מאמר שיטה

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

DOI:

10.3791/52510

⸱

11 באפריל 2015

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Neurosciences, Faculty of Medicine, Université Laval, 2Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microdissection ללכוד לייזר (LCM) מאפשר הבידוד של תאים ספציפיים מסעיפי רקמות דקים עם רזולוציה מרחבית גבוהה. LCM האפקטיבי דורש זיהוי מדויק של תת-אוכלוסיות תאים מרקמות הטרוגנית. זיהוי של תאים בעלי העניין לLCM מבוסס בדרך כלל על קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי. השילוב של LCM וimmunolabeling המהיר מציע אמצעים חלופיים ויעילים כדי להמחיש סוגי תאים מסוימים ולבודד אותם מרקמה הסובבת. RNA באיכות גבוהה אז יכול להיות שחולץ מאוכלוסיית תא טהורה ועיבוד נוסף ליישומים במורד הזרם, כולל RNA-רצף, microarray או qRT-PCR. גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים. מטרתו של מאמר זה היא להמחיש כיצד לבצע immunolabeling המהיר של אוכלוסיית תא, תוך שמירה על שלמות RNA, ואיך לבודד תאים הספציפיים אלה באמצעות LCM. במסמך זה, אנו ממחישיםד הליך רב-שלבים זה על ידי immunolabeling ולכידת תאי דופאמין ברקמת מוח מעכברים ליום אחד-עשר. אנו מדגישים את שלבים קריטיים מפתח שראוי להתחשבות מיוחדת. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של רקמות ותאים של עניין. חוקרים מתחומים שונים צפויים ליהנות מההפגנה של גישה זו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוח מורכב ממגוון גדול של סוגים שונים נוירון יוצרים רשתות מורכבות של. נוירונים אלה מאורגנים בקבוצות ותת-קבוצות שונות בהתאם לדפוס מורפולוגיה, הקישוריות וביטוי הגנים שלהם 1. הפיתוח של microarrays, הרצף של הדור הבא, וqRT-PCR הציעו את האפשרות להשוות פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות נוירונים בהקשרים ביולוגיים שונים 1,2. ניתוחים רגישים אלה דורשים זיהוי ובידוד המדויקים של סוגי תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA 2-4. טכניקת פלורסנט הופעלה תא מיון (FACS) כבר בשימוש נרחב לבודד את סוגי תאים ספציפיים המבוססים על סמנים על פני קרום תא ו / או מורפולוגיה. FACS דורש צעד ניתוק תא לפני המיון, שתוצאתה אובדן הרזול....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הניסויים בוצעו בהתאם למדריך הקנדי לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים Laval Université ההגנה.

הכנת 1. לדוגמא

הערה: בדוגמא זו, השתמשנו המוח של עכבר ביום הלידה 1.

  1. השתמש בהרדמת היפותרמיה בקרח כתוש במשך 3 עד 4 דקות לגורים, ואז לנתח את המוח במהירות אפשרית במדיום L15 קר כקרח. לבצע שלב זה תוך 2 דקות.
  2. מוח העברה גזור בהטבעת עובש (cf.<....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך immunolabeling מהיר זו מאפשר הדמיה של תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA. איור 1 מדגים את השלבים של הכנת רקמה לפני מיצוי RNA. לאחר cryosectioning, נוירונים דופאמין מסומנים באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (נוירונים שכותרתו מופיעים בחום). בהתאם לשאלה הניסיונית, יכולים להיות מבודד תאים בודדים או באזור גדול יותר של עניין באמצעות LCM (1D איור - E). חשוב להעריך את איכות RNA חילוץ, כRNA המושפל יהיה השפעה ניכרת על איכ.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנקודה של שיטה זו הקריטית ביותר מורכבת בתיוג תאים של עניין תוך מניעת השפלה RNA. כRNAses פעיל בתמיסות מימיות, הפחתת זמני דגירה משפרת שימור RNA 11,15. כל הפתרונות המשמשים צריכים להיות מטופל בDEPC כדי להשבית RNAses. כל החומרים והמשטחים צריכים להיות מטופלים עם פתרון טיהור RNAse פני השטח כדי למנוע זיהום RNAses. לבסוף, בתנאים אלה, התוספת של מעכב RNAse בכל הפתרונות יעילה בשמירה על RNA מלהיות מושפל. השימוש בתנאי מלח גבוהים מיושמים במהלך הדגירה נוגדן הוכח בעבר כיעיל בשמירה על RN.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מענק ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC: 418391-2012). AC מקבלת מלגה מהמרכז למחקר במדעי המוח (CTRN). HDB ממומן על ידי מלגה מ-Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ו-ML הוא FRSQ Chercheur-Boursier.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שקופיות מצופות ממברנה Leica Biosystems11505158MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 ומיקרו; m; 50 יחידות
פתרון טיהור RNAse פני השטחטכנולוגיות חייםAM9780RNaseZap
Fixative70% אתנול נשמר ב-20 מעלות; C
אנטי-TH פל-פריזP40101  1:25
ללא RNAseDEPC PBS + 1% BSA+0.02% טריטון
מעכב RNAsePromegaN2615מעכב רנזין פלוס Rnase 40 kU/ml (מלאי)
מעבדות וקטורביוטיניל נגד ארנבBA-1000
Vectastain Elite ABC ערכתמעבדות וקטורPK-61008µ ליטר / מ"ל
ערכת מצע DAB פרוקסידאז SK-4100Vector
Laboratories טכנולוגיות חייםKIT0204Arcturus PicoPure ערכת בידוד RNA
H2O2 30%SigmaHC4060
אתנול מערכת מיקרו-דיסקציה לייזרמוחלטת
DEPCAlfa AesarB22753-14
BioanalyzerAgilent Agilent2100 עובש הטמעת ביואנלייזר
 Leica Biosystems147022183116x8 מ"מ
 Vector LaboratoriesH-4000
מדיה להטמעת רקמות קפואותTissue-Tek4583
שבב ביואנלייזרAligent Technologies5067-1513RNA 6000 Pico LabChip בשימוש עם Agilent 2100 Bioanalyzer
תערובת תגובה להתחלה חמה עבור PCR כמותיRoche 6402712001התחלה מהירה חיוני DNA ירוק מאסטר
הפוך טרנסקריפטאזחיים טכנולוגיות11752-050SuperScript III SuperMix סינתזה של גדיל ראשון עבור qRT-PCR
מאגר סטנדרטיות ערכת בידוד RNA Leica דגם AS-LMD עט מחסום הידרופובי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
  2. Cheng, L., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNARNAqRT PCRRNA

מאמרים קשורים