחידה Escherichia coli DNA פולימראז ε III III (הכוללת פעילות אקסונוקלאז 3'-5') משתפרת מאוד כאשר אותו חלבון מתבטא במשותף עם תת-היחידות α ו-θ (הכוללות פעילות DNA פולימראז ומייצב ε, בהתאמה). אנו מראים גם שניתן להשתמש בביטוי משותף של חלבון ב-E. coli כדי לבדוק ביעילות את היכולת של תת-יחידות ממיני חיידקים שונים להתחבר לקומפלקס חלבונים פונקציונלי. אנו אכן מראים כי תת-היחידה α של Deinococcus radiodurans DNA polymerase III יכולה להתבטא במשותף עם תת-היחידה ε של E. coli. בנוסף, אנו מדווחים על השימוש בביטוי משותף של חלבונים כדי לווסת את תדירות המוטציות ב-E. coli. על ידי ביטוי תת-היחידה ε מסוג פרא בשליטת מקדם araBAD (השראת אראבינוז), וביטוי משותף של גרסת D12A המוטגנית של אותו חלבון, בשליטת מקדם ה-lac (המושרה על ידי איזופרופיל-תיו-β-D-גלקטופירנוזיד, IPTG), הצלחנו לשנות את תדירות המוטציה של E. coli באמצעות ריכוזים מתאימים של המשרתים arabinose ו-IPTG. לבסוף, אנו דנים בהתקדמות האחרונה ובאתגרים העתידיים של ביטוי משותף של חלבון ב-E. coli.

מבוא

כניסתן של טכנולוגיות ביטוי יתר שיפרה גם מחקרים ביוכימיים של אנזימי מספר נמוך עותק והייצור התעשייתי של חלבונים פרמקולוגית פעילים (למשל, אינסולין). מאז כניסתו של טכנולוגיות אלה, התקדמות משמעותית הושגה להגדיל את התפוקה ואיכות של חלבונים רקומביננטי. בנוסף, מערכות ביטוי יתר פרוקריוטים 1,2 ואוקריוטים 3 פותחו לאורך השנים, המציעות חלופות שימושיות ל" סוס העבודה "של ביוטכנולוגיה חלבון, כלומר, Escherichia coli. בפרט, את הזמינות של פלטפורמות חלופיות לE. coli הוביל לייצור של פפטידים או חלבונים הנושאים לאחר translational שינויי רקומביננטי. עם זאת, יש לציין כי ה coli עדיין מייצג את האורגניזם של בחירה לייצור חלבון רקומביננטי. זאת בשל מספר גורמים, ביניהם הרלוונטיים ביותר יכול להיותנחשבת: i) את הזמינות של מספר לא מבוטל של מערכות ביטוי יתר (וקטורי ביטוי וזנים) לE. coli 1,2; ii) פעמים הדור הקצר, ותשואות ביומסה גבוהות, של א ' coli במגוון רחב של מדיה עשירה וסינתטי; iii) המניפולציה הקלילה או ביוכימיים וברמה הגנטית של מיקרואורגניזם זה; iv) הבידוד של זנים מסוגלים הייצור של חלבונים רעילים 4; v) הבנייה של זנים הכוללים אינדוקציה הומוגנית ברמת האוכלוסייה 5,6. בנוסף, הוא היה לאחרונה הראה כי מערכות הביטוי מתאימות לייצור בE. coli של חלבונים שונה-translationally פוסט ניתן המציא ונבנה 2.

נכון לעכשיו, ביטוי יתר של חלבון משמש בעיקר כדי להשיג חלבוני monomeric או הומו-oligomeric, hypersynthesis שניתן לבצע עם גן יחיד המשובט לתוך פלסמיד מתאים. עם זאת, תשומת לב הייתה לאחרונהששולם לבנייה של א ' מערכות coli שיתוף ביטוי חלבון, מאתגרים את הייצור, in vivo, מתחמי הטרו-oligomeric 2. מעניין, ניסויים מוקדמים של שיתוף ביטוי חלבון התייחסו להרכבה בין-המינים של תת-יחידות קטנות וגדולות של carboxylase ribulose-1,5-bisphosphate cyanobacterial / oxygenase 7,8, ואת הקשר של צורות קטועות ובאורך מלא של HIV-1 להפוך transcriptase 9. מחקריו החלוציים אלה הראו, כי שיתוף ביטוי חלבון מהווה אלטרנטיבה חזקה למסורתית בכינון מחדש חוץ גופית. בנוסף, חלבון שיתוף ביטוי בE. coli שימש לייצור חלבונים שונים הנושאים לאחר translational שינויים 2, כדי להשיג חלבונים המכילים חומצות אמינו לא טבעיות 2, ולהגדיל את התשואה של חלבונים בממברנה ביטוי יתר 2. יתר על כן, את הפוטנציאל של שיתוף ביטוי חלבון ככלי להענקה לE. coli להתחרותפליטות בהפרשת חלבון נמצאת תחת חקירה פעילה 2.

