שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Summary

פרוטוקול מסופק לבחירת אפטמרים ממתגי מבנה עבור מטרות מולקולות קטנות בהתבסס על שיטת בחירת חרוזים מגנטיים קפדנית ניתנת לכוונון. אפטמרים שנבחרו עם תכונות מיתוג מבנה מועילים לבדיקות הדורשות שינוי קונפורמציה כדי לאותת על נוכחות מטרה, כגון בדיקת ננו-חלקיקי הזהב המתוארת.

Abstract

מולקולות קטנות לספק מטרות עשירות עבור יישומי biosensing בשל ההשלכות הפיזיולוגיות שלהם כסמנים ביולוגיים של היבטים שונים של בריאות וביצועים אנושיים. aptamers חומצות גרעין יושמה יותר ויותר כאלמנטים הכרה בפלטפורמות biosensor, אבל בחירת aptamers למטרות מולקולה קטנות דורשת שיקולי עיצוב מיוחדים. עבודה זו מתארת ​​שינוי ושלבים קריטיים של שיטה שנועדה לבחור aptamers-מיתוג מבנה למטרות מולקולה קטנות. רצפים מחייבים מספריית ה- DNA הכלאה לבדיקות DNA לכידה משלימות בחרוזים מגנטיים מופרדים מnonbinders באמצעות שינוי מושרה יעד בקונפורמציה. שיטה זו יש יתרון משום שרצפים מחייבים מטריצת התמיכה (חרוזים) לא יהיו מוגברים יותר, והיא אינה דורשת קיבוע של מולקולת היעד. עם זאת, טמפרטורת ההתכה של חללית הלכידה והספרייה נשמר באו מעט מעל RT, כזה שלא רצפיםdehybridize הכובע מבוסס על תרמודינמיקה גם יהיה נוכח בפתרון supernatant. זה למעשה מגביל את יעילות המחיצות (יכולת היעד נפרד מחייבת רצפים מnonbinders), וסיבובי בחירה לכן רבים יידרשו כדי להסיר רצפי רקע. שיטת הדיווח שונה מבחירות aptamer-מיתוג מבנה קודם בגין יישום צעדי סלקציה שליליים, ניטור העשרה פשוטה, והארכת משך הבדיקה הלכידה הבאה העשרת מבחר לספק חומרה משופרת. Aptamers-מיתוג המבנה שנבחרה היא יתרון בפלטפורמת assay ננו-חלקיקי זהב שמדווחת על הנוכחות של מולקולת מטרה על ידי השינוי קונפורמציה של aptamer. Assay ננו-חלקיקי הזהב יושם משום שהוא מספק קריאה פשוטה, מהירה colorimetric כי הוא מועיל בסביבה קלינית או לפרוס. שיקולי עיצוב ואופטימיזציה מוצגים עבור assay כהוכחה של principlעבודת דואר במאגר לספק בסיס להרחבה נוספת של העבודה לקראת biosensing מולקולה הקטן בנוזלים פיסיולוגיים.

Introduction

מולקולות קטנות כבר מזמן מוכרות כממלא תפקידים חיוניים בתהליכים ביולוגיים מגוונים כגון רעילות פיזיולוגית או תזונה, איתות תא, וטיפולי תרופות למחלות כמו ^1. מולקולות קטנות שונות יש גם הציעו כסמנים ביולוגיים מעידים על תנאים פיסיולוגיים כוללים לחץ ^2,3, עייפות ^4, ומחלה ^5. לדוגמא, רמות הקורטיזול גבוהות לתאם עם לחץ אשר עלול לגרום לביצועים פיסיולוגיים ירדו ומצבים בריאותיים אחרים ^6-8. כמו כן, שינויים ביחסים של פפטידים מסוימים ברוק הם ניבוי של עייפות, שבו תופעות פיסיולוגיות כוללות חוסר הריכוז, זמן תגובה לקוי, ותפקוד הקוגניטיבי מופחת ^4. לכן, הפיתוח של חיישנים ביולוגיים יעד ספציפי כדי לפקח על הרמות של מולקולות קטנות עשוי לספק מדד לא יסולא בפז להערכת יכולות בריאות וביצועים של individual.

מבחינה הסטורית, גילוי מולקולה קטן שבוצע על ידי טכניקות הפרדה עתירת עבודה או על ידי הכרה מבוססת נוגדן ^6,7. לאחרונה, aptamers חומצות גרעין ^9,10 צמחה כאלמנטים הכרה בכך שיש יתרונות ברורים על פני נוגדנים ביישומים ספציפיים. עם היכולת שלהם להיקשר יעד שונה בגודל מיוני מתכת ¹¹ לרקמות ^12, aptamers כבר מיושמת באופן נרחב כאלמנטים הכרה בפלטפורמות biosensing ^13,14. בהשוואה לנוגדנים, aptamers כימית מסונתזת, ולכן פשוט להציג שינויים כימיים לשחזור לקיבוע משטח או דיווח. ניתן לבחור Aptamers עם סגוליות גבוהות יעד בתנאים הרצויים על ידי שינוי תנאי הבחירה בשימוש, ואילו נוגדנים מוגבלים לתנאים פיסיולוגיים ^15,16. בנוסף, aptamers מסוגלות צפיפות יגנד גבוהה יותר בשל הEIR גודל קטן יותר, וכתוצאה מכך היעד גבוה איתות יעילות על פלטפורמת biosensor, והיציבות המשופרת של aptamers מאפשרת שימוש חוזר ואחסון חיישן לטווח ארוך ^16.

Aptamers נוצרים באמצעות הליך המכונה SELEX, שבו ספרייה ראשונית של רצפים הוא התפתחה 10 ¹³ -10 ¹⁵ מולקולות ייחודיות לברכה סופית מועשרת המכילה מספר (10 ¹ -10 ²⁾ רצפים עם פוטנציאל לקשור מולקולת היעד. הבריכה מועשרת הסופית לאחר מכן רצף, וקבועי דיסוציאציה _(ד K) מתקבלים ממחייבים מבחני של רצפי עותק המספר הגבוהים ביותר עם ​​מולקולת היעד. אבולוציה של הבריכה לאוכלוסייה מועשרת סופית במעקב על ידי ניטור אחוז הבריכה מחייבת היעד בכל סיבוב, עד העשרה המרבית מתקבלת. זה מתרחש על פני מספר סיבובי אבולוציוני, שבו רצפים מחייבים הינן מחיצות מnonbinders וamplified באמצעות תגובת השרשרת של פולימראז (PCR). היכולת לחלק בצורה יעילה ולשמר קלסרים היא אחד מהגורמים העיקריים ליעילות של השפעות בחירה ובאופן ישיר את המאפיינים של aptamers נבחר ^15. שלב מחיצות SELEX הוא מאתגר יותר עבור מולקולות קטנות כיוון שהם לא מחזיקים את הגודל או מגוון של קבוצות פונקציונליות המסייעות בתהליך חלוקת מטרות חלבון ^1,15. לדוגמא, פלטפורמות מחיצות חלבון רבות מסתמכות על גודל או הפרדה מבוססת תשלום, עם זאת את המאפיינים של מתחמי יעד כרוכים DNA-קטן מולקולה הם בדרך כלל לא שונים באופן משמעותי מזה של רצפים בלתי מחייבים, וכתוצאה מכך לא יעילות מחיצות ^1. שיטות מחיצות SELEX חלופיות עשויות להיות כרוכה בחוסר תנועה או תיוג של היעד, אשר באופן פוטנציאלי לשנות את המאפיינים המחייבים של מולקולה קטנה. כתוצאה מכך, עיצוב של הליך בחירה כדי ליצור aptamers למולקולה קטנה מטרות requires התייחסות מיוחדת.

