בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

סיכום

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

תקציר

microdissection ללכוד לייזר (LCM) מאפשר הבידוד של תאים ספציפיים מסעיפי רקמות דקים עם רזולוציה מרחבית גבוהה. LCM האפקטיבי דורש זיהוי מדויק של תת-אוכלוסיות תאים מרקמות הטרוגנית. זיהוי של תאים בעלי העניין לLCM מבוסס בדרך כלל על קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי. השילוב של LCM וimmunolabeling המהיר מציע אמצעים חלופיים ויעילים כדי להמחיש סוגי תאים מסוימים ולבודד אותם מרקמה הסובבת. RNA באיכות גבוהה אז יכול להיות שחולץ מאוכלוסיית תא טהורה ועיבוד נוסף ליישומים במורד הזרם, כולל RNA-רצף, microarray או qRT-PCR. גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים. מטרתו של מאמר זה היא להמחיש כיצד לבצע immunolabeling המהיר של אוכלוסיית תא, תוך שמירה על שלמות RNA, ואיך לבודד תאים הספציפיים אלה באמצעות LCM. במסמך זה, אנו ממחישיםד הליך רב-שלבים זה על ידי immunolabeling ולכידת תאי דופאמין ברקמת מוח מעכברים ליום אחד-עשר. אנו מדגישים את שלבים קריטיים מפתח שראוי להתחשבות מיוחדת. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של רקמות ותאים של עניין. חוקרים מתחומים שונים צפויים ליהנות מההפגנה של גישה זו.

מבוא

המוח מורכב ממגוון גדול של סוגים שונים נוירון יוצרים רשתות מורכבות של. נוירונים אלה מאורגנים בקבוצות ותת-קבוצות שונות בהתאם לדפוס מורפולוגיה, הקישוריות וביטוי הגנים שלהם ^1. הפיתוח של microarrays, הרצף של הדור הבא, וqRT-PCR הציעו את האפשרות להשוות פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות נוירונים בהקשרים ביולוגיים שונים ^1,2. ניתוחים רגישים אלה דורשים זיהוי ובידוד המדויקים של סוגי תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA ^2-4. טכניקת פלורסנט הופעלה תא מיון (FACS) כבר בשימוש נרחב לבודד את סוגי תאים ספציפיים המבוססים על סמנים על פני קרום תא ו / או מורפולוגיה. FACS דורש צעד ניתוק תא לפני המיון, שתוצאתה אובדן הרזולוציה מרחבית ⁵ מלא. תת-אוכלוסיות עצביות רבות נבדלות זו מזו על פי ההתפלגות האנטומי שלהם בהמוח אלקטרוני. microdissection ללכוד לייזר מיושם על חלקים במוח דקים מספק אפשרות מתאימה לבידוד ספציפי של תאים עם רזולוציה מרחבית גבוהה ^6-8. מגבלה העיקרית של LCM הייתה הצורך לזהות תאים של עניין על פי קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי המהונדסים גנטי במודלים של בעלי חיים. הפיתוח של טכניקות חדשות לביצוע שיטות immunolabeling מהירות שהשתמרו שלמות RNA, בשילוב עם LCM, עכשיו מאפשר הבידוד של אוכלוסיות תאים להמשיך בניסויי פרופיל-גן.

גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים ^1,9-13. הנה, אנחנו מדגימים נוהל מפורט להשגת RNA באיכות גבוהה מקבוצת משנה ספציפית של תאים במבנה רקמה מורכב על ידי שילוב של immunolabeling מהיר עם LCM. אנו מראים כיצד לבצע שלבים קריטיים מפתח להשגת התאוששות RNA מקסימאלי ולהימנע משפלת RNA כפי שהוא עשוי sigהפרופיל של התבטאות הגנים השפעת nificantly.

להפגנה של פרוטוקול זה, נוירונים דופאמין מהמוח תיכון עכבר יום אחד-עשר היו ממוקדים. ניתן immunolabeled נוירונים דופאמין באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (TH), אנזים שער הגבלה לסינתזת דופמין. בעקבות immunostaining TH, בודד או קבוצות של נוירונים דופאמין אז יכול להיות מבודדות באמצעות LCM. תאי microdissected נאספים במאגר תמוגה, ו- RNA מופק באמצעות ערכת בידוד RNA. איכות וכמות של RNA שחולץ נמדדות באמצעות bioanalyzer ^5. ניתוח נוסף של ביטוי גנים באמצעות: רצף RNA, microarray, או qRT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע ^2,4,6. כדוגמא, שני שלבים qRT-PCR בא לידי הביטוי בתחומי דופאמין המבודד הלייזר שנתפס. כימות יחסי של רמות הביטוי של גני סמן נוירון שני דופאמין ממחיש את הסלקטיביות של פרוטוקול זה.

