Method Article

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

DOI:

10.3791/52540

⸱

February 20th, 2015

 ,  , 
1Genetics and Genomic Medicine, Institute of Child Health, University College London, 2Molecular Cell Science Research Centre, St. George's University of London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה הוא כלי פופולרי למודל מחלת כליות כרונית (CKD). עם זאת, גודלם הקטן עושה את זה בלתי אפשרי להעריך תפקוד הכלייתי בשיטות מסורתיות. אנו מתארים assay אישור כליות צבע ניאון 1 המאפשר ניתוח כמותי של תפקוד כליות דג הזברה בCKD.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עובר דג הזברה מציע מודל צייתן ללמוד organogenesis ומודל מחלה גנטית אנושית. למרות פשטותו היחסית, בכליות דג הזברה מתפתחות ופונקציות כמעט באותה הצורה כמו בני אדם. הבדל עיקרי בבנייה של הכליה האנושית הוא נוכחותם של מיליונים nephrons בהשוואה לדג הזברה שיש רק שניים. עם זאת, פישוט מערכת כה מורכבת ליחידות פונקציונליות בסיסיות סייע ההבנה של איך כליות מפתחת ומפעילות. בדג הזברה, קו האמצע ממוקם glomerulus אחראי על סינון הדם הראשוני לשתי צינוריות pronephric שלסטות לרוץ בילטרלי במורד הציר העוברי לפני שהוא נדבק זה לזה בביב. Tubules pronephric מאוכלסים בכבדות על ידי cilia ניעתי שיקל על התנועה של תסנין לאורך אבובית מפולחת, המאפשר החלפה של מומסים שונים עד שלבסוף יציאה באמצעות 2-4 הביב. גנים רבים אחראים למחלת כליות כרונית, including אלה הקשורים לciliogenesis, נחקרו בדג הזברה 5. עם זאת, תיקו גדול בחזרה היה הקושי בהערכת תפקוד כליות דג הזברה לאחר מניפולציה גנטית. מבחני מסורתיים למדידת הפרעות בתפקוד כליות בבני האדם הוכיחו translational לא לדג זברה, בעיקר בשל הסביבה המימית שלהם וגודל קטן. לדוגמא, זה לא אפשרי מבחינה פיזית כדי לחלץ דם עוברי ממבוימים דגים לניתוח של תוכן אוריאה וקריאטינין, כפי שהם קטנים מדי. בנוסף, דג הזברה אינה מייצר מספיק שתן לבדיקה על 'המדיד' פרוטאינוריה פשוטה, המבוצע לעתים קרובות במהלך בדיקות ראשוניות מטופל. אנו מתארים assay ניאון שמנצל את השקיפות האופטית של דג הזברה כדי לפקח כמותית האישור של צבע ניאון, לאורך זמן, מכלי הדם והחוצה דרך הכליות, לתת קריאה מתוך תפקוד הכלייתי 1,6-9.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכליה האנושית משחקת תפקיד מכריע בסינון פסולת המטבולית מן הדם ומתאושש מומסים נדרשים כדי לקיים הומאוסטזיס הסלולר. ישנם מספר מחלות גנטיות אנושיות הגורמות להפרעות בתפקוד כליות. מחלת הכליות התורשתית הנפוצה ביותר היא מחלה אוטוזומלית דומיננטית בכליות פוליציסטיות (ADPKD) מאופיינת בהתפתחות של שלפוחיות נוזל מילא בתוך צינוריות נפריטית; הנזק שנגרם על ידי cystogenesis הוא מזיק לכליות פונקציה 10. יש ADPKD התרחשות של 1: 800 - 1: 1000 ומהווה 8-10% מהחולים באי ספיקת כליות סופנית (ESRF) 11. מספר גנים היו מעורבים לגרום ADPKD כולל polycystin-1 (PKD1) ו-2 (PKD2), המהווים כ 85% ו- 15% מהמקרים, בהתאמה 12,13. יתר על כן....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת אתיקה: בעלי חיים תחזוקה, בעלי, ונהלים מוגדרים ונשלטים על ידי בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986. כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו תחת רישיונות שניתנו על ידי שר הפנים (PIL מס '70/7892) בעמידה בביולוגית שירותי קבוצת ניהול והוועדה אתיקה הביולוגיים השירותים, SGUL, לונדון, בריטניה. כל המאמצים שנעשו כדי לצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים וכדי לחדד את שני ההליכים והבעלים כדי למזער את הסבל ולשפר את הרווחה.

