הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

12K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52505

⸱

26 בינואר 2015

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Division of Allergy and Immunology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

במאמר זה

סיכום

המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה.

תקציר

תאי פיטום (MC) הם תאי הפרשה של המערכת החיסונית שלהשיג פונקציות הפיזיולוגיות ופתולוגיים שלהם על ידי שחרור מתווכים אלרגיים, דלקת וimmunoregulatory מראש יצר ומסונתזים חדש. המתווכים 'MCs משפיעים על רקמות ואיברים מרובים שהגיעו לשיא בתגובות אלרגיות וחיסוניות. הסינתזה, האחסון והשחרור של מתווכי MC קבוע בתקנות. המתווכים מראש יצר עמוסים בגרגירי cytoplasmic הפרשה (SG) שלהתמזג עם קרום הפלזמה ולשחרר את התוכן שלהם על ידי exocytosis המוסדר. אנו מציגים פרוטוקול, המבוסס על שיתוף הביטוי של גן של עניין עם גן כתב כי הוא ממוקד לSGS והוא שוחרר באופן מוסדר לצד מתווכי SG אנדוגני. הפרוטוקול מאפשר רזולוציה גבוהה ארבעה confocal ממדי ניתוחים של SGS MC וניטור ציר זמנם מbiogenesis לexocytosis מופעל. לפיכך, שימוש בפרוטוקול זה לסינון גנים של היתרest להשפעה פנוטיפי והפונקציונלית שלהם מאפשר פענוח המנגנונים המולקולריים השולטים בbiogenesis וexocytosis של SGS MC וזיהוי הרגולטורים מעורבים. וכך, תובנות נוספות המנגנונים התאיים שמהווים פונקצית MCs בבריאות ובמחלה צריכה להינתן.

מבוא

תאי פיטום (MC) הם תאים חיסוניים שידועות כי הם הטובים ביותר על מעורבותם בתגובות אלרגיות ודלקתיות כגון דלקת פרקים, אסטמה, דלקת ושט אאוזינופילית, דלקת עור כרונית והלם אנפילקטי 1,2 כמו גם פתולוגיות אחרות, כוללים מחלת לב כלילית 3.5 ו סרטן 3,4. בנוסף, מנחים ממלאים תפקידים חשובים בחסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות, גם בהגנת מארחת נגד חיידקים וטפילים ועל ידי דיכוי של מערכת חיסונית, למשל גרימת סובלנות שתל 5,6.

מנחי מקורן מח העצם, מתפתח מתאי CD34 pluripotent + / CD117 + 7. אבות MC מח עצם מחויב משתחררים לזרם הדם ונודדים לרקמות היקפי לוקליזציה בעיקר בתוך רקמות חיבור ומשטחי אפיתל 8. הבשלה והתמיינות מסוף מושגות סופו של דבר תחת השפעת of ציטוקינים בתוך 8,9 הסביבה שמסביב.

יכולים להיות מופעלים על ידי מנחים אלרגן (אנטיגן, Ag), מפגש שהסתיים בדור של E אימונוגלובולינים (IgE) הקלד נוגדנים. כריכה של IgE כזה לקולטנים FcεRI של MC, ואחריו cross-linking של תא קשור IgE על חשיפה מחדש לאותו Ag, תוצאות בצבירת FcεRI וייזום מפל איתות שמגיע לשיאו בdegranulation תא [שנסקרו ב10,11] . מנחים גם הופעלו, באופן בלתי תלוי IgE, על ידי נוירו 5,12, רעלי 13, חיידקים ואנטיגנים נגיפיים 14,15, מספר פפטידים בעלי מטען חשמלי חיוביים המכונים ביחד secretagogues הבסיסי, תאים וציטוקינים 5,13,12,16 חיסוניים , 17. מנחים גם מופעלים על ידי רב של המתווכים שלהם שוחררו, אשר עוד להגביר את התגובה הדלקתית.