שתי אסטרטגיות עיקריות של שיתוף ביטוי חלבון בE. יכול להיות רדוף coli: i) השימוש בפלסמיד בודד לארח גנים השונים לביטוי יתר; ii) את השימוש בפלסמידים מרובים בתאים בודדים לשתף לבטא חלבוני היעד. במקרה הראשון, הקריטריונים לבחירה של פלסמיד לא שונים מאלה של ניסויי ביטוי יתר של חלבון בודדים מסורתיים, אם כי פלסמידים מסוימים המכילים אלמנטים של פרומוטר / מפעיל בד בבד נבנו לשיתוף ביטוי 10. הגישה הראשונה היא לכן די פשוט. עם זאת, יש לציין כי השימוש בפלסמיד בודד לשתף לבטא חלבונים שונים בפני שני קשיים עיקריים: א) המסה המולקולרית של עליות וקטור עם מספר גנים אירחו, הגבלת מספר החלבונים הביעו שיתוף; ii) כאשר מספר רב של גנים הם משובטים תחת שליטתו של יזם יחיד, קוטביות יכולה decreasדואר הביטוי של הגנים דיסטלי מהאמרגן. השימוש בפלסמידים כפולים או מרובים בE. אחת תאי coli יש להשיג את התאימות של הווקטורים של בחירה, ולכן הטלת מגבלות לצירופים הזכאים של פלסמידים. עם זאת, אסטרטגית שיתוף הביטוי שנייה זה כולל את היתרון של המכיל את המסה המולקולרית של וקטורים, ומגבילה את הקוטביות. לאחרונה בנו מערכת שיתוף ביטוי חלבון שנועדה להקל על הטלטלות של גנים בין פלסמידים שיתוף הביטוי 11. בפרט, אנו נבנו סדרת וקטורי pGOOD, התכונות הרלוונטיות שבהן: א) מקור p15A של שכפול, כדי לספק תאימות של פלסמידים pGOOD עם הווקטורים המסחריים המכילים את מקור ColE1 (למשל, סדרת pBAD 12); ii) קלטת טטרציקלין-התנגדות; iii) את נוכחותו של אק -derived אלמנטי רגולציה, כלומר, יזם-המפעיל (O 1) בני זוג והאצים q גן. באמצעות זוג pBAD-pGOOD מתאים, היינו יכול ביטוי יתר של הליבה הקטליטית של E. פולימראז coli DNA III, מורכב משלוש תת-יחידות שונות, כלומר, α ('פולימראז, ε (3'-5 5'-3)' exonuclease) וθ (ε ייצוב) 13. בפרט, הראינו כי שיתוף הביטוי של מתחם αεθ היה תלוי אך ורק על התוספת לE. בינוני coli תרבות של שני IPTG וarabinose, ביטוי יתר מפעילה מpGOOD וpBAD, בהתאמה (איור 1 א).

בדו"ח הנוכחי, אנו מדגימים כיצד שיתוף ביטוי חלבון ביעילות יכול לפתור קשיים צמודים לעניי המסיסות של מקטע מורכב חלבון. בנוסף, אנו מראים כיצד בבדיקות שלמת חלבון vivo יכול להתבצע, ובסופו אנו מדווחים על השימוש בשיתוף ביטוי חלבון לתדירות מוטציה המנגינה בE. coli. למטרה זו, השתמשנו זוגות pGOOD-pBAD מתאימים כדי להמחיש דוגמאות רלוונטיות של כל מקרה מבחן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בידוד של א ' coli Co-transformants