פרוטוקול

הערה: הניסויים בוצעו בהתאם למדריך הקנדי לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים Laval Université ההגנה.

הכנת 1. לדוגמא

הערה: בדוגמא זו, השתמשנו המוח של עכבר ביום הלידה 1.

1. השתמש בהרדמת היפותרמיה בקרח כתוש במשך 3 עד 4 דקות לגורים, ואז לנתח את המוח במהירות אפשרית במדיום L15 קר כקרח. לבצע שלב זה תוך 2 דקות.
2. מוח העברה גזור בהטבעת עובש (cf. רשימה של אמצעי) ולמלא עם תקשורת רקמה קפוא הטבעה מקפידה לכוון את הדגימה במיקום הרצוי. להקפיא דגימות מייד בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. לבצע שלב זה תוך 30 שניות.
   ניתן לאחסן דגימות כמה חודשים מבלי להתפשר על איכות RNA: הערה.

2. חתך

1. תעודת המקוריות קרום פינוקשקופיות זכוכית טד (cf. רשימה של חומר) עם פתרון טיהור RNAse פני השטח כדי לחסל כל זכר של RNAses. שטוף את השקופיות במי DEPC ולתת להם להתייבש. לחלופין, מגלשות לאפות הלילה ב 200 ° C.
2. העבר את הדגימות קפואות בcryostat ניקתה בעבר עם פתרון טיהור RNAse פני השטח. טמפרטורה שנקבעה cryostat הקאמרית ב -20 דגימות C ° ופרוסה בעובי 10 מיקרומטר. לאסוף חלקי רקמות בשקופיות הקרום מצופה ולתת להם להתייבש 10 דקות לפני הצביעה. לחלופין, חנות מחליקה ב -80 ° C עד צביעה.

3. הכנת פתרונות מכתים

1. הכן את כל הפתרונות רק לפני תחילת הניסוי, ולהשתמש במעכב RNAse בכל הפתרונות מכתים (פרט לפתרוני כביסה) כדי למנוע השפלה RNA.
2. הכן את פתרון החיץ. השתמש באותו החיץ בכל הפתרונות (מורכב מפוספט שנאגרו מלוח RNAse חינם (PBS) בתוספת של BSA 1%,טריטון 0.2% ו -2% מעכב RNAse). עבור כל שקופית, להכין 400 μl של פתרון חיץ (200 μl לעיקרי ו -200 μl לנוגדנים משני).
3. הכן את הפתרון מקבע: להשתמש באתנול 70% המשיך ב -20 ° C. שמור הליך קיבעון רקמות מינימאלי כדי למנוע ירידה דרסטית בתשואות הפקת RNA.
   הערה: לחלופין, להשתמש 95% אתנול פתרון בתוספת של 5% חומצה אצטית המשיך ב -20 ° C.
4. הכן את פתרון הנוגדן הראשוני על ידי דילול הנוגדן הראשוני בפתרון החיץ. לתיוג נוירונים דופאמין, להשתמש נוגדן מיקוד hydroxylase טירוזין (TH, שיעור הגבלת אנזים לייצור דופמין). השתמש בריכוז גבוה של נוגדנים, כדי לפצות על זמן דגירה מהיר. השתמש נוגדן TH בדילול של 01:25.
   הערה: בפרוטוקול immunofluorescence נורמלי, נוגדן זה נותן איתות חזקה כאשר מודגרות לילה בדילול של 1: 1,000. בפרוטוקול זה, הוא משמש 40X תרכיזי יותראד בשל זמן דגירה הקצר. בשל הריכוז הגבוה של נוגדן המשמש לשיטה זו, לבצע immunostaining סטנדרטי במקביל על מנת לבדוק כל גידול בתיוג שאינו ספציפי.
5. הכן את פתרון נוגדנים משני על ידי דילול הנוגדנים משני בפתרון החיץ. השתמש נוגדנים משני biotinylated בריכוז של 1: 100.
   הערה: בדוגמא זו, השתמשנו נוגדני biotinylated נגד ארנב.
6. הכן את פתרון avidin ביוטין המורכב (ABC) לצורך זיהוי של נוגדנים משני biotinylated. הפוך פתרון ABC על ידי הוספת המתחם והמתחם B בריכוז של 1: 2% מעכב RNAse 100 מדוללים בDEPC PBS בתוספת. הכן את 30 דקות המורכבות avidin-ביוטין לפני הוספתו לשקופיות.

