פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

סיכום

בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.

תקציר

מבני קריפטה-וילוס במעי המכונים אורגנואידים, יכולים להישמר בתרבית מתמשכת באופן תלת מימדי כאשר משלימים אותם עם גורמי הגדילה המתאימים. מכיוון שאורגנואידים דומים מאוד לרקמה המקורית מבחינת התמיינות תאי גזע הומאוסטטיים, קוטביות התאים ונוכחותם של כל סוגי התאים המובחנים הסופניים הידועים לאפיתל המעי הבוגר, הם משמשים כמשאב חיוני במחקר ניסיוני על האפיתל. האפשרות לבטא טרנסגנים או להפריע ל-RNA באמצעות וקטורים לנטי-ויראלים או רטרו-ויראלים באורגנואידים הגדילה את ההזדמנויות לניתוח פונקציונלי של אפיתל המעי ותאי הגזע של המעי, ועלתה על טרנסגניקה מסורתית של עכברים במהירות ובעלות. בפרוטוקול הווידאו הנוכחי אנו מראים כיצד להשתמש בהתמרה של אורגנואידים במעי הדק עם וקטורים לנטי-ויראליים המומחשים על ידי שימוש בטרנסגנים הניתנים להשראת דוקסיצילין, או RNA סיכת ראש קצרה הניתנת להשראת IPTG לביטוי יתר או הפלת גנים. יתר על כן, בהתחשב בתרבית אורגנואידים מניבה ספירת תאים זעירה שעשויה אפילו להיות מופחתת על ידי טיפול ניסיוני, אנו מסבירים כיצד לעבד אורגנואידים לניתוח במורד הזרם המכוון ל-RT-PCR, RNA-microarray ואימונוהיסטוכימיה כמותית. טכניקות המאפשרות ביטוי טרנסגנים והפלת גנים באורגנואידים במעי תורמות לפוטנציאל המחקרי שמבני אפיתל מעיים אלה מחזיקים, ומבססים תרבית אורגנואידים כסטנדרט חדש בתרבית תאים.

מבוא

אפיתל במעי הוא אחד מרקמות הגוף במהירות הרבה ביותר מתרבות, אשר גרמו לו למשוך עניין רחב ממחקר על תאי סרטן וגזע. בשינה 2009 פורסמה טכניקה ליצירת תרבויות לאורך זמן של מאורות מעי דקים בmatrigel, שימור מבנה ממדי 3 ^1. מבנים אלה, קרוי organoids מעיים, יכול להיות מתורבת באמצעות טכניקות סטנדרטיים, עם סובבים בתוספת בינונית עם מספר גורמי צמיחה מוגדרים, כולל הגולגולת של מעכב מסלול BMP-איתות (קולב), משפר מסלול Wnt-איתות rspondin 1 (Rspo1) ו גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) כל מצא כדי לשפר את התפשטות מעיים ^2-4.

Organoids לעלות שורות תאי הסרטן מסורתיות בהיבטים שהם-מוטציה שאינן, יש לשמור על היררכיה בתאי גזע, להציג קיטוב סלולארי ללא פגע ובידול תערוכה לכל תא השושלות שנמצאו בint הקטן המתהווהאפיתל estinal. שכן הם יכולים להיות transduced לבצע transgenes או התערבות RNA בונה ^5, הם משמשים ללמוד אלמנטים גנטיים ספציפיים, להכריע ניסויים באמצעות עכברים הטרנסגניים בהיבטים של עלות ומהירות. ביטוי מהונדס בorganoids יכול להתבצע גם באמצעות retroviral העכברית או וקטורי lentiviral ^6,7. בשל המגבלות של רטרווירוסים עכבריים, מסוגלים transducing תאי mitotic באופן בלעדי ^8, התמרה lentiviral היא בתדירות גבוהה יותר בשימוש בתאים שקשה להדביק, כגון organoids.