  1. הכן תאי אלקטרו-המוסמך של E. המתאים זן coli להשתנות. העברה ל1 מיליליטר של מדיום LB (Tryptone, תמצית שמרים, NaCl בגיל 10, 5, ו -10 g / L, בהתאמה) מושבה אחת של הזן של בחירה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בתנאים רועדים של 180 סל"ד. לדלל את הקדם-תרבות 1: 500 ב- 25 מיליליטר של מדיום LB הטרי ודגירת התרבות על 37 מעלות צלזיוס.
  2. ביומן-שלב (0.6 OD) צנטריפוגה ההשעיה התאים בXG 5000 עבור 20 דקות), וresuspend גלולה ב 10%, v גליצרול-מים סטריליים קר כקרח / v במחצית התרבות המקורי הנפח. חזור על שלב זה 4 פעמים, וחצה בכל פעם resuspension הנפח. לבסוף, resuspend את הכדור בגליצרול / מים ומחלקים את ההשעיה התאים ב -50 aliquots μl. אחסן aliquots ב C עד -80 ° עד 6 חודשים.
  3. ממיסים את הפלסמיד הרצוי במים סטריליים בתוספת 0.5 mM EDTA. הפשרה בicדואר aliquot של תאי אלקטרו-מוסמך ולערבב עם כמות מתאימה (2.5-5 ng) של וקטור. לוותר התערובת לתוך קובט 0.1 סנטימטר מתאים לelectroporation, ולהחיל 1.8 kV.
  4. מייד להעביר את תאי electroporated לתוך 1 מיליליטר של מדיום SOC (מדיום LB בתוספת 0.2% w / v גלוקוז, 10 מ"מ MgCl 2, 2.5 מ"מ KCl), דגירה עבור שעה 1 ברעד, ובסופו להעביר 100 aliquots μl לצלחות פטרי המכיל אגר LB עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. לטהר את transformants ידי פסי מושבות אחת על צלחות פטרי.
  6. הכן תאי אלקטרו-המוסמך של transformants הראשוני וחזור על שלבים 1.1-1.5 להפוך עם פלסמידים נוספים.
  7. הכן מניות גליצרול של שיתוף transformants. העבר את מושבה אחת בLB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה, לדגור על 37 מעלות צלזיוס מתחת רועד, וביומן-שלב (0.6 OD) צנטריפוגות ההשעיה התאים בXG 5000 עבור 20 דקות. Resuspend גלולה בLB-אנטיביוטיקה בינונית מכילה 15% גליצרול V / V. לוותר בaliquots ולאחסן ב-- 80 ° C.

2. שיתוף ביטוי של תת-יחידות α וε של א ' coli DNA פולימראז III

  1. העבר עם לולאת סטרילי כמות קטנה של מניות הזן המתאים גליצרול (לדוגמא, TOP10 / pGOOD-ε243 וTOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, ראה איור 1) לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני LB ואנטיביוטיקה. בואו יבש השעיה תאים על גבי צלחת פטרי, ופס תאי טיפה. לדגור על 37 מעלות CO / N.
  2. העברה, באמצעות קיסם סטרילי, מושבה אחת עד 1 מיליליטר של מדיום LB-אנטיביוטיקה. דגירה 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל את הקדם-תרבות 1: 500 במדיום חדש ולדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות.
  3. הוספת IPTG, arabinose, או arabinose וIPTG, 1 מ"מ כל אחד. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2.5 שעות. לאסוף את התאים, ולאחסן את כדורים ב -20 ° C.
  4. כדורי הפשרה על קרח וגלול במאגר תמוגה (50 מ"מ טריס-HCl, 50 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, dithiothreitol 2.5 מ"מ, 1 מ"מ פלואוריד phenylmethylsulfonyl (PMSF), pH 8). בעדינות homogenize ההשעיה תאי הקדר זכוכית קרה עם.
  5. Sonicate ב 15 W במשך 15 שניות, ואחריו 15 שניות מרווח קירור (4 מחזורים).
  6. צנטריפוגה כוללת תמציות חלבון ב10,000 XG במשך 20 דקות, בשעה 4 ° C כדי לשחזר את החלק המסיס.
  7. לנתח ידי SDS-PAGE (acrylamide 12.5%) aliquots של כל תמצית חלבון מסיסה. למטרה זו, להעביר 20 μl של כל תמצית חלבון מסיסה לצינורות Eppendorf המכילים 60 μl של H 2 O ו -20 μl של חיץ טעינה (250 טריס-HCl pH 6.8 מ"מ, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, 10% (w / v) גליצרול SDS, 50% (V / V), 0.25% (w / v) bromophenol הכחול) ולהרתיח במשך 5 דקות. עומס 18 μl של כל דגימה ולבצע אלקטרופורזה ב 140 V לכ -1.5 שעות.