4. מכתים

1. להפשיר שקופיות אחד או שתיים בזמן מ-80 ° C על ידי מצליף אותם באוויר במהירות (או להשתמש במפוח אוויר). חלקי Surround עם הידרופוביעט ומחסום לתת יבש למשך כמה שניות.
   1. שים את השקופיות בפתרון מקבע הקר ללא יותר מ 5 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לנער פעם אחת באוויר כדי להסיר את העודפים של פתרון מקבע אז, במהירות לטבול שקופיות בזמנים DEPC PBS 6-8 לשטיפה.
   2. גרור את השקופיות כדי להסיר את העודפים של DEPC PBS. ודא ששקפי הפשרת צעד אינו עולים על 5 דקות.
2. מגלשות מקום על מגש נקי (קודם לכן בפתרון טיהור RNAse פני השטח כדי לחסל כל זכר של RNAses) ולשים 200 μl של פתרון הנוגדן הראשוני על כל שקופית (ארנב נגד TH) במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה וקפיציות שקופיות פעם אחת כדי להסיר את העודפים של DEPC PBS.
3. שים 200 μl של פתרון נוגדנים משני על כל שקופית במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות 3 פעמים בDEPC PBS לשטיפה וקפיציות שקופיות כדי להסיר את עודף DEPC PBS.
4. שים 200 μl של solu ABCtion על כל שקופית במשך 4 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה וקפיציות שקופיות כדי להסיר את DEPC עודף PBS.
5. הכן את DAB (diaminobenzidine 3,3) פתרון בדקות 4 של דגירה בפתרון ABC. השתמש בחומרים הכימיים המסופקים בערכה (קיט DAB Peroxidase מצע). לערבב 1 טיפה של חיץ סיפק, 1 טיפה של פתרון DAB ו1 טיפה של 30% H ₂ O ₂ ב2.5ml מים DEPC. מערבבים את הפתרון על ידי היפוך.
6. קח 196 μl של פתרון DAB ולהוסיף 4 μl (2%) של פתרון מעכב RNAse רק לפני הפצה בשקופיות. מגלשות מקום על מגש נקי (קודם לכן בפתרון טיהור RNAse משטח) ולשים 200 μl של פתרון DAB בשקופיות.
   הערה: פתרון DAB צריך להגיב within1 או 2 דקות.
7. טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה ולשים שקופיות לכמה שניות באתנול מוחלט. ייבש את השקופיות על ידי מצליף אותם באוויר (או להשתמש במפוח אוויר).
   הערה: שקופיות ניתן לאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי או מעובד לLCM.

Microdissection לכידה 5. לייזר

1. להפשיר שקופיות במהירות על ידי מצליף אותם באוויר (או להשתמש במפוח אוויר). ודא ששקפי הפשרת צעד אינו עולים על 5 דקות.
2. המשך LCM. מניחים את השקף מתחת למיקרוסקופ עם צד המדגם מול כובע צינור האיסוף. בחר את ההגדלה הטובה ביותר למדגם. התאם את המיקוד כדי לראות את התאים של עניין.
   1. הגדר את אזור החיתוך ולהתחיל לחתוך עם הלייזר. איסוף תאים או פיסת הרקמה בכובע צינור איסוף מלא 50 μl של חיץ תמוגה (מערכת חילוץ RNA) גזורים. ודא שהצעד של LCM אינו עולה על 30 דקות.
3. לחלץ RNA הכולל מהתאים מבודדים באמצעות ערכת חילוץ RNA (cf. רשימת חומרים). עקוב הפרוטוקול של היצרן.
   1. דגירה תאים שנאספו במשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס לlyse התאים. תנאי מוקדם עמודת טיהור RNA על ידי הוספת 250 μl של חיץ אוויר. עומס 50 μl של אתנול לתאי lysed. לטעון תאי lysed 100 μl על עמודת טיהור preconditioned.
   2. צנטריפוגה העמודה ב16,000 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף את העמודה פעמיים עם מאגרי כביסה. Elute בהיקף המינימלי המומלץ (11 μl) של המים RNase חינם (לא טופל DEPC כפי שעלול להפריע לbioanalyser). שמור 2 μl לאיכות בדיקה.
      הערה: כל הפתרונות לאספקת מים מסופקים בערכה.