מגוון של שינויים הוחלו על המתודולוגיה SELEX המקורית כדי לשפר את יעילות החלוקה של ההליך, לשפר את הזיקה או סגוליות של הרצפים בבריכה הסופית, או להפוך אותו נוח יותר ליישומים שונים ^15,16. שינוי SELEX אחד מסוגל בחירה למולקולות קטנות נועד ליצור aptamers-מיתוג מבנה, או aptamers שעובר שינוי קונפורמציה על אינטראקציה עם מולקולת יעד ^17,18. בדוגמא אחת של שיטה זו, ספריית הכלאה לקטע קצר של DNA משלים לא מחייב (cDNA) משותק על חרוזים מגנטיים ^17. על היעד מחייב, השינוי קונפורמציה של רצפי מחייב מאפשר להם dehybridize מcDNA, משחרר אותם לפתרון supernatant, בעוד nonbinders נותר הכלאה לcDNA / חרוזים מגנטיים למחיצות וזנוח. שיטה זו היא advantageous למולקולות קטנות, כי היא אינה דורשת קיבוע או תיוג של מולקולת היעד כדי להשיג הפרדה.

Aptamers המסוגלים מבנה מיתוג יש תכונה רבת ערך עבור כל פלטפורמת biosensor פוטנציאלית שמחייבת שינוי במבנה aptamer כדי לזהות הנוכחות של מולקולת יעד. באופן ספציפי, ניתן לשלב aptamers עם חלקיקי זהב (AuNPs) כדי ליצור מבחני שפועלים על בסיס העיקרון-מיתוג המבנה לייצר תגובת colorimetric בנוכחות מולקולת היעד לאחר אתגר מלח ^19,20. בassay AuNP, aptamer דנ"א חד-גדילים (ssDNA) תחילה adsorbs אל פני השטח AuNP ומגן עליו מאתגר מלח. הנוכחות של היעד גורמת לשינוי קונפורמציה בaptamer שחושף את פני השטח AuNP, וכתוצאה מכך שינוי צבע אדום-כחול-לבא בנוסף מלח. AuNP מבחני גם הוכחו כדי להגביר אות, שבו aptamer זיקת מייקרוים יכול לזהות יעד בהזמנות רמות גודל נמוך מקבוע דיסוציאציה _(ד K) ^21. תכונה זו היא אטרקטיבית במיוחד למטרות מולקולה קטנות, שבו זיקות בדרך כלל נעות בין מייקרו הנמוך לריכוזי millimolar ^1,15. בדרך כלל, assay הוא גם מהיר ופשוט יחסית לביצוע, עידוד מחקר נוסף של מבחני aptamer-AuNP כפלטפורמות גילוי biosensor.

מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול אוניברסלי לבחירת aptamers-מיתוג מבנה למולקולות קטנות עבור יישומי biosensing באמצעות קורטיזול סמן מתח כמולקולת נציג. ערכת זיהוי biosensor AuNP היא עניין בשל פשטותו של מבצע וקריאת colorimetric, אבל aptamers-מיתוג מבנה חלות על תפוקות פלטפורמת חישה חלופיות, כגון ²² אלקטרוכימיים או הקרינה ²³ שגם מספקים זיהוי באמצעות שינוי בconformatio aptamern על היעד מחייב. בהשוואה לשיטות קודמות, צעדי סלקציה שליליים מרובים שולבו בעיצוב ^17,18, וערכת זיהוי העשרה מבוססת UV פשוט יושמה (איור 1). פרוטוקול זה הוא בניגוד לתכנית איתור העשרת radioligand שימוש בשיטות מורשה ^17. השיטה המוצעת גם שולבה עלייה באורך של בדיקות לכידת cDNA משמשות בבחירה כדי להגביר את יעילות מחיצות וביעילות מנגינה ההחמרה של מבחר לאחר העשרה מקסימלי נצפתה ^24. העופרת מכוונת ההחמרה לשיעור כולל נמוך יותר של ה- DNA eluted על ידי היעד בבריכה הסופית, אבל הביאה למספרים גבוהים יותר של עותק רצף שקשרו עם זיקה משופרת בהשוואה לרצף מספר העותק הגבוה ביותר מסיבוב קודם. רצף מספר העותק הגבוה ביותר מהברכה האחרונה היה מוחל על assay AuNP כדי להמחיש כי הרצף היה נוח לפלטפורמהשדורש שינוי מבני כדי לציין יעד מחייב. assay החיץ מבוסס זה מראה כי התגובה של assay AuNP ניתן לשנות על ידי שינוי הצפיפות של DNA מוחל על פני השטח, ומשמש כהוכחה של עיקרון עבודה להקדיש מאמצי מחקר עתידיים לפיתוח חיישנים הביולוגיים AuNP מבוסס aptamer מולקולה קטנה ב נוזלים פיסיולוגיים.

Protocol

1. ספרייה ופריימר עיצוב וסינתזה

1. עיצוב הספרייה הראשונית ופריימרים (נושא זה נבדק בהרחבה בפרסומים קודמים) ^25,26.
   1. לסנתז הרצפים עבור מחקר זה באמצעות כימיה phosphoramidite סטנדרטית הבאים:
      ספרייה: -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA GAATGGATCCACATCCATGG-N ₄₀
      פריימר קדימה: GGAATGGATCCACATCCATGG
      פריימר ההפוך: ביוטין-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA
   2. לעצב את בדיקות לכידת cDNA להיות משלים לאזור 5'של הספרייה. בחר את האורך הראשוני על ידי ניתוח של תוכנת טמפרטורת התכה באינטרנט כדי לספק טמפרטורת התכה מעט מעל RT, עם כל אחד מהבסיסים הבאים אספקת טמפרטורת התכה מוגברת.
      לכידת mer Probe: CCATTCC-ביוטין
      Probe לכידת mer: TCCATTCC-ביוטין
      Probe לכידת mer: ATCCATTCC-ביוטין
2. לטהר את הספרייה על ידי HPLC הסטנדרטי. Desalting הוא suffiמספיק לפריימרים ובדיקות לכידה. מחדש oligonucleotides במי nuclease ללא בריכוז הרצוי ולאחסן ב -20 ° C עד מספר חודשים.