1. הכנה של מכשירים, הרדמה, ופלורסנט דיי

  1. באמצעות חולץ micropipette ונ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תסמונת Bardet-Biedl (BBS) היא ciliopathy הטרוגנית נדיר שפוגע בכ -1: 160,000 איש ברחבי העולם 16. חולים הנוכחיים עם מספר הבעיות הקשורות כוללים כליות פוליציסטיות, לאחר מכן חולים לעתים קרובות דורשים דיאליזה או השתלת כליה 24. ESRF הוא הגורם השכיח ביותר למוות בBBS, עם כ -30% מחולים שפתח CKD 16. נכון לעכשיו, 20 גנים הקשורים הלא היו מעורבים בBBS ללא קשר גנוטיפ, פנוטיפ שפורסם. חלבוני BBS לשתף תחומים לוקליזציה חלבון נפוצים בגופי cilium ובסיסיים ש, יחד עם תכו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה להציע כלי רב ערך למודל מחלה גנטית אנושית, השימוש בם כמכשיר מדעי לin vivo מחקר איפשר מחקרים מפורטים של ההתפלגות הגנטית של רבים מערכות ביולוגיות, כוללים הכליות. הרבה עכשיו הבין על איך כליות דג הזברה מתפתחות ופונקציות. הדמיון הבולט לnephrogenesis והומולוגיה עם גנים של מחלות שגרמו 21 אנושיים ממחיש עד כמה דג הזברה הפכה יסודי בהבנה כיצד פגמים בעצמם תפקוד גן לפתולוגיה של מחלת כליות. ואכן, מניפולציה גנטית יכולה להיות מושגת בקלות בדג זברה באמצעות טכנולוגיית מצי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיוע טכני המסופק על ידי Jaipreet Bharj. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאיחוד האירופי-FP7 (SYSCILIA -241,955) והכליות הולנדי הקרן (CP11.18).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
P-97 SUTTER חולץ מיקרופיפטה מסוג בוער / חוםIntracelP-97
נימי קיר סטנדרטיים בורוסיליקטמכשיר הרווארד30-0017
שקופיות מיקרוסקופ זכוכיתVWR International631-0109
דבק שרף אפוקסיEvo-Stik
רודמין B 10,000 מגה-וואט שכותרתו DextranLife technologies D-1824
N-Phenylthiourea סיגמא-אולדריץ' P7629
מתילן כחול סיגמא-אולדריץ'M9140
אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאטסיגמא-אולדריץ'A5040
מתיל צלולוזסיגמא-אולדריץ'M0512
מדחס אוויר ג'ון-איירOF302-15
פיקוספריצר III פארקר אינסטרומנטס 051-0500-900
מיקרומניפולטור קומפקטי בעל 3 צירים מרזהאוזרMM33 
ניתוח מיקרוסקופ סטריאוניקוןSMZ1000
טיפים למיקרו-מעמיסEppendorf5242956003
Dumont #5 מלקחיים Sigma-AldrichF6521
 פייזר- SGI02A00404
מיקרומטר שלב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
  2. Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish Kidney FunctionFluorescent Clearance AssayPericardial Cavity InjectionEpi Fluorescence MicroscopyFluorescent Dye ClearanceZebrafish Embryo AnesthesiaImage J QuantificationPronephric Tubule AnalysisFluorescence Intensity MeasurementStudent s T test Analysis

Related Articles