מנחים הם ארוזים עם גרגירי הפרשה (SGS) המכילים חיסונימתווכי רגולציה, כוללים אמינים vasoactive, כגון היסטמין וסרוטונין (במכרסמים), proteoglycans, פרוטאזות, כגון chymase וtryptase, גורם גדילה של אנדותל כלי דם וכמה ציטוקינים וכמוקינים 8,9. מתווכים אלה הם "מוכנים ללכת" ופעם אחת MCs מופעל על ידי גירוי מתאים, מתווכים אלה משתחררים מהתאים על ידי exocytosis המוסדר (degranulation) בעניין של שניות עד דקות 18,19. אירוע ראשוני זה ואחריו סינתזת דה נובו ושחרורו של מגוון רחב של חומרים ביולוגיים חזקים, כוללים מטבוליטים הארכידונית חומצה, ציטוקינים מרובים וכמוקינים 20,21,22. שחרור של מוצרים מסונתזים חדש מתרחש באופן עצמאי של שחרור SG. באופן קולקטיבי, מתווכים אלה ליזום מוקדמים ושלב מאוחר דלקתי ואלרגי תגובות. לכן, הבנת המנגנונים המהווים הפעלת MC וdegranulation שניהם של שד תיאורטי וקליניortance.

הקושי לתמרן גנטי MCs הראשוני והתרבותי שהקשה על הניסיונות להבהיר את המנגנונים העומדים בבסיס degranulation MC, שנשאר גרוע נפתר. מנחים כדי להתגבר על בעיה זו פיתחנו מבוסס assay כתב ידי, לוקמיה basophilic עכברוש קו תא פיטום ברירית transfecting-שיתוף (RBL) -2H3 (המכונים במסמך זה כלRBL) או מח עצם נגזרים (BMMCs) 30 עם גן של עניין ו Neuropeptide Y (NPY) התמזג RFP monomeric (mRFP), ככתב SG.

NPY הוצג בעבר לשחזר את התנהגותם של סמני SG אנדוגני במערכות אחרות. יתר על כן, מכיוון שקרינת mRFP הוא pH רגיש, ביטוי של NPY-mRFP מאפשר הדמיה של SGS חומציים כמו גם הערכה כמותית של exocytosis באמצעות 96-גם צלחות וקורא צלחת הקרינה. הראינו כי NPY-mRFP מועבר לSGS חומצי של תאי RBL וBMMCs והוא שוחרר מהתאיםבאופן מוסדר לצד מטען SG אנדוגני (כלומר, β-hexosaminidase וסרוטונין) 30, 32. פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה המבוססת על הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרת גני הקרנה של עניין לפנוטיפי שלהם והשפעה תפקודית על מאפייני SG וdegranulation בתאי RBL 32. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר מעקב בזמן אמת של MC SGS וכימות של האזור שלהם או גודל נפח, מספרם, קינטיקה של הרכבה, תנועתם לאורך שלד תא התא וההיתוך האולטימטיבי שלהם עם קרום הפלזמה בתנאים שונים. לדוגמא, רגישות התאים עם DNP-הספציפי IgE ומפעיל את התאים עם Ag רב-ערכי (אלבומין בסרום מצומדות DNP) תחת הפרעות שונות (כלומר, מציאה של גנים של עניין, על ביטוי של גני WT או מוטציה, או מניפולציות תרופתיות) ו השוואה לשלוט תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת Cell RBL תרבות מדיה

  1. מערבבים 500 מיליליטר של המדיום של הנשר שונה של גלוקוז הנמוך Dulbecco (DMEM) עם 56 מיליליטר של סרום שור עוברי (זה עושה 10% FBS), ולאחר מכן להוסיף 5.5 מיליליטר של סטרפטומיצין פניצילין (זה עושה דברה ~ 1%).
  2. סנן את התקשורת באמצעות מסנני אבק בקבוק למעלה 500-1,000 מיליליטר עם גודל הנקבובית 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.

2. תרבות של תאי RBL

  1. לגדל תאי RBL באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס בשתי צלחות או צלוחיות. תאי RBL שגדלים בצלחות 10 סנטימטר צריכים להיות בתוספת 10 מיליליטר בינוני וליצור monolayer ומחוברות של ~ 10 7 תאים / צלחת.
  2. כאשר שכבת התאים מתקרבת מפגש, replate התרבות בצפיפות נמוכה יותר.
    1. הסר את מדיום התרבות מהצלחת / הבקבוק בעזרת פיפטה פסטר סטרילי מחוברת לואקום.
    2. יש לשטוף את monolayer התא עם prewarmed (37מעלות צלזיוס) 0.25% טריפסין / EDTA המכסה את כל monolayer (הנפח תלוי בגודל של צלחת התרבות / בקבוק; 2 מיליליטר במשך 10 צלחת סנטימטרים). זה לנתק את התאים.
    3. לחלופין, לשטוף את monolayer התא עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), להסיר את PBS ולהוסיף (37 ° C) טריפסין prewarmed / EDTA. צעד זה מנתק את התאים מהירים יותר.
    4. מניחים את הצלחת / הבקבוק באינקובטור ב 37 ° C (לא יותר מ -10 דקות).
    5. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ האופטי כדי לבדוק אם הם מנותקים. אם התאים לא לנתק אחרי 10 דקות, לטפוח בעדינות על הצלחת / הבקבוק.
    6. הוסף בינוני לצלחת התרבות / הבקבוק להשעות את התאים (הנפח של המדיום צריך להיות לפחות פי 2 יותר גדולים מהנפח של פתרון טריפסין).
    7. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 גרם ב 25 ° C.
    8. Resuspend התאים בינוניים. לדלל את התאים על ידי 01:10 וזרע בצלחת התרבות חדשה. דגירה התאים במשך 48-72 שעות, עד שהם reacמפגש כ -90% h.
    9. חזור על אותו ההליך (סעיף 2.2.1-2.2.8) לתקופה של עד 3 חודשים (30 קטעים).