3. שיתוף ביטוי של מקטע α של Deinococradiodurans cus DNA פולימראז III וε מקטע של א ' coli DNA פולימראז III

  1. הכן מראש תרבות של א ' TOP10 זן coli / pBAD-α ד"ר / pGOOD-ε243 ב 1 מיליליטר של מדיום LB-אמפיצילין-טטרציקלין והדגירה 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל 1: 1,000 במדיום חדש ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. לדלל 1: 100 לכ -200 מיליליטר של מדיום חדש, לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות, ולאחר מכן להשרות במשך 3 שעות עם arabinose וIPTG, 1 מ"מ כל אחד. קציר התאים, ולאחסן את גלולה ב -20 ° C.
  3. Resuspend את הכדור ב 50 מ"מ טריס pH-HCl 8, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 1 מ"מ PMSF. Homogenize ולשבש את התאים כמתואר ב2.4 ו -2.5.
  4. מייד בצנטריפוגה התאים lysate על 10,000 XG במשך 20 דקות. זורק את הכדור. סנן את supernatant עם משפך ביכנר מצויד ב3 שכבות של נייר סינון. החל ואקום עדין. כדי למנוע הקצפת יתר, לשמור על ארלנמייר הוואקום על קרח במהלך סינון.
  5. קביעת ריכוז חלבון על פי 14 ברדפורד.

4. ג'ל סינון כרומטוגרפיה

  1. לאזן 16x70 בז'קטים מים (200) טור סינון ג'ל עם 50 מ"מ טריס-HCl, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. טען על טור תמצית החלבון המסיס. לרזולוציה אופטימלית, להשתמש מדגם לולאת 1 מיליליטר. לבצע כרומטוגרפיה על 0.6 מיליליטר / דקה. לשמור על טמפרטורת טור ב 4 מעלות צלזיוס לאורך כל דרך.
  2. לאסוף 0.9 מיליליטר שברים ולנתח אותם על ידי SDS-PAGE. העברת 20 μl של כל חלק רלוונטי לצינורות Eppendorf המכילים 60 μl של H 2 O ו -20 μl של חיץ טעינה (250 טריס-HCl pH 6.8 מ"מ, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v גליצרול / v), 0.25% (w / v) bromophenol הכחול) ולהרתיח במשך 5 דקות. עומס 18 μl של כל דגימה ולבצע אלקטרופורזה ב 140 V לכ -1.5 שעות.
  3. לקבוע את exonuclease 3'-5 'ופעילות DNA פולימרז של כל חלק ב96-ll microplates. Assay פעילות exonuclease באמצעות אסתר thymidine 5'-monophosphate p-nitrophenyl (עמ 'NP-TMP) כמצע 15. להעריך את פעילות ה- DNA פולימראז באמצעות PPX (Pyrophosphatase, phosphorylase nucleoside Purine, מונואמין Xanthine) מצמידים אנזים assay 16 ו2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) כלוריד -5-פניל-2H-tetrazolium (INT) כמקבל אלקטרונים 16.

5. ניתוח מוטציה של אוכלוסיות Co-המבטאת את מקטע ε Wild-הסוג של א ' coli DNA פולימראז III וmutagenic εD12A Variant