6. cDNA סינתזה וכמוני RT-PCR

1. הפוך-לתמלל דגימות RNA מתאי דופאמין לייזר שנתפס לתוך ה- DNA משלים באמצעות transcriptase ההפוך ואוליגו (DT). עקוב הפרוטוקול של היצרן (cf. רשימה של חומר).
2. השתמש 1 μl של cDNA להגברת qRT-PCR עם פריימרים גן ספציפי. מחשבה PCR להגדירctions ב -20 μl נפח עם תערובת תגובת ההתחלה חמה אחד מרכיבים לPCR כמותי כפי שהומלץ על ידי היצרן. לבצע כל תגובה בשלושת עותקים.
   1. לניסויים שתוארו כאן, להשתמש בזוגות פריימר הבאים: GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); ה-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); Aadc-F (5'- CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 ') / Aadc-R (5'- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3 ").
3. לבצע הגברה RT-PCR באמצעות פרמטרי הרכיבה מהירים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו 45 מחזורים של 10 שניות 95 ° C, 10 שניות על 60 מעלות צלזיוס ו -10 שניות על 72 מעלות צלזיוס. לבצע ניתוח עקום התכה באמצעות הגדרת ברירת המחדל של המכשיר לdetermiהיווצרות מוצר הומוגני ne.
4. לנתח את הנתונים באמצעות התוכנה מובנית.
   1. לנרמל את ערכי הביטוי של גני סמני DA Th וAadc עם הביטוי של שני גני התייחסות GAPDH וRpl13a להשיג רמות ביטוי היחסית כפי שתואר לעיל ^14.

תוצאות

הליך immunolabeling מהיר זו מאפשר הדמיה של תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA. איור 1 מדגים את השלבים של הכנת רקמה לפני מיצוי RNA. לאחר cryosectioning, נוירונים דופאמין מסומנים באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (נוירונים שכותרתו מופיעים בחום). בהתאם לשאלה הניסיונית, יכולים להיות מבודד תאים בודדים או באזור גדול יותר של עניין באמצעות LCM (1D איור - E). חשוב להעריך את איכות RNA חילוץ, כRNA המושפל יהיה השפעה ניכרת על איכ...

דיון

הנקודה של שיטה זו הקריטית ביותר מורכבת בתיוג תאים של עניין תוך מניעת השפלה RNA. כRNAses פעיל בתמיסות מימיות, הפחתת זמני דגירה משפרת שימור RNA ^11,15. כל הפתרונות המשמשים צריכים להיות מטופל בDEPC כדי להשבית RNAses. כל החומרים והמשטחים צריכים להיות מטופלים עם פתרון טיהור RNAse פני השטח כדי למנוע זיהום RNAses. לבסוף, בתנאים אלה, התוספת של מעכב RNAse בכל הפתרונות יעילה בשמירה על RNA מלהיות מושפל. השימוש בתנאי מלח גבוהים מיושמים במהלך הדגירה נוגדן הוכח בעבר כיעיל בשמירה על RN...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שקופיות מצופות ממברנה	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 ומיקרו; m; 50 יחידות
פתרון טיהור RNAse פני השטח	טכנולוגיות חיים	AM9780	RNaseZap
Fixative			70% אתנול נשמר ב-20 מעלות; C
אנטי-TH	פל-פריז	P40101	1:25
		ללא RNAse	DEPC PBS + 1% BSA+0.02% טריטון
מעכב RNAse	Promega	N2615	מעכב רנזין פלוס Rnase 40 kU/ml (מלאי)
מעבדות וקטור	ביוטיניל נגד ארנב	BA-1000
Vectastain Elite ABC ערכת	מעבדות וקטור	PK-6100	8µ ליטר / מ"ל
ערכת מצע DAB פרוקסידאז	SK-4100		Vector
	Laboratories טכנולוגיות חיים	KIT0204	Arcturus PicoPure ערכת בידוד RNA
H2O2 30%	Sigma	HC4060
אתנול מערכת מיקרו-דיסקציה לייזר		מוחלטת
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent Agilent		2100 עובש הטמעת ביואנלייזר
	Leica Biosystems	14702218311	6x8 מ"מ
	Vector Laboratories	H-4000
מדיה להטמעת רקמות קפואות	Tissue-Tek	4583
שבב ביואנלייזר	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip בשימוש עם Agilent 2100 Bioanalyzer
תערובת תגובה להתחלה חמה עבור PCR כמותי		Roche 6402712001	התחלה מהירה חיוני DNA ירוק מאסטר
הפוך טרנסקריפטאז	חיים טכנולוגיות	11752-050	SuperScript III SuperMix סינתזה של גדיל ראשון עבור qRT-PCR