2. מאגר, הספרייה, והכנת דוגמאות

1. הכן 500 מיליליטר של חיץ בMillipore או מים כיתה nuclease ללא עם ריכוזים של 50 מ"מ טריס, 137 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl _2, pH 7.4. סנן את החיץ דרך קרום 0.2 מיקרומטר סטרילי; האחסון אפשרי בתנאי סביבה לחודשים.
   1. לחלופין, להשתמש במאגרים אחרים כגון PBS (נאגר מלוח פוספט), HEPES (4 (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic), וכו '
2. הקים שתי thermomixers; להגדיר אחד עד 95 מעלות צלזיוס ולשמור על אחרים בכל תנאי הסביבה (~ 20 ° C בעבודה זו). הכן דלי קרח.
3. חום / הצמד לקרר את ספריית ה- DNA על ידי הצבת ספריית μl 100 (~ 2.5 nmol 10 ¹⁵ -10 ¹⁶ רצפים) בthermomixer להגדירt C ° 95 במשך 5 דקות. מניחים את הצינור על קרח בזמן חרוזים המגנטיים מוכנים (סעיפים 3.1-3.6). קבע את הריכוז האמיתי של ספריית ה- DNA על ידי ספיגת UV ב λ = 260 ננומטר וליישם את מקדם ההמרה המתאים לספרייה.
4. הכן את פתרונות מניות היעד בהולם בינונית למסיסות היעד.
   1. הכן 100 מניות אנליטי מ"מ DMSO. מניות אלה הן מעשיות עבור כ 1 חודש, כאשר הם מאוחסנים בתנאי הסביבה, אבל מטרות שונות ידגימו פרופילי השפלה שונים.

3. הכנת חרוזים מגנטיים ועגולה ראשוניים של בחירה

1. 6.7 x 10 ⁸ חרוזים וורטקס / חרוזים מגנטיים streptavidin מצופה מיליליטר ולהסיר 400 μl לצינור microcentrifuge חדש. מניחים את הצינור על המגנט במשך 2 דקות ולהסיר את supernatant.
2. שטוף את החרוזים על ידי הוספת 400 μl של חיץ המחייב, vortexing, וaspirating supernatant לאחר הצבתהצינור על המגנט להפריד את החרוזים. חזור על תהליך זה שלוש פעמים.
3. לשתק את הבדיקה הלכידה על חרוזים המגנטיים ידי resuspending את החרוזים במאגר מחייב 400 μl עם 50 מיקרומטר בדיקה לכידה (סופית) ודוגר במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה על thermomixer בתנאי הסביבה.
4. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 400 μl של חיץ מחייב על ידי חזרה על השלבים לשטוף מתוארים בסעיף 3.2 להסרת בדיקה לכידה חופשית.
5. Resuspend את החרוזים 400 μl של חיץ מחייב. הסר של פתרון חרוז 100 μl לשלבים הבאים, ולשמר את 300 μl שנותר על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עבור סיבובי בחירה נוספים לתקופה מקסימלית של שלושה שבועות.
6. שטוף את החרוזים פעמיים עם 200 μl של חיץ מחייב כאמור בסעיף 3.2.
7. הוספה של הצמד 100 μl מקורר DNA מסעיף 2.3 לחרוזים נשטפו ודגירה למשך 30 דקות עם תסיסה עדינה באמצעות thermomixer בתנאי הסביבה.
   NOTE: ריכוזי DNA בסיבובים הראשונים הם גבוהים יותר מזה של הסיבובים הבאים כדי להקטין את איבוד רצף בסבבים קודמים שבו רצפים ייחודיים הם באופן תיאורטי הנוכחיים.
8. לכמת את ה- DNA בsupernatant באמצעות קליטת UV כאמורה בסעיף 2.3 ולחסר את זה מהסכום הראשוני הוסיף בסעיף 3.7 על מנת להעריך את כמות ה- DNA קשורה לחרוזים.
   1. שטוף את החרוזים עם 200 μl חיץ מחייב ואחריו שני שוטף נוסף עם 200 μl חיץ מחייב עם תסיסה עדינה על thermomixer 5 דקות בתנאי הסביבה.
9. Resuspend את החרוזים 200 μl של 100 מיקרומטר יעד מדולל בחיץ מחייב, ולסובב על thermomixer למשך 30 דקות בתנאי הסביבה. הכן את פתרונות העבודה טריים בתחילתו של כל יום לפני הבחירה כי היעד והשליטה נצפו כדי לצבור מתוך תמיסה מימית לאורך זמן. שמור את פתרון supernatant המכיל את רצף eluted היעדים למחקר נוסף.
10. לבצע סלקציה השלילית לאחר השלמת 1-2 סיבובים על ידי הוספת 200 μl של פרוגסטרון 1 מיקרומטר לחרוזים מוכנים בסעיף 3.8.1. ללחוץ בעדינות במשך 30 דקות על thermomixer בתנאי הסביבה.
11. השתמש במעמד המגנטי כדי ללכוד את חרוזים וזורקים supernatant, לשטוף את החרוזים פעמיים ב 200 μl של חיץ מחייב לפני בנוסף קורטיזול כאמור בסעיף 3.9.