3. הכנת Transfection מדיה.

  1. הכן פתרון 100 מ"מ של K-צינורות pH 7, 1 פתרון מ"מ של אצטט Ca 2 + ו -100 מ"מ פתרון של אצטט Mg 2 +.
  2. לדלל את הפתרון של pH K-צינורות 7 מ"מ 100 ל -20 מ"מ באמצעות תקשורת DMEM, להוסיף את פתרון 1 מ"מ של אצטט Ca 2 + לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו -100 מ"מ פתרון של אצטט Mg 2 + לריכוז סופי של 2 מ"מ.
  3. שוקל גלוטמט אשלגן ולהוסיף לפתרון לריכוז סופי של 128 מ"מ, ומערבב היטב ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. שמור את הפתרונות שנותרו (כלומר., K-צינורות, Ca 2 + אצטט, Mg 2 + אצטט) ב -20 ° C.

4. Transfection של תאי RBL

  1. הסר את מדיום התרבות מהצלחת / הבקבוק באמצעותפיפטה פסטר סטרילי מחוברת לואקום.
  2. יש לשטוף את monolayer התא עם prewarmed טריפסין (37 מעלות צלזיוס) / EDTA צריך שמכסה את כל השכבה. מניחים את הצלחת / הבקבוק באינקובטור ב 37 ° C (לא יותר מ -10 דקות). בדקו אם התאים יש מנותקים באמצעות מיקרוסקופ האופטי.
  3. הוסף בינוני לצלחת התרבות / הבקבוק להשעות את התאים (הנפח של התקשורת צריך להיות לפחות 2-גדולים יותר מאשר הנפח של פתרון טריפסין).
  4. לספור את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
  5. גלולה 1.5 × 10 7 תאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 XG ב 25 ° C. מחק את supernatants ולהוסיף 280 μl של מדיום transfection. העבר את תערובת התגובה ל -4 קובט מ"מ.
  6. הוסף 20 מיקרוגרם של פלסמיד NPY-mRFP וגם 30 מיקרוגרם של פלסמיד הריק שליטה או פלסמיד נבדק. הנפח הסופי של תערובת התגובה צריך להיות 300 μl.
  7. מייד מניח על קרח במשך 10 דקות. נגב את קובט ממים וp שיירroceed לelectroporation ב 300 V ל9 msec.
  8. למדידות של exocytosis, replate התאים באופן מיידי ב -24 מנות בתרבית רקמה המכילות גם 300 בינוני μl. הוסף 8 μl של תערובת התגובה (4 × 10 5 תאים) זה טוב. להוסיף תאי transfected 4 שאינם × 10 5 לבארות נוספות לשליטה. הכן מספיק בארות ליש לפחות לשכפל בארות עבור כל טיפול לכל transfection.
  9. למיקרוסקופיה זמן לשגות, replate התאים באופן מיידי במערכת coverglass הקאמרית ורוסיליקט 8-היטב המכילה 80 בינוני μl. להוסיף 1.5 μl של תערובת התגובה (7.5 × 10 4 תאים) לכל תא. (נסה להימנע משימוש בתאי בקצה coverglass, התאים במרכז coverglass קלים יותר לתמונה).
    הערה: חשוב לציין, שלא כל תאי תגובה להדק ולעתים מיקרוסקופיה הזמן לשגות היא בטלה כתוצאה מאובדן המיקוד וסחיפה של borosi קאמרי 8 היטבמערכת coverglass licate. לכן, להכין לפחות 8 תאים עבור כל טיפול לכל transfection.
  10. לרגישות התאים להפעלה בתיווך FcεRI, להוסיף 1 מיקרוגרם / מיליליטר של DNP העכבר חד שבטי ספציפיים IgE לתקשורת (דגירה התאים עם IgE לפחות 2 שעות).
  11. לאחר 18-24 שעות להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שהתאים להביע פלסמידים. אורכי גל העירור ופליטה של ​​הקרינה mRFP הם: 584 λEx, λEm 607 ננומטר. NPY-mRFP אמורה להופיע במבני לפוחי שהמתאימים לSGS. אם הגן השני של עניין הוא התמזגה לתג פלורסנט להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את שיתוף הביטוי של שני פלסמידים באותו התאים. לדוגמא, אם הגן נבדק התמזג GFP, אורכי גל העירור ופליטה של ​​הקרינה GFP הם: 488 λEx, λEm 507 ננומטר. חלבון GFP מתויג אמור להופיע באותו תאים המבטאים NPY-mRFP.
  12. למדידות exocytosis להמשיך to שלב 5 ולמיקרוסקופיה הזמן לשגות, המשך לשלב 6.