  1. העבר את מושבה אחת של E. coli TOP10 מכיל pBAD-ε ווקטורי pGOOD1-εD12A 11 עד 1 מיליליטר של מדיום LB-אנטיביוטיקה. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. לדלל את הקדם-תרבות 1: 250 ב 3 צלוחיות המכילות בינוני טרי (10 מיליליטר), להוסיף inducers המתאים (arabinose, IPTG, או arabinose וIPTG, 1 מ"מ כל אחד) ולדגור על 37 מעלות צלזיוסבמשך 8 שעות. הכן בתרבויות מושרה שאינן מקבילות.
  3. לאסוף aliquots של 1 מיליליטר, ואז לדלל 1: 500 בצלוחיות חדשות המכילות בינוני טרי (10 מיליליטר) בתוספת או לא עם inducers המתאים. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. חזור על שלבים 5.2 ו -5.3 ולאסוף aliquots של 1 מיליליטר.
  5. לקבוע את מספר הדורות התרחש בכל תרבות. העבר על צלחות LB, של דילולים סדרתי המתאימים של הבידוד ותרבות 100 μl. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס. ספירת המושבות על צלחות LB, ולחשב את היומן של מספר תאים הנמצאים בבידוד (יומן I) ובתרבות בסוף הצמיחה (יומן C). כדי לקבוע את מספר הדורות, השתמש בנוסחה: (יומן C - להיכנס I) /0.301.
  6. צנטריפוגה בXG 5000 עבור 20 דקות וresuspend התאים 1 מיליליטר של 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 50 מ"מ NaCl. לpermeabilize התאים, להוסיף 2-3 טיפות של כלורופורם ומערבולת למשך 20 שניות.
  7. לקבוע את β-פעילות glucosidase של כל aliquot בmicroplate 96-היטב, באמצעות -nitrophenyl-β-D-glucopyranoside p (PNPGluc) כמצע. הוסף לכל טוב של תאי permeabilized 100 μl ושל מצע 100 μl (16 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות בH 2 O). תשמור על עצמך כדי למנוע בועות אוויר בבארות. קראו את הספיגה ב 420 ננומטר, באמצעות קורא microplate והמסנן המתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מקטע ε של א ' coli DNA פולימראז III מורכב של 243 חומצות אמינו ותכונות מסיסות עניה 17,18, אלא אם כן השאריות 187-243 נמחקות 17. עם זאת, יש לנו הראינו בעבר 11 ששיתוף הביטוי של α באורך מלא, ε, ותת-יחידות θ מניב DNA פולימרז המסיס III ליבת קטליטי (איור 1). בפרט, באמצעות מערכת שיתוף ביטוי pBAD-pGOOD, הראינו כי: i) ביטוי היתר של α ויחידות משנת ε ניתן לשלוט באופן עצמאי על ידי arabinose וIPTG, בהתאמה (איור 1 א);...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חלבונים יכולים להיות במהות סדר, הכוללים אזורים שיישוני מבנה אינו מוגבלת למספר מצומצם של תצורות 25. חלבוני הפרעות אלה הם בדרך כלל נוטים לצבירה 25, והבידוד והאפיון שלהם עשוי לייצג משימה קשה. מקטע ε של א ' פולימראז coli DNA III כולל שני תחומים שונים 26,27, כלומר: תחום N-ter i), הנושא את פעילות exonuclease '3'-5, ומוסמך במחייב מקטע θ; ii) תחום C-ter, אחראי לקשירה לα המקטע (פולימראז). תחום C-ter של ε ידוע להעניק מסיסות עניה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

הרשות על ידי Springer וElsevier הדפס דמויות היא הודתה מאוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרסיגמא-אולדריץ'A1296
אמפיציליןסיגמא-אולדריץ'A9518
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'288306
EDTAסיגמא-אולדריץEDS
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516
INTסיגמא-אולדריץ'I8377
IPTGסיגמא-אולדריץ'I5502
KClסיגמא-אולדריץ'P9541
L-ערבינוזסיגמא-אולדריץ'A3256
MgCl<תת>2סיגמא-אולדריץ'M2670
NaClסיגמא-אולדריץ'31434
PMSFסיגמא-אולדריץ'P7626
PNP-גלוקסיגמא-אולדריץ'N7006
pNP-TMPסיגמא-אולדריץ'T0251
טטרציקליןסיגמא-אולדריץ'87128
בסיס טריזמה סיגמא-אולדריץ'T1503
טריפטוןסיגמא-אולדריץ'95039
תמצית שמריםפלוקה70161
תמיסת אקרילאמיד 30%BioRad161-0158עבור אלקטרופורזה של ג'ל
אמוניום פרסולפטBioRad161-0700עבור אלקטרופורזה של ג'ל
GlycineBioRad161-0718עבור ג'ל אלקטרופורזה
SDSBioRad161-0302לאלקטרופורזה של ג'ל
TEMEDBioRad161-0800לאלקטרופורזה של ג'ל
TrisBioRad161-0719לאלקטרופורזה של ג'ל
Cuvettes 0.1 ס"מBioRad1652089לאלקטרופורציה
צנטריפוגה 5415REppendorf
צנטריפוגה אלגרה 21Rבקמן
כרומטוגרפיה מכשיר GradiFracPharmacia Biotech
Gene Pulser II אלקטרופורציהBioRad
Microplate Reader 550Biorad
MiniProtean 3 תאיםBioRad
ספק כוחBioRad
סוניקטור 3000מיסוניקס
'

מקורות

  1. Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
  2. Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
  3. Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
  4. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  5. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
  6. Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
  7. Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
  8. Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
  9. Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
  10. Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43(2007).
  11. Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
  12. Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  13. McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
  16. Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
  17. DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
  18. Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
  19. Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
  20. Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
  21. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  22. Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
  23. Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
  24. Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
  25. Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
  26. Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
  27. Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
  28. Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
  29. Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
  30. Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
  31. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  32. Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

הרכבת קומפלקס חלבוניםסינון ג'לSDS-PAGEבדיקות אנזימטיותטרנספורמציה של פלסמידריכוז אינדוקטורניתוח תדירות מוטציותבדיקת תאימות תתי-יחידות
תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.