4. ניטור והעשרה, PCR, וחד-גדילי DNA דור

1. מוסיף את פתרון supernatant לקלטת דיאליזה כדי לפקח על העשרת מבחר. דיאליזה יש צורך להסיר קורטיזול מDNA eluted כי קורטיזול הוא מצוי בריכוזים גבוהים בהרבה מה- DNA, ויש גם שיא ספיגה UV חופף _{מקסימום} λ DNA UV הסטנדרטי = 260 ננומטר.
   1. לבצע שלב זה בכל סיבוב אחר (סיבובים 2, 4, 6, 8 ו) בסיבובים המוקדמים של בחירה. זה מפחית את חומרת los מדגםs כאשר כמה פוטנציאל מספרי עותק של כל רצף הם (גיוון הגבוה ביותר) בהווה. לקבלת תוצאות מהירות יותר, שיטות חלופיות כגון עמודות הדרת גודל יכולות להיות מנוצלות גם כן.
2. Dialyze קלטת עם מדגם ב 250 מיליליטר הטרי של חיץ מחייב עבור שעה 2 בתנאי הסביבה פעמיים. החלף חיץ דגירה על 4 מעלות CO / N.
3. נתח את בריכת דיאליזה על ידי ספקטרוסקופיה UV כדי לקבוע את אחוז DNA eluted על ידי היעד (השווה לתוצאות של סעיף 3.8).
4. הכן ג'ל agarose 3% עם 1% w / רומיד ethidium v. בעבודה זו, להכין ג'ל מ1.5 גרם של agarose, 50 מיליליטר של חיץ טה (40 מ"מ טריס Acetate, 1 mM EDTA, pH = 8.0), ו- 10 μl במתיל ethidium.
5. מחזור לייעל את בריכת דיאליזה על ידי ביצוע בקנה מידה קטנה PCR (5 x 50 aliquots μl) באמצעות ~ 5-15 מחזורים. לרכיבי PCR, להשתמש חיץ 1x PCR תגובה (כל הריכוזים הסופיים), 200 מיקרומטר dNTPs, 10% נפח תגובה של תבנית ה- DNA, 500 ננומטר כל צבע יסוד, ו -2.5פולימראז U (2.5 U / μl המניה).
   1. הפעלה באמצעות PCR מותאם תנאים על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו מחזורים חוזרים ונשנים של 95 ° C (30 שניות), 55 ° C (30 שניות), ו- 72 ° C (1 דקות), ולאחר מכן 72 ° C (10 דקות) סיומת סופית ולהחזיק ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. להעסיק סולם סטנדרטי 25 נ"ב להשוואה וללדמיין על תרמי ג'ל. בחר את מספר המחזורים שמייצר את להקת העצמה הגבוהה ביותר בסמן הגודל הנכון ללא מוצרים אחר לא רצויים.
   3. לנתח את התוצאות של אופטימיזציה המחזור על ידי שילוב של 10 μl כל מחזור PCR עם 2 μl של צבע טעינת 6x הכחול / אורנג ', וטוען לתוך 5 בארות נפרדות של ג'ל agarose 3% מוכנים בשלב 4.4 (125 V 45 דקות).
6. לבצע PCR בקנה מידה גדול ניצול התנאים ומספר מחזור מתאים שנקבעו בסעיף 4.5. בדרך כלל 6-8 מיליליטר של PCR תגובות נדרשו להשיג 1-2.5 nmol משמשים לכל סיבוב בבחירה זו. השתמש בצינורות של 8 רצועה כדי לפשטטיפול בצינורות רבים הנדרשים לaliquot נפח זה להגברת PCR.
7. הכן 3% agarose ג'ל כפי שתואר בסעיף 4.4, ולאמת שלהקת מוצר PCR מופיעה במיקום הנכון בעקבות צעדי סעיפים 4.5.2-4.5.3.
8. להמיר את מוצר ה- DNA פעמיים תקועים כל מסעיף 4.7 לדנ"א חד-גדילים על ידי הצעדים המפורטים להלן:
   1. להוסיף 300 μl של חרוזים streptavidin מצופה (לא מגנטי) לטור קטן נחסם על ידי פריץ. שטוף את החרוזים עם 5 מיליליטר חיץ מחייב על ידי הצמדת מזרק luer נעילה והפעלת לחץ עדין לבוכנה. הסר את המזרק מהעמודה ולהסיר את הבוכנה מן המזרק off-line לאחר התוספת של כל חומר כל כך חרוזים אינם מופרעים על ידי שאיפה בוכנה.
   2. הוסף את מוצר ה- PCR ולהעביר אותו דרך העמודה באמצעות לחץ עדין על הבוכנה. השתמש בכמה עמודים כך שלא יותר מ 1-1.2 מיליליטר של מוצר ה- PCR מתווסף לכל עמודה. מחק את fl הסופיow דרך מאז DNA יישמר על העמודה על ידי מחצית ביוטין על הגדיל אנטי-הגיוני.
   3. לשטוף את העמודה עם 5 מיליליטר חיץ המחייב.
   4. Dehybridize DNA על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 0.2 M NaOH. שמור eluate מכיוון שהיא מכילה את ה- DNA התחושה היחיד תקועה.
9. Desalt ssDNA 0.2 M NaOH על ידי הוספת 0.5 מיליליטר לעמודת desalting שהוכנה על ידי שטיפה עם מים חינם nuclease. מחק את 0.5 מיליליטר הנוזל הראשוני, ולאחר מכן להוסיף מים חופשיים 1 מיליליטר nuclease ולאסוף מדגם ssDNA desalted זה. השימוש בעמודי desalting מרובים יידרשו לכל מנה 0.5 מיליליטר.
   1. קבע את הריכוז של DNA eluted על ידי ספיגת UV ב λ = 260 ננומטר.
   2. אבק יבש המדגם ומחדש בנפח מתאים של חיץ מחייב. אם לא היה מספיק DNA המתקבל לסיבוב הבחירה הבא, לחזור על סעיפים 4.6-4.9.2.

5. הסיבובים הבאים של בחירה וסידור

1. התאם את ההחמרה של תנאי הבחירה בהתאם לתוצאות ניטור ההעשרה (סעיף 4.1). בדרך כלל, לעשות תנאים מחמירים יותר בסיבובי בחירה רצופים כדי לבחור את הקלסר הזיקה הגבוה ביותר מהברכה.
   הערה: זה עלול להיות כרוך בשילוב של הגדלת ריכוז ה- DNA, הגדלת המספר, הזמן, או הנפח של הצעדים לשטוף, ומקטין את ריכוז היעד, להגדיל את הריכוז של המתחם שלילי הבחירה, או מגוון של שיטות אחרות ^27.
   1. החל בקרות נאותות כמתאימים כדי להבטיח את הספציפיות של הרצפים למולקולת היעד. בעבודה זו, יחול מולקולה שלילית בחירה (פרוגסטרון) למערכת (טבלת 1) מתחילה בסיבוב 3 וגוברים בריכוז לאורך כל הבחירה. החל מהשינה 11 עגולים, לפני דגירה בריכת DNA למשך 30 דקות עם פרוגסטרון 10-20 מיקרומטר לפני הקיבוע בחרוזים (לפני סעיף 3.7).
   2. להגדיל את האורך של החללית הלכידה לאחר העשרה מקסימלי הוא ציינה.
2. הכן את הבריכה האחרונה (עגול 15) ובריכות אחרות המייצגת (עגול 6) תנאים מקסימאלי מועשר (עגול 13) ומינימאלית מועשרים עבור סידור על ידי ההגברה PCR עם פריימרים תואמים ופולימראז נאמנות גבוה.
   1. הקים 50 μl תגובת שימוש בריכוזים סופיים של 1x (מאגר תגובה) נפח, 200 מיקרומטר (כל dNTP), 400 ננומטר (כל צבע יסוד), 0.5 μl של בריכת DNA, ו- 0.5 μl של פולימראז. מחזור אופטימיזציה עבור כל סיבוב באמצעות הפעולות המתוארות בסעיף 4.5 שימוש באותם תנאי PCR למעט אחיזת 7 דקות ב 72 מעלות צלזיוס להארכה הסופית.
   2. שלח 50 μl של הבריכות מוכנות למתקן רצף בצינורות microcentrifuge עם כובעים אטומים היטב בניילון ללא דבק. מניחים את הצינורות בצינור חרוטי 15 מיליליטר ארוז בניילון בועות וO ספינה / N עם שקיות קרח למתקן הרצף.
3. לקבוע את מספר העותק של כל רצף כדי להעריך את ההעשרה של בריכת הרצף (ים).
   1. השתמש בקוד-כתיבה / מיון צעדים (ראה קובץ קוד נוסף) לנתונים רצף של הדור הבא בפורמט FASTA כדי לקבוע את מספרי תדר / עותק של כל רצף חוזר ונשנה בנתונים עבור כל הבריכות מסופקות על ידי מתקן הרצף:
4. לנתח את הספציפיות וזיקה של רצפי עותק המספר הגבוהים ביותר. סוג אינטראקציה (חלבון או מולקולה קטנה), תכונות מבניות של aptamer על כריכה, וזיקה צפויה של יכתיב איזו שיטה מתאימה. נושא זה נבחן בפירוט נוסף במספר ההפניות ^1,28-30.