5. מדידת NPY-mRFP Exocytosis

  1. הכנת חיץ Tyrode:
    1. הכן פתרון של 54 מ"מ KCl, 20 מ"מ MgCl 2, 2.74 M NaCl ו -8 מ"מ לאא 2 PO 4 בDDW. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. צעד זה נועד להכנת 20x חיץ Tyrode.
    2. הכן פתרון של 20 מ"מ Hepes pH 7, 1.8 מ"מ CaCl 2, 1 מ"ג / מיליליטר BSA, גלוקוז 5.6 מ"מ ו1 עד 20 דילול של Tyrode 20x בDDW ומערבבים היטב. צעד זה נועד להכנת מאגר 1x Tyrode.
    3. Aliquot מאגר 1x Tyrode ולאחסן ב -20 ° C. הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.
  2. הסר את מדיום התרבות מהצלחת גם 24 ולשטוף 3 פעמים עם חיץ Tyrode. הכן תאי unstimulated ידי הוספת חיץ Tyrode 200 μl לשלוט בארות.
  3. הכן 10 μl / טוב של 20X מרוכז הפעלה מגיב [(למשל 1,000 ng / DNP-BSA מיליליטר או DNP-HSA (Ag), 200 ionophore 2 + מיקרומטר Ca (למשל A23187), ושילוב של 20 מיקרומטר Ca 2 + ionophore ו1,000 ננומטר tetradecanoylphorbol-13-אצטט 12-O- (TPA)]. אם ריאגנטים מאוחסנים בDMSO, לדלל את ריאגנטים ל20x ריכוז במאגר Tyrode המכיל 1% DMSO. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. הסר את supernatants של כל טוב בזהירות לצלחת גם 96, מניח על קרח ולהימנע מהאור. (Supernatants מכיל פפטיד chimeric NPY-mRFP ששוחרר מהתאים).
  5. הוסף 200 μl חיץ Tyrode המכיל 0.5% Triton X-100 זה טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. (שלב זה חשוב להכנת lysates תא המכיל את שנותר מNPY-mRFP שלא שוחרר מהתאים). לאסוף lysates התא ולהעביר לצלחת גם 96, מניח על קרח ולהימנע מהאור.
  6. למדוד את הקרינה של supernatants התא וlysates תא באמצעות fluorescקורא צלחת ence, באמצעות 590-, 20 ננומטר רוחב פס עירור מסנן ו635-, מסנן פליטת רוחב פס 35 ננומטר.
  7. לחשב את אחוז NPY-mRFP שוחרר:
    הערה: מדד הקרינה קורא יחידות הקרינה שרירותית (עפו). ערכים עפו תלויים במכונה ואת הרגישות שלו ואת יעילות transfection.
    1. הגדר את autofluorescence של תאי RBL nontransfected ריקים. מחלקים את עפו של כל supernatant לקרינה הכוללת (עפו של supernatants + עפו של lysate המקביל) ולהכפיל ב -100.

