מאמר זה מתאר את הטכניקה המשמשת לביצוע מיפוי אופטי דו-ערוצי בחד-שכבות חד-שכבתיות של תאי פרוזדורים HL-1. פרוטוקול ייחודי זה מאפשר הדמיה בו-זמנית של פעילות סידן (Ca) ומתח (Vm) באותו אזור לזיהוי וניתוח מפורט של תכונות אלקטרופיזיולוגיות של תרבית חד-שכבתית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיפוי אופטי הוכיח להיות טכניקה יקרה כדי לזהות פעילות חשמלית של הלב על שני לבבות לשעבר שלם vivo ובmonolayers myocyte התרבותי. תאי HL-1 היו בשימוש נרחב כמודל סלולארי 2 ממדים ללימוד היבטים שונים של פיזיולוגיה של לב. עם זאת, זה כבר אתגר גדול לסידן המפה אופטי ארעיים (Ca) ופוטנציאל פעולה בו זמנית מאותו שדה הראייה בשכבת תא פרוזדורים תרבותית HL-1. סיבה לכך הוא טיפול וטיפול מיוחדים נדרש כדי להכין את התאים בריאים שיכול לנפול בפח חשמלי וממופים אופטי. לכן, פיתחנו פרוטוקול עבודה אופטימלי למיפוי אופטי ערוץ כפול. בכתב היד הזה, שתארנו בפירוט כיצד לבצע את ניסוי מיפוי אופטי ערוץ הכפול. פרוטוקול זה הוא כלי שימושי שנועד לשפר את ההבנה של התפשטות פוטנציאל פעולה וקינטיקה Ca בפיתוח הפרעות קצב.
מבוא
סידן ייחודי (Ca) ומתח (מ 'V) טכניקת מיפוי אופטי ערוץ כפול 1-5 מתגלה ככלי יעיל כדי להקליט בו זמנית אותות מ' V וCa בשני לבבות שלמים וmonolayers תאים בתרבית. טכניקה זו מאפשרת לקבל מידע רב עוצמה ביחס למערכת היחסים בין ארעיים סידן ופוטנציאל פעולה כדי להבין טוב יותר את מנגנוני אלקטרו הבסיסיים של הפרעות בקצב לב.
monolayers תאים בתרבית הוכיח להיות מודל סלולארי שימושי ללמוד electrophysiology לב ואת המנגנון הבסיסי של הפרעות קצב. 4,6-8 HL-1 תאים קו תרבות myocyte פרוזדורים מאופיינים היטב. תאי HL-1 גם לשמור על גנוטיפ מובח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. פתרון הכנה
- נוראפינפרין פתרון (NP)
- לפזר 40 מ"ג של NP ל -25 מיליליטר של 30 מ"מ חומצה אסקורבית (חומצה אסקורבית .1475 g ב -25 מיליליטר מים מטוהרים מילי- Q (MQ). הימנע מחשיפה לאור ישירה במהלך הכנת פתרון זה בגלל נוראפינפרין (NP) הוא רגיש לאור.
- סנן את פתרון NP עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. Aliquot הפתרון לmicrotubes סטרילי 1 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C. ברגע שהוקפא, NP יציב למשך חודש אחד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Monolayer ומחוברות תרבותית מציגה קצב פנימי רגיל, כפי שהודגמה בסרט 1. לאחר מכן, אנו מבוצעים מ 'V מיפוי אופטי ערוץ כפול / Ca בשכבה HL-1 ומחוברות באופן מלא. איור 1 א מציג עקבות דוגמא מ' V ואותות Ca מנרשם בודד הכה. מפות isochronal נציג מ 'V מופץ באופן אחיד ואותות Ca באמצעות מערכת המיפוי אופטי ערוץ הכפולה מוצגות ב1B דמויות ו1C. תמונות כרונולוגי נציג של פוטנציאל פעולה מופץ באופן אחיד וא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה מתאר את ההיבטים המרכזיים של מיפוי אופטי בשכבת myocyte פרוזדורים תרבותית HL-1 מוכתמת בצבעי ניאון רגישים סידן ומתח. זה כולל culturing monolayer אופטימלי HL-1 תא, התקנה של ציוד המיפוי, מיפוי monolayer תרבותי, וניתוח נתונים.
כדי למפות בהצלחה תאים בתרבית, המפתח הוא להכין monolayer תא מפוזר באופן אחיד. כאשר זריעת התאים לcoverslips, להיות בטוח כדי לפזר באופן שווה את התאים. תמיד מפת monolayers תא מלאה גדל ומחוברו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
תודות
ברצוננו להודות לד"ר Claycomb למתן תאי HL-1 ופרוטוקול תחזוקה מפורט. כמו כן, אנו רוצים להודות לגב 'אלנה קאריו וד"ר סת Robia על סיועם ביצירת סרט התא ומר פיט קארון לעזרתו בהכנה כמה אבזרים למערכת הערוץ הכפולה שלנו מיפוי אופטי.
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד לב האמריקאי (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 לXA), המכונים הלאומי לבריאות (HL113640 לXA), וויולה אוניברסיטת מחקר קרן לפיתוח (לXA).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אבקה יבשה Rhod2 | AAT Bioquest | 21062 | |
| פלורוני | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPEs | סיגמא | H3375 |
מקורות
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / e....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