6. AuNP סינתזה וזיהוי

1. לסנתז AuNPs בשיטת הפחתת ציטראט ^21. לערבב 98 מיליליטר של מים Millipore עם 2 מיליליטר של 50 מ"מ ₄ HAuCl וחום לרתיחה.
2. הוסף 10 מיליליטר של נתרן ציטרט 38.8 מ"מ כברגע שמתחיל ריפלוקס. הצבע ישתנה לצבע אדום לאחר מספר דקות. ממשיך לבחוש הפתרון עבור 20 דקות עם את החום.
3. אפשר פתרון AuNP להתקרר לRT אז לסנן דרך קרום 0.2 מיקרומטר פוליאסטר. אחסן את כל השעיות AuNP בבקבוק כהה ענבר.
4. חשב את ריכוז AuNP על ידי ספיגת UV, באמצעות מקדם ההכחדה של 2.4 x 10 ⁸ L mol ^-1 סנטימטר ^{-1 31.} הריכוז היה 10 ננומטר בעבודה זו, עם גודל של 17 ± 0.6 ננומטר שנקבע על ידי אור דינמי פיזור ^21.
5. דגירה DNA עם 10 ננומטר AuNP לשעה 1 בתנאי הסביבה המוגנים על ידי רדיד אלומיניום. משתנה היקף AuNP לספק פתרון מספיק כדי לאפשר לכל הבדיקות הרצויות שיבוצעו (~ 1-2 מיליליטר). צפיפויות טעינה של 73, (מולקולות DNA לAuNP) 120, ו -200 D / NP נבדקו בעבודה זו, ואת עוצמת הקול והריכוזים ישתנו בהתאם.
6. לדלל את ה- DNA / AuNP פתרון 1: 1 באמצעות HEPמאגר ES (20 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl _2, pH = 7.4). אפשר התערובת לאזן ב RT מכוסה על ידי רדיד אלומיניום.
   הערה: הזמן הדרוש לצעד זה צריך להיות מותאם על ידי החוקר. בעבודה זו, פעמים שנעו בין כמה דקות לO / N נחקרו.
7. הכן אנליטי (קורטיזול, חומצת כולית, 2-methoxynaphthalene) פתרונות מניות בDMSO 100 מ"מ ומכסים ברדיד אלומיניום. הפוך את פתרונות ראשוניים טריים לפני כל ניסוי על ידי דילול של המניות עד 100 מיקרומטר בדילול 1/3 של חיץ קורטיזול המחייב (סעיף 2.1). יתר על כן לדלל את הפתרון הראשוני עם החיץ מחייב 1/3 כך שנפח קבוע (10 μl) של יעד נוסף כדי ליצור מגוון רחב של ריכוזים.
8. לייעל את ריכוז מלח נדרש על ידי הוספת 80 μl של DNA / פתרון AuNP עם 10 μl של 1/3 מאגר מחייב (המכונה "ריק").
   1. דגירה של 20 דקות ב RT ולאחר מכן להוסיף כרכים שונים של solut NaClיון. חפש את הנפח של מלח שגורם לשינוי בקושי חזותי בולט לכיוון גוון כחול לאחר תוספת מלח (13-40 μl של 1 M NaCl משמש בעבודה זו). זה מספק נקודת התחלה טובה, אבל ייתכן שיהיה צורך בכיוון נוסף בעקבות התוצאות כוללים בנוסף יעד.
9. לשלב 80 μl של DNA / פתרון AuNP עם 10 μl של פתרון היעד ודגירה במשך 20 דקות ב RT. לנצל צלחת 96-היטב ופיפטה רבה לנתח ריכוזי יעד מרובים בו זמנית, תמיד כולל ריק (סעיף 6.8).
   1. הוסף את הנפח המתאים של פתרון NaCl (13 μl של 1 M NaCl יושם בעבודה זו) ולנתח באופן מיידי את הספיגה ב 650 ו- 530 ננומטר באמצעות קורא צלחת.
10. עלילה התוצאות כיחס בין הערכים ספיגה (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ לעומת ריכוז היעד יחסי מנורמלים למדידה ריקה.

Results

החמרת התנאים בתחילה שמרה נמוכה כדי לשמור על קלסרים הנוכחיים במספרים נמוכים עותק בכמה סיבובים הראשונים. הסיבוב הראשון, בפרט, יישם את החומרה הנמוכה ביותר לשמר קלסרים בדרך כלל מוצגים כרצפים ייחודיים, שהפגינו הגבוה של קורטיזול וריכוזי DNA, וחוסר צעדי סלקציה שליליים. ההצלחה של בחירת aptamer זה בא לידי ביטוי בהתפתחות של הבריכות מאחוז נמוך eluted על ידי היעד (סיבוב 2) לחלק גבוה יותר eluted על ידי היעד שנשאר קבוע יחסית בסיבובים 12-13 (טבלה 1). רמה זו של ה- DNA eluted על ידי היעד היא באופן מסורתי נקודות קצה בבחירה ("ההעשרה"). עם זאת, שיטה זו העלתה עוד יותר את החומרה של הבחירה לאחר העשרה על ידי הגדלת האורך של חללית לכידת cDNA (איור 1). הארכת בדיקה זו מגדילה את כוחו של ההכלאה בין CDNוהבריכה, הגדלת טמפרטורת התכה (T _{מ ')} של המתחם, ודורש אינטראקציה חזקה בין היעד ורצף כדי לשחרר את הרצפים מחייבים לפתרון. הסיבוב של בחירה הראשונית מיושם אינטראקציה cDNA חלשה בשל בסיס אחד פחות G בסוף 5'של הספרייה. זה עולה בקנה עם תנאי החמרה בדרך כלל נמוכים יותר בסיבוב הראשון, ואינו צפוי להשפיע באופן משמעותי את הבחירה שלא על ידי המאפשר קלסרים פוטנציאליים יותר, כמו גם רצפי רקע (dehybridize מבוססים על תרמודינמיקה) לעבור לסיבוב הבחירה הבא. רצפי רקע אלה ממוזערים כבחירה המשיכה לכיוון העשרה על ידי יישום תנאי החמרה גבוהים יותר בסיבובי בחירה הבאים. כאשר cDNA הוארך מ7-mer ל8-mer ב -14 עגולים, אחוז DNA eluted על ידי היעד מופחת מ15.3% ל -11.1% לT _{מ 'עלה} מ 19.2 מעלות צלזיוס ל -26.7 מעלות צלזיוס. CDNA wכפי שהוארך בהמשך ל9-mer בסיבוב עם T _{מ 'של} 31.3 מעלות צלזיוס 15, שומט את כולל eluted 3.3%.