באופן ויראלי transduced וorganoids המהונדס ביציבות להביע יכול לשמש למספר רב של ניתוחים במורד הזרם, כולל RNA ניתוחים כמותיים ואימונוהיסטוכימיה. יחדיו, התרבות של organoids מתאי אפיתל במעי עיקרי התפתחה טכניקה שגרתית שהיא קל ליישום ללא דרישות מעבדה ספציפיות, והפכה לסטנדרט ברומן ceתרבות ll במחקר על אפיתל במעי.

טכניקות של התמרה ויראלית וניתוח במורד הזרם שלאחר מכן בorganoids הן מייגע לבצע ולסייע לניסויי organoid נוצר פרוטוקול וידאו זה, המציג שיטות לתמרת lentiviral של organoids התרבותי. אנחנו בנוסף להראות כיצד נכונים עיבוד של organoids יכול להגדיל את התשואה ולכן לשפר את הביצועים של ניתוח במורד הזרם תוך שימוש בטכניקות RNA או אימונוהיסטוכימיה. בפרוטוקול, organoids שנגזרים ממאורות מעיים קטנים שימש באופן בלעדי, למרות שהטכניקות המתוארות ניתן להחיל organoids מעי הגס גם כן.

פרוטוקול

1. הכנת Polyethylenimine (PEI) כTransfection מגיב

1. לפזר כ -150 מ"ג של PEI לשל H ₂ O. 100 מיליליטר
2. התאם פתרון לpH 7.4 ידי הוספת HCl עד פתרון הופך ברור ומערבבים עד שהיא נמס לחלוטין. פעולה זו עשויה להימשך בין 10 ל 60 דקות ומוסיפה מים עד לריכוז סוף 1 מ"ג / מיליליטר.
3. כאשר ברור, לסנן את פתרון PEI דרך מסנן 0.22 מיקרומטר סטרילי וחנות במקפיא -80 מעלות צלזיוס בaliquots של 5 מיליליטר.

2. ייצור lentiviral החלקיקים

יום 1:

1. פיצול תאי HEK293T 60% confluency -80% בבקבוק 162 סנטימטר ² או צלחת פטרי גדולה במדיום תרבות שורת תאים (DMEM בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ותוספת גלוטמין 2 מ"מ).

יום 2:

2. הכן פתרון transfection DNA המכיל 45 מיקרוגרם בסך הכל DNA פלסמיד על ידי הוספה ביחדוקטורי lentiviral אריזה (7 מיקרוגרם של pVSVg; 5 מיקרוגרם של rev pRSV; 13 מיקרוגרם של pMDL) ו -20 מיקרוגרם של פלסמיד lentiviral קידוד הגן של עניין או shRNA של עניין. התאם לנפח של 1 מיליליטר באמצעות DMEM.
3. הכן פתרון transfection PEI על ידי הוספת 90 μl של 1 מ"ג / מיליליטר PEI לμl 930 של DMEM ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
4. הוסף פתרון transfection DNA לפתרון PEI. מערבולת או להפוך מספר הפעמים ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי להשיג פתרון transfection DNA.
5. לטפטף 2 מיליליטר של פתרון transfection DNA על גבי תאי HEK293T ודגירה של 4 שעות בתרבית תאי חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס.
6. לאחר 4 שעות, לרענן את מדיום התרבות להסיר PEI. אין צורך לשטוף את התאים לפני הוספת מדיום חדש.
   הערה: PEI הוא פעמים ציטוטוקסיות ודגירה ארוכות יותר מ -4 שעות עלולות לגרום נזק לתאי HEK293T.

יום 4:

7. החלף Supernatant עם מדיום התרבות חדש. שמור supernatant (המכיל וירוס); זה ישמש בשלב 2.10.
8. שים supernatant ב -15 בקבוק מיליליטר. כדי להסיר תאים מתים, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
9. לדחוף supernatant באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק 60 מיליליטר גדול. אחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.