6. זמן לשגות מיקרוסקופית של Exocytosis

  1. זרע 7.5 × 10 4 תאים / תא transfected במערכת coverglass קאמרי ורוסיליקט 8 היטב. לאחר 18-24 שעות, להסיר את מדיום התרבות מהתאים ולשטוף 3 פעמים עם חיץ Tyrode
  2. להוסיף 72 μl של חיץ Tyrode לכל תא. לדלל את ריאגנטים הפעלה במאגר Tyrode ל10x ריכוז.
  3. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal מצויד בחדר מחומם (37 מעלות צלזיוס) ו- CO 2 בקר (4.8%) ואובייקטיבי 40X או 63X. הפעל את מערכות מיקרוסקופ: מנורת כספית, מחשב, ולייזרים. ודא שהחדר המחומם הוא בטמפרטורה הנכונה לפני תחילת הניסוי.
  4. מניחים את החדר בחדר המחומם ולוודא כי התא מותקן בצורה נכונה ויציב.
  5. להדליק את אור פלואורסצנטי לפי fluorophore הרלוונטי ולדמיין תאי transfected. כבה את הקרינה פעם בתא של עניין הוא בתחום על מנת למזער הלבנה וcytotoxicity. חשוב שהתחום זה יכיל כ 2-3 תאי transfected. תאי transfected צריכים להתפשט גם, אבל לא נוגעים זה בזה.
  6. להתאים את כוח הלייזר (תלוי במיקרוסקופ) כדי למזער את הרעש וoversaturation כמו גם רעילות, ולהגדיר את הרווח לקזז לשנות את יחס האות לרעש. סריקה מהירה באו der כדי למזער את משך חשיפת לייזר (ממוצע 2).
  7. התאם את גודל חריר למקסימום, זה מאפשר להקטין את כוח הלייזר ולשמור תמונות ממוקדות לתקופה ארוכה של זמן. אם תרצה, להגדיר את הפרמטרים למחסנית Z לשחזר את התמונה בשלוש ממדי סריקה, להתאים את גודל חריר ליחידה אוורירית 1 (AU) שנותן את האות הטוב ביותר יחס רעש ולרכוש רצופה של פרוסות אופטיות confocal דו-ממדיות ב -axes z עם פרוסות אופטיות ≤0.7 מיקרומטר.
  8. להגדיר את זמן ההפסקה בין כל רכישה 15-30 שניות ומשך הרכישה כוללת של 15 דקות ולהתחיל לרכוש תמונות. לאחר 5 דקות של רכישה להשהות את סדרת הזמן. הוסף 8 μl של ההדק 10x ולהמשיך הרכישה באופן מיידי.
  9. שמור את התמונות, לבצע deconvolution באמצעות תוכנת deconvolution ולשחזר את הערימות לשלוש תמונות ממדיות ולסרט באמצעות תוכנת Imaris.

s = "jove_title"> 7. ניתוח תמונה

  1. לייבא נתונים מתמונות סדרת זמן deconvoluted שהתקבלו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal לתוכנת Imaris. תוכנה זו קוראת יותר מ -40 קבצי מיקרוסקופיה. אם התוכנה לא יכולה לקרוא את הקבצים; להמיר את הקבצים לקבצים ויבוא tif.
  2. כדי להוסיף נקודות זמן לסיום עריכה לחץ על Set נתונים פתוח -> הוסף נקודות זמן ולייבא את הנתונים החדשים שנקבעו.
  3. צור פני השטח של ערוץ mRFP שימוש באפשרות אשף פני השטח. בחר אלגוריתם ברירת המחדל. בחר הערוץ של NPY-mRFP. סמן את אפשרות ההחלקה כדי להפחית את הרעש. כדי למנוע אובדן של פרטים קטנים להפחית את רמת פירוט אזור 0.05 מיקרומטר.
  4. הגדר את סף העצמה. משטח אפור חדש יוצג. עבור אל "הגדרות" ולעבור את הסגנון מ" נקודת מרכז "עד" Surface ".
  5. עבור לכרטיסיית נתון במאפיינים של אובייקט שנבחר, בחר בכרטיסייה מפורטת וsuc הערך הספציפיh כעוצמת הקרינה, נפח וכו '
  6. סקור את הנתונים ולוודא שהערכים תואמים לתמונות. לדוגמא, שתיים או יותר גרגרים סמוכים עשויים להימדד כגרגיר אחד גדול. לכימות גודל הגרגר הממוצע לחלק את גודל הגרגרים הממוזגים למספר האמיתי של גרגרים.
  7. לייצא את ערכות נתונים הרצויות לקבצי Excel ולנתח את הנתונים.
f