ניתן להשיג מידע נוסף על העשרה על ידי רצף כמה בריכות, שתי דוגמאות מועשרים ולא-מועשרות, כדי לעקוב אחר ההתקדמות של בריכות בכל סיבוב. רצף הדור הבא (NGS) התגלה כשיטת רבת עוצמה עבור סידור בבחירה, בעיקר בגלל רצף גבוה יותר קורא (מספר כולל של רצפים מדווחים) מתקבלים בהשוואה לסנגר רצף. רצף גבוה יותר אלה קורא להציג כיסוי גדול יותר מהמספר הכולל של רצפים בבריכה, מתן תמונה של הגיוון של רצפים מלאים יותר. NGS גם מסיר את ההטיה שיבוט ^32, ומאפשר לרצף של בריכות מרובות באצווה אחת עם התוספת של ברקודים ^24,33. NGS שימש לנתח את ההתקדמות של העשרה משלוש בריכות נפרדות בבחירת מדגם זה (איור 2). בריכותמהסיבוב 6 (העשרה קלה לעומת סיבוב 2 על ידי% eluted), סיבוב 13 (העשרה הגבוהה ביותר), ו -15 (ההחמרה הגבוהה ביותר) העגולה נבחרו כנציג נקודות של הבחירה. מספרי העותק של כל רצף ייחודי היו זממו כאחוז מהמספר הכולל של רצף קורא לכל בריכה. העליון המדורג (עותק המספר הגבוה ביותר) הרצף היווה רק 0.1% מכל הרצפים בסיבוב 6 (33435 רצפים כולל, 22463 רצפים ייחודיים). כברכה הופכת מועשרת מקסימלי ב -13 עגולים, עליות הרצף העליונים מדורגות למהוות 15.4% מכלל הבריכה (17681 רצפים כולל, 2987 רצפים ייחודיים), גבוהים יותר מאשר בסיבוב 150x 6 למרות ~ עליית 5x רק בהעשרה נצפתה על ידי UV . 15 עגול (28919 רצף כולל קורא, 2,980 רצפים ייחודיים) קפצו 44.9% מכל הרצפים מיוצגים על ידי הרצף העליון מדורג אחת למרות ניטור העשרת UV הראה כי הסכום eluted על ידי היעד היה ~ 5x נמוך מזה של 13 עגולים ( טבלת 1

15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

מחקרים קודמים בחנו את הכריכה של שני רצפים אלה על ידי thermophoresis microscale ודיאליזה שיווי משקל ^24. התוצאות הראו קורטיזול המשמעותי מחייבות ל15-1 _(ד K = 6.9 הרצף ± 2.8 מיקרומטר על ידי דיאליזה שיווי משקל; 16.177; 0.6 מיקרומטר ידי thermophoresis microscale) תוך מחייב מינימאלי נצפה בין קורטיזול ורצף 15-3. זה מראה כי האורך המוגבר של הבדיקה הלכידה ב -15 עגולים סייע במתן תנאי החמרה גבוהים יותר לנתח את קלסר הזיקה גבוה יותר. בנוסף, לא הרצף הפגין נצפים מחייב את מולקולת הסלקציה השלילית, פרוגסטרון, מראה בנוסף כי הצעדים הסלקציה השליליים היה מועיל להליך.

העובדה שקלסר זיקה גבוהה יותר נוצר לאחר העשרה מקסימלי (שנקבעה על ידי השיטה המסורתית של ניתוח אחוז DNA eluted על ידי היעד) לאחר החמרת תנאים גבוהים יושמו בסבב נוסף של בחירה מאמתת את השיטה להארכת האורך של לכידת cDNA בדיקה שלאחר העשרה. מופעי תוצאה זו שלהעתיק מספר מברכת רצף וזיקה ליעד עשויים להיות קשורים אך ורק תחת תנאים מסוימים ^24,34, בקוןTrast עם דו"ח קודם רומז קשר ישיר ^35. הוא גם מדגיש את היתרון של העשרת ניטור על ידי NGS, ולא אך ורק על ידי% האסטרטגיה eluted הנפוצה ברוב הבחירות, אשר עשויים להשתנות באופן טבעי מסיבוב אחד למשנהו כתנאי החמרה גבוהים יותר מוחלים. עם זאת,% eluted שימושי להעשרת ניטור כאשר תנאים דומים מיושמים על פני כמה סיבובים. לדוגמא, סיבובים 6-10 תנאים דומים כל המעורבים, ללא שינוי משמעותי בהעשרה (טבלת 1). כאשר זה נצפה על פני כמה סיבובים, התנאים צפויים מחמירים מדי כדי לקדם את ההעשרה, והחוקר צריך להקטין החמרה בסיבוב הבא. לדוגמא, הריכוז הקורטיזול הוגדל מ -35 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר בסיבובים 11-13, ו% eluted עלו מ -2.5% ב 10 עגולים 14.5% בסיבוב לכן 12.,% eluted יכול לשמש כמדריך להתאמת החמרה במהלך בחירה כאשר similar תנאים מושווים מסיבוב לסיבוב, ועשוי לספק מידע משלים לNGS לקביעת נקודת סיום בחירה.

רצף 15-1 היה מוחל על assay AuNP כדי לקבוע אם רצף נבחר באופן לייצר aptamer-מיתוג מבנה יתפקד בassay המסתמך על שינוי מבני הבאים היעד מחייב לייצר תגובה. מחקרים ראשוניים קודמים הראו כי assay AuNP עם 15-1 הגיב לקורטיזול הסמן הביולוגי הלחץ, אבל לא לשני סמנים אחרים של לחץ, אפינפרין ונוראפינפרין, או חומצת כולית, סמן של מחלת כבד מבני דומה לקורטיזול ^24. התגובה נצפתה בטווח הנורמלי של קורטיזול החופשי דווח בסרום אדם (~ 150-600 ננומטר) ^6, אימות שaptamer נבחר לשינוי מבני על קורטיזול מחייב מייצר תגובה בassay AuNP. בעבודה הנוכחית, אפיון המערכת נלקח צעד אחד קדימה על ידי התאמההכיסוי (הצפיפות) של 15-1 על פני השטח AuNP. שימוש באותו הסט של תנאים, כיסוי DNA הוגדל מ 73 D / NP (מולקולות DNA / AuNP), 120 D / NP ו -200 D / NP (איור 3). חומצת כולית מיוצרת תגובה מינימאלית, למעט 10 מיקרומטר ב 200 D / NP. התגובה של assay פחת ככיסוי הוגדלה כפי שעשה את גבולות זיהוי (לוד). לוד הייתה 29.5 ננומטר עבור 73 D / NP, 145.2 ננומטר ל -120 D / NP, ו27.3 מיקרומטר עבור 200 D / NP. תוצאה זו מסכימה עם עבודתו של סמית et al., שהמחיש כי התגובה של assay AuNP ניצול aptamer קוקאין ירד כאשר כיסוי aptamer הוגדל מ -60 D / NP 300 D / NP ^36. משמעות הדבר הוא כי טווח הגילוי ליעד של ריבית יכול להיות מותאם על בסיס אופטימיזציה של כיסוי פני השטח DNA בassay AuNP. זה יכול להיות מועיל כאשר משווה, למשל, בטווח של קורטיזול החופשי בסרום אדם (~ 150-600 ננומטר) לעומת רוק אנושי (~ 5-25 ננומטר) ^{6,37. בעוד נוזלים פיסיולוגיים הם הרבה יותר מורכבים מassay החיץ הזה, שהתוצאות מספקות הארכה על עבודת ההוכחה של עיקרון הוכחה כי יכולים להיות מותאמים תנאי AuNP בהתאם ליישום, וכי עבודה נוספת לקראת ההרחבה בינונית לנוזלים ביולוגיים תהיה המעניין את קהילת biosensor.}