יום 5:

10. לאסוף את המנה השנייה של supernatant; צנטריפוגה ומסנן כמו בשלבים 2.8-2.9.
11. בריכת supernatants מצעדי 2.9 ו2.10 בצינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות ב 50,000 XG בultracentrifuge למשך 90 דקות.
12. קח את כמוסות המכילות את צינורות ultracentrifuge מאוד בזהירות והכניס לתוך הזרימה למינרית, לזכור את הכיוון של הצינור בתוך צנטריפוגות.
13. כמוסה פתוחה מחזיקה צינור ultracentrifuge ובינוני למזוג בזהירות באופן כזה שהגלולה היא בצד העליון של הצינור. מאז כדורים נגיפיים עלולים להיות קשים לדמיין, לזכור על מההצד של צינור גלולה תהיה יצרה. קח micropipette ולהסיר אחרון קצת בינוני תוך הקפדה שלא כדי להתסיס את הגושים חומים האטומים כי הוא גלוי בצד של החלק התחתון של צינור ultracentrifuge.
14. Resuspend גלולה זו ב500 μl של מדיום תרבות organoid בתוספת 10 nicotinamide מ"מ, 10 מיקרומטר Chir99021, 10 מיקרומטר Y27632 ו8 מיקרוגרם / מיליליטר polybrene. Resuspension במדיום הזה הוא חשוב שכן וירוס גבוה כייל משמש לtransduct organoids ישירות.
15. לחלופין: להקפיא את הווירוס במדיום זה aliquoted בשתי קבוצות של 250 μl ב-80 ° C.

3. lentiviral התמרה של Organoids

יום 0:

1. פיצול 0.95 סנטימטר ² גם מלא organoids יומיים לפני התמרה לבאר חדשה, במטרה להשיג כ -50 organoids הקטן. פיצול organoids על פי פרוטוקול שפורסם בעבר ¹ (איור 3 א ', ב').
2. להשלים organoid מדיום תרבות עם 10 מיקרומטר Chir99021 ו -10 nicotinamide מ"מ להשיג מאורות היפר פיברוזיס שגשוג (איור 3 ג).
   הערה: מאורות Cystic יפתחו הטובים ביותר כאשר organoids טרי לפצל גדלים בנוכחות Chir99021.

יום 2:

3. organoids קציר על ידי pipetting מעלה ומטה matrigel והבינוני, ובכך לשבש את התערובת עם micropipette p1000. מניחים את התערובת בשפופרת 15 מיליליטר.
4. לשבש נוסף באמצעות pipet פסטר שבפתיחת דיסטלי כבר ירד ב נמס. organoids צנטריפוגה לגלולה במשך 5 דקות ב 100 x גרם.
   הערה: תלוי בגודל של צנטריפוגות, להשתמש במהירות צנטריפוגות שונה. זה הכרחי כדי למצוא את המהירות המדויקת שבו שיבש organoids מופרדים מהתערובת.
5. הסר את supernatant ולהוסיף 500 μl של טריפסין 1x מראש חימם (בדומה לטריפסין 0.25%). Resuspend organoids בטריפסין ודגירה3 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
6. להשבית טריפסין ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום תרבות שורת התאים (DMEM בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין וגלוטמין). צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
7. הסר את supernatant לעזוב גלולה בכ -20 μl של מדיום. העבר את organoids בכמות קטנה האחרונה של מדיום לתוך באר בצלחת 48-בארות.
8. להוסיף lentivirus כייל גבוה במדיום התמרה כמתואר בשלב 2.14, resuspend והמשך לשלב 3.10. כאשר נתקל ביעילות התמרה נמוכה, צעד 3.9 ניתן להוסיף.
   הערה: לתמרה יעילה, בדרך כלל להוסיף aliquot אחד של 250 μl של lentivirus כייל הגבוה ולאחת מorganoids. זה מייצג 50% מכל lentivirus שנקטפו מייצור יחיד כמתואר בשלב 2 של פרוטוקול זה.
9. לחלופין: כדי לשפר את יעילות התמרה, לבצע spinoculation על ידי הצבת 48 organoids הצלחת המכילה גם בצנטריפוגה מראש חיממה על 326; C ולסובב ב 600 XG במשך שעה 1.
10. שים תערובת organoid-וירוס בתרבות חממת דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבות כדי לאפשר התמרה.
11. לחלופין: כדי לשפר עוד יותר את יעילות התמרה, דגירה organoids במשך 3 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבות.
12. הוסף 1 מיליליטר של מדיום תרבות organoid וresuspend תערובת organoid-הווירוס, להעביר לתוך צינור microcentrifuge ו צנטריפוגות בmicrocentrifuge למשך 5 דקות ב 850 XG כדי גלולה organoids.
13. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב -20 μl של matrigel קר כקרח. מכיוון שהחומר מתמצק כאשר הוא הופך להיות חם יותר, להשתמש בטיפי פיפטה המקוררים על ידי pipetting מעלה ומטה קרח הקר PBS למספר פעמים.
14. שים הטיפה באמצע גם בצלחת 48 בארות דגירה בחממת תרבות על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לחזק.
15. לאחר 15 דקות, בזהירות להוסיף 250 μl של מדיום תרבות organoid בתוספת10 nicotinamide מ"מ, 10 מיקרומטר Chir99021 ו -10 מיקרומטר Y27632. שברי organoid שיבשו קטנים יהוו לorganoids פיברוזיס הקטן בתוך 24 שעות.