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בגלל יעילות transfection הנמוכה של MCS, מניפולציות גנטיות צפויים לעזוב השפעה על קריאות של הפרשה ממוצעת שנמדדו על ידי מתווכי SGS אנדוגני. אף על פי כן, על ידי הקמת שיתוף ביטוי מלא של גן הכתב NPY-mRFP ופלסמיד שיתוף transfected באותו התאים, ניטור של תוצאות NPY-mRFP בניטור באופן בלעדי אוכלוסיית התאים המבטאת את הגן של עניין. לכן, היתרון של assay זה בהשוואה לשיטות קונבנציונליות הוא היכולת לנטר באופן סלקטיבי תאי מניפולציות גנטיים (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מתארים אסטרטגיה חדשנית המשלבת כימות של exocytosis המנחים וארבעה (x, y, z, t) quantifications ממד על ידי הדמיה תלת-ממדית-פקע זמן של SGS בתאים חיים באמצעות גן מדווח לexocytosis. טכניקה זו מאפשרת הקרנה של משפחות של חלבונים להשפעתם על תפקוד MC כגון SGS הניטור מתחילות כבר ביציאתם מGolgi דרך התבגרותם, רכישה של מיומנות exocytosis וdegranulation. השילוב של מדידות של exocytosis יחד עם אפיוני morphometric והקינטית של SGS מספק תובנות המנגנונים שבאמצעותם החלבונים נבדקו לתווך פונקציות MC. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים כספיים.

תודות

אנו מודים לד"ר א Ashery על המתנה של NPY-mRFP cDNA. אנו מודים בני הזוג. MJ Kofron, ל 'מיטלמן, מ' שרבני, וי 'זילברשטיין לסיוע לא יסולא בפז עם מיקרוסקופ ותמונת ניתוחים. כמו כן, אנו מודים לד"ר יוסף אורלי לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע, שנוסד על ידי האקדמיה הלאומית הישראלית למדעים (1139-1112 לRS-E.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMSigma-AldrichD6046-500MLחם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
סרום בקר עובריGE בריאות מדעי החייםSH30071.01
פניצילין-סטרפטומיציןטכנולוגיות
קרום אצטט תאית, גודל נקבוביות 0.22  μ mSigma-AldrichCLS430769-1EA
מנות תרבית שטופלו בתרבית רקמות קורנינגSigma-AldrichCLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE)Life טכנולוגיותR001100חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש
צינורות מלח דיפוטסיוםסיגמא-אולדריץ'108321-27-3 
סידן אצטט הידרטסיגמא-אולדריץ'114460-21-8
מגנזיום אצטט טטרה-הידרטסיגמא-אולדריץ'M5661 
חומצה L-גלוטמית מלח אשלגן מונוהידראט (אשלגן גלוטמט)Sigma-AldrichG1501
4 מ"מ אלקטרופורציה קובטותפרויקטים של תאיםEP-104
GENE PULSER עם בקר דופק & CAPACITANCEBio rad
Chambered CoverglassThermo Scientific155411
24 בארות, תחתית שטוחהSigma-AldrichCLS3524
Corning 96 צלחות בארSigma-AldrichCLS3367 או CLS390
96 באר קורא פלואורסצנטי צלחת- אינסופי 200Tecan
סידן ionophore A23187סיגמא-אולדריץ'C7522הימנע מחשיפה ישירה לאור
12-O-tetradecanoyl-13-אצטט (TPA)CalbiochemP3766
אנטי-DNP חד-שבטי IgEסיגמא-אולדריץ'D8406 
DNP-BSA/DNP-HASSigma-AldrichA6661הימנע מחשיפה ישירה לאור
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787
מיקרוסקופ פלורסנט קונפוקלי:
Zeiss LSM 510
LeicaSP5
Nikon A1 הפוך
תוכנת אימאריסBITLANE
מיקרוסופט אקסל או פריזמה או תוכנות
מגיב אחר:
מגנזיום כלורידMERK5833
נתרן כלוריMERK6404
סידן כלורי MERK2382
אלבומין סרום בקר סיגמא-אולדריץ'A4503
גלוקוזBDH מעבדות284515V
מונוסודיום פוספט MERK5345
סטריליים
חייםאנליזות אחרותמים

מקורות

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214(2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134(2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביוגנזה של גרנולות הפרשהאקסוציטוזה מווסתתמיקרוסקופיה קונפוקליתגן דגל פלואורסצנטיביטוי משותף של גניםניתוח מורפומטרימדידת עוצמת פלואורסצנציהגירוי באמצעות יוניפור של סידןמוטציה של Rab5
חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.