איור 1. סקירה כללית של שיטת בחירה-מיתוג מבנה. בדיקה לכידת cDNA biotinylated קטנה היא משותקת על חרוזים מגנטיים streptavidin מצופה. CDNA הוא משלים לאזור 5'של הספרייה, והכלאת הספרייה לחרוזים. כאשר היעד הוא הוסיף, שינוי קונפורמציה מושרה לשחרר רצפים המחייבים מהחרוז, המאפשר החלוקה הקלה על ידי יישום מגנט. Supernatant נשמרים כדי לפקח העשרה (DNA% eluted על ידי היעד ה) על ידי UV לאחר dialyzing היעד מ DNA. צעד זה נחוץ רק אם מולקולת היעד סופגת באותו הטווח UV כמו ה- DNA. רצפים אז PCR מוגברים ומוכן לסיבוב הבחירה הבא. כבחירה מתקדמת, סלקציה שלילית מיושמת, שבו רצפי eluted על ידי מולקולת הסלקציה השלילית מבוטלים, והחרוזים עם קלסרים יעד פוטנציאליים אז הודגרו עם יעד. האורך של חללית cDNA הוא גדל הבא העשרה מקסימלי (% eluted) כדי להגדיל את החומרה של הבחירה. נתון זה כבר הודפס מחדש באישור מ ^-24. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עגול	[קורטיזול] (מיקרומטר)	[פרוגסטרון] (מיקרומטר)	DNA Bound (pmol)	% Eluted על ידי יעד	אורך cDNA
1	100	0	357.57	N / A	7-mer
2	50	0	145.49	1.4	7-mer
3	50	1	188.74	N / A	7-mer
4	50	5	336.4	2.3	7-mer
5	35	5	88.05	N / A	7-mer
6	35	10	303.89	3.1	7-mer
7	35	10	255.01	N / A	7-mer
8	35	10	236.81	2.1	7-mer
9	35	10	318.95	2.6	7-mer
10	35	10	297.18	2.5	7-mer
11	100	10	147.61	N / A	7-mer
12	100	10	154.36	14.5	7-mer
13	100	10	150.39	15.3	7-mer
14	75	20	247.71	11.1	8-mer
15	50	40	409.63	3.3	9-mer

טבלת 1. התקדמות בחירה והעשרה על ידי% elution ²⁴ < strong>. N / A (לא ישים) מדווח לסיבובים שבי ניטור העשרת הדיאליזה / UV לא בוצע בסבבי בחירה מוקדמים לצמצום אובדן של רצפי מספר נמוך עותק. טבלה זו כבר הודפס מחדש באישור מ ^-24.

העשרת איור 2. בחירה נקבעת על ידי רצף של הדור הבא () סיבוב 6.; (ב) עגול 13; רצפים (C) עגול 15. היו מדורגים על פי להעתיק מספר. רצף עותק המספר הגבוה ביותר עלה מ מהווה אחוז נמוך של בריכת רצף כולו בסיבוב 6 (0.1%) לשיעור גבוה ב -15 (44.9%) עגולים כברכה הועשרה לרצפי קורטיזול מחייבים. נתון זה כבר הודפס מחדש באישור מ ^-24.et = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. תגובת AuNP assay ממשתנה aptamer 15-1 כיסוי. הצפיפות של aptamer הודגרו עם AuNPs הוגדלה מ 73 D / NP (משולש אדום), 120 D / NP (ריבוע ירוק) ו -200 D / NP ( העיגול כחול). תגובות קורטיזול הן צבעים עזים, תגובת חומצת כולית היא בצבעים בהירים. תגובת assay משופרת עבור קורטיזול בצפיפויות נמוכות יותר, וכך להקטין את לוד ואת טווח היעד יכול להיות מזוהה ב. התנאים עם תגובת הקורטיזול הגבוהה ביותר (73 D / NP) התאפיינו נוסף בטווח ליניארי כדי לספק יותר נקודות בתוך הטווח הנורמלי הצפוי של קורטיזול החופשי דווח בסרום אדם (~ 150-500 ננומטר) ורוק (5-25 ננומטר ) ^6,37. התגובה המינימלית של חומצת כולית יישום אותה 73 תנאי D / NP יש להיותמפורט en בעבודה קודמת ^24. כל החלקות מייצגות את הממוצע ± SEM למדידות כפולות או שלושה עותקים.

. איור 4. נציגי תוצאות ממחזור PCR אופטימיזציה משמאל לימין הבארות מייצגות: 4 מחזורים, 6 מחזורים, 8 מחזורים, 10 מחזורים, 12 מחזורים, (לא תבנית ה- DNA) שלילית, סטנדרטי סולם DNA 25 נ"ב. תנאים אופטימליים הם נצפו בשעה 8 מחזורים, בו להקת המוצר היחידה היא בעצמה גבוהה ללא מוצרים על-הגברה נוכחים במחזורים גבוהים.

אופטימיזציה איור 5. AuNP זמן הדגירה assay. זמן הדגירה של שלב AuNP / DNA על 73 D / NP הופחתה מ O / N (איור 3) עד 30 דקות, וincu היעדbation היה מייד אחריו תוספת מלח ולא לאחר 20 דקות (איור 3). (א) תגובה הוא ציין לקורטיזול (יהלומים כחולים), אבל לא לחומצת כולית (עיגולים ירוקים) או 2MNP (2-methoxynaphthalene; ריבועים אדומים). כל החלקות מייצגות את הממוצע ± SEM למדידות כפולות או שלושה עותקים. (ב) משמאל לימין: ריק, 10 קורטיזול מיקרומטר, 10 מיקרומטר חומצת כולית, 10 מיקרומטר 2MNP. שינוי חזותי ניתן לראות בעין בלתי מזוינת לקורטיזול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

העובדה שמולקולות קטנות הן עניין ביולוגי, אלא רק מהוות 19% מכלל aptamers דיווחה הופכת שיטות שנועדו לבחירת aptamers החלימה על מולקולות קטנות של משמעות רבה. SELEX של מולקולות קטנות הוא מאתגר במיוחד כקבוצות פחות פונקציונליות, מוטיבים מבניים, ופני שטח זמינים לאינטראקציה עם רצפים בהשוואה לחלבוני ^1, וזה כבר העריך כי פחות מ -30% מבחירות לכל המטרות ניסו הביאו aptamer ^38. לכן, אחד חייב להיות מודע במיוחד של תכנון וביצוע ניסויי על מנת לבחור aptamer ליעד מולקולה קטן בהצלחה.