יום 5:

16. רענן בינוני ולהשלים עם אנטיביוטיקה בחירה (לpuromycin, להשתמש 4 מיקרוגרם / מיליליטר).

יום 7:

17. החלף בינוני למדיום תרבות organoid הסטנדרטי, בתוספת אנטיביוטיקה בחירה.
    הערה: הניצנים יהיו שלמים 2-3 שבועות לאחר נסיגת Chir99021. לאחר בחירה, organoids עשוי להיות מבוגר ללא אנטיביוטיקה בחירה.

4. Organoid RNA הכנה לכמותי RT-PCR או Microarray

1. להכנת RNA, השתמש בערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. הוצא את המדיה מorganoids ולהוסיף 350 μl של RLT חיץ, בתוספת β-mercaptoethanol ישר על כיפת organoids matrigel מכיל. Resuspend materiאל בRLT ידי pipetting באמצעות micropipette p1000.
2. לבצע את הכנות RNA נוספות על פי הפרוטוקול של היצרן.
3. לחלופין: להגדיל את תשואת RNA על ידי הגברה שימוש במערכת Ovation הפיק WTA, הדורשים השקעה ראשונית של 50 מיקרוגרם RNA הכולל על פי הפרוטוקול של היצרן.
4. לחלופין: לבקרת איכות לפני microarray RNA, דגימות מנוהלות על Bioanalyzer 2100 באמצעות שבב ננו RNA eukaryote כולל, מכוון למספר שלמות RNA (רין) של 8.5 או יותר (איור 5) על פי הפרוטוקול של היצרן.