שיטת בחירת aptamer המתוארת בעבודה זו היא יתרון משום שהוא חל על מולקולות קטנות ללא צורך בשינוי כימי שעשויים לשנות את מאפייני מחייבם. זה גם elution מבוססת, מה שאומר שמאז tהוא DNA, ולא היעד, תחילה מחויב אז eluted מן חרוזים המגנטיים על ידי היעד, DNA אינטראקציה עם מטריצת חרוז לא להיות מוגבר לסיבוב הבחירה הבא בגלל קלסרים למולקולה של העניין משתחררים לחיץ supernatant וקלסרים מטריצה ​​ספציפיים יישארו כבול. לעומת זאת, שיטה שלילית בחירה נגד מטריקס נדרש לשיטות שלשתק את היעד לתמיכה המוצקה בכל סיבוב, כי ה- DNA שאינטראקציה עם המטריצה ​​יהיה מוגבר בנוסף לקלסרים היעד ^1. השיטה הנוכחית תוכננה כאסטרטגיה מבחר המצומצם T _{מ '.} משמעות דבר היא כי _{מ 'T} של הכלאה / בריכת cDNA נשמר קרוב לRT. מורס משמש אסטרטגיה דומה, אבל מיושם בדיקה cDNA 6-mer עם T _{מ '<10} ° C עם תנאי בחירה על 4 מעלות צלזיוס ^17. היישום שלנו היה לassay biosensing בוצע ב RT, כך אורכו של cDNA הותאם לפיly. דבר זה שומר את ההחמרה של מבחר הנמוך מספיק כדי שקלסרים פוטנציאל לא הולכים לאיבוד בגלל האינטראקציה מחייבת היעד מתרחשת במיקום מרוחק שלא לגרום לשינוי קונפורמציה מסוגל לשבש cDNA מחייב. עם זאת, יעילות חלוקת השיטה המוצעת היא נמוכה בגלל כמה רצפים יהיו dehybridize מבוסס אך ורק על תרמודינמיקה. בניגוד לכך, Nutiu מיושם et al. CDNA 15 mer-, והיו רק מסוגל לזהות aptamers לשניים מארבע המטרות, אולי בגלל T _{מ 'של} 15 mer-היה גבוה מכדי לאפשר שחרור על ידי יעד מולקולה קטן ^18. לכן, בעוד שאסטרטגית הבחירה הנוכחית תדרוש סיבובים רבים כדי להסיר רצפי רקע, על ידי שליטה על החומרה של הבחירה ומזעור אובדן קלסרים פוטנציאל סיכויי הצלחה של יוגדלו.

חוקרים רבים חדשים לבחירת aptamer אינם מודעים להיבטים חשובים הקשורים לPCR שלקלסרים פוטנציאליים. אופטימיזציה מחזור (סעיף 4.5) נחוצה משום-הגברה מעל ספריות DNA מייצרת לא רצויה על ידי-מוצרים (בדרך כלל גדולים יותר בגודל) במספרי מחזור גבוהים, ואת המוצר הרצוי עלול להיעלם לחלוטין עם עודף של רק 5 מחזורים ^39. במקרה של הגברה מעל, מוצרי PCR כבר לא מייצגים אותם רצפי eluted על ידי היעד, ואת סיכויי הצלחת בחירה הם פחתו באופן משמעותי. איור 4 ממחיש דוגמא של מחזור אופטימיזציה מסיבוב 5 בעבודה זו. המחזור הנמוך ביותר מייצר להקת מוצר מינימאלית, עולה להקה בסכום עד 8 מחזורים; בשעה 10 במחזורים הלהקה מתחילה מעבר למוצר על-הגברה גודל גבוה יותר, והוא כמעט שכולו המוצר-מוגבר מעל תוך 12 מחזורים. פרט נוסף שחוקרים רבים חסרי הניסיון בSELEX יכולים להתעלם הוא שכל הבריכה צריכה להיות מוגברת בהגברת PCR בקנה מידה הגדולה (סעיף 4.6) באשוחרח 'סיבוב כדי להקטין אובדן קלסרים. מספר הרצפים אפשריים ייחודיים מoligonucleotides הוא 4 ^N, שבו 4 מייצג את ארבעת בסיסי חומצות גרעין, וN הוא מספר הבסיסים באזור של הספרייה האקראי. עבור עבודה זו, N = 40, וכתוצאה מכך חלל רצפים של 1.2 x 10 ²⁴ רצפים ייחודיים אפשריים. 2.5 nmol של ספרייה משמשת בסיבוב הראשון של בחירה מתאימה ל~ 10 ¹⁵ מולקולות, כלומר כל עותק של ה- DNA סביר מיוצג בבריכה הראשונית כרצף ייחודי. לכן, כל הנפח של DNA eluted מן החרוזים על ידי היעד חייב להיות מוגבר כדי לשמור עותק של כל קלסר פוטנציאלי לסיבוב הבחירה הבא. ברגע שהגברה ראשונית זה התרחשה, מספר עותקים זמינים לבחירה בסיבובים הבאים שבו פתרון הומוגני הנחה לדגימה.

גם הריכוז של היעד יש לשקול בזהירות בכל סיבוב. Nutiu et al. שימושריכוז da של 1 מ"מ יעד לאורך כל תהליך הבחירה, ונבחר aptamer ATP עם _ד K = 600 מיקרומטר ^18. שניהם העבודה הנוכחית והמחקר של מורס ¹⁷ התחילו עם 100 מיקרומטר יעד, ירידה לאורך הקורס של הבחירה, והביאו aptamers עם זיקה מייקרו נמוכה. בדיוק איזה סיבוב ההחמרה צריך להיות מוגבר (ריכוז היעד נמוך יותר) תלוי מתי העשרה הוא ציין. עוד צעד קריטי הוא ליישם צעדי סלקציה שליליים נכונים כל כך aptamers להפגין ספציפי למולקולת היעד. השולט משמשים מותנה ביישום המיועד של aptamer נבחר. לדוגמא, aptamer 15-1 נועד לתפקד כאלמנט הכרה בassay biosensing לקורטיזול, כך פרוגסטרון שימש כמולקולת סלקציה שלילית משום שהוא מבשר חילוף חומרים לקורטיזול, כי הוא נמצא בנוזלים פיסיולוגיים ^40. Aptamer ATP שנבחר על ידי et al Nutiu. </ Em> לא כלל שלב סלקציה שלילי, ואינטראקציה עם מולקולות דומות מבני כוללים ADP, AMP, אדנוזין, וdATP ^18.

הערה אחרונה בתמורה היא שassay AuNP לעתים קרובות דורש אופטימיזציה רבה לכל זוג aptamer / יעד. מחפש את עוצמת הקול של מלח שגורם לשינוי בקושי חזותי בולט לכיוון גוון כחול לאחר תוספת מלח הוא נקודת התחלה טובה, אבל התאמה של נקודת ההתחלה ייתכן שתהיה צורך לבחון את התגובה. יש לנו גם מצאתי כי assay מייצר תגובות שונות באופן דרסטי בהתאם לריכוז חיץ (חיץ הבחירה עשוי לדרוש דילול בגלל ריכוז מלח הגבוה של מאגרים לעתים קרובות גורם לצבירה) והרכבו, מידת כיסוי DNA (איור 3), הכנת מדגם (חלק אורגני ממסים המשמשים להמסת היעד עלולים לגרום רקע גבוה שמסכות למקד תגובה