5. Organoids העיבוד לפרפין הטבעה ואימונוהיסטוכימיה

1. לפני תחילת organoid הטבעה מראש לחמם בלוק אלומיניום עם חורים בקוטר צינורות זכוכית מתאימים 12 מ"מ באינקובטור ב 70 ° C כדי לשמור על נוזל פרפין.
2. קח גם אחת עם organoids מלא גדל ולהסיר את המדיום, ומשאיר את organoids המשובץ בשלמותה.
3. הוסף 1 מיליליטרשל paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS ישר לטוב ולתקן על 4 מעלות צלזיוס בכל מקום בין שעות 1 עד הלילה.
4. החלף paraformaldehyde עם 1 מיליליטר של PBS הקר כקרח.
   לחלופין: לשמור organoids הקבוע בPBS עד השבוע 1 על 4 מעלות צלזיוס לאחר שלב זה.
5. Resuspend organoids הקבוע ב 1 מיליליטר של PBS ומקום לתוך בקבוקון זכוכית.
6. בוא organoids לשקוע לתחתית דקות 1, למזוג PBS ולהחליף עם 70% אתנול שבכמה טיפות של תמיסת eosin הם מומסים על מנת לאפשר להדמיה של organoids לאורך כל תהליך ההטבעה.
7. השאר organoids באתנול 70% בטמפרטורת חדר. לאחר 30 דקות, להסיר את אתנול 70% באמצעות אחסון בזהירות, להיות מסוגל לדמיין organoids לפי העין בגלל צבע ורדרד eosin קל. החלף פתרון הטבעה עם 96% אתנול.
8. חזור על שלב 5.7, בכל פעם שמחליפה את פתרון ההטבעה עם הבא. עובר דרך organoids את הפתרונות הבאים לאחר מכן: 70% אתנול, 90% אתנול, 96% אתנול, etha 100%נול, אתנול 100%, קסילן, קסילן.
9. למזוג לשטוף קסילן האחרון ולשפוך נפט לצינור. שים את הצינור מייד בבלוק האלומיניום מראש חימם על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהחליף פרפין עם פרפין הנקי החדש.
10. יוצקים organoids פרפין את וpipet לתוך תבנית בלוק פרפין באמצעות pipet פסטר מראש חימם עם פתח גדול. להתחמם pipet פסטר באמצעות מבער בונזן. מניחים את כל organoids בעובש בלוק פרפין בשכבה קטנה של פרפין הנוזלי.
11. עד כמה שניתן, מנסה לתפעל את כל organoids לכיוון המרכז של עובש בלוק פרפין באמצעות מחט לנתיחה חיממה. להתחמם מחט לנתיחה באמצעות מבער בונזן.
12. כאשר הלוקליזציה של organoids בעובש היא משביעת רצון, עובש צינה מעט כדי לחזק את שכבת הנפט.
13. לסיים את הבלוק על ידי שפיכה יותר פרפין על גבי ולהוסיף הטבעת קלטת היסטולוגית סטנדרטית.

תוצאות

התמרה lentiviral Organoid

הטכניקה של התמרה organoid באמצעות חלקיקי lentiviral תלוי בטיפול הנכון בorganoids לפני ובמהלך התמרה. Organoids (איור 3 א) היו בתרבית והם שובשו למאורות יחידים (איור 3). כפי שדווח בעבר, מאורות יחידים אלה, כאשר בתרבית בנוכחות מעכב GSK3 Chir99021 הפכו מאורות פיברוזיס ⁹ (איור 3 ג). בהמשך לכך organoids היו trypsinized כדי לא...

דיון

פרוטוקול הווידאו הנוכחי מתאר התמרה lentiviral של organoids מאפיתל במעי ראשוני וניתוח במורד הזרם של organoids אלה תוך שימוש בטכניקות RNA כמותי ואימונוהיסטוכימיה.

התמרה lentiviral מבוצעת לעתים קרובות בתאים חסיד או צפים בצלחות תרבות. מכיוון שהמבנה התל-ממדי של organoids הופך אותם קשה לחדור ידי חלקיקים נגיפיים, במספר השיטות כדי להגדיל את היעילות בשימוש. טיפול מקדים של organoids באמצעות Chir99021 מגדיל התפשטות ובכך כדא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוליאתילן imine	Polysciences	23966-2
DMEM בינוני	Lonza	BE12-614F
סרום עגל עוברי	Lonza	DE14-801F
פניצילין-סטרפטומיצין	Invitrogen	15140-122
גלוטמין	Invitrogen	25030-024
מטריג'ל	BD	BD 356231
מתקדם DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-אצטיל ציסטאין	סיגמא	A9165-1G
עכבר Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	סיגמא	Y0503-5MG
פוליברן	סיגמא	107689
ניקוטינאמיד	סיגמא	N0636
טריפסין	לונזה	BE02-007E
פורומיצין	סיגמא	P 7255
Rneasy מיני קיט	Qiagen	74106
β-מרקפטואתנול	Merck	8,057,400,250
מערכת Ovation Pico WTA	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
בקבוקון זכוכית חרוטי 12  מ"מ x 75  מ"מ 5  מ"ל	VWR	LSUKM12
Eosin צהבהב	VWR	1,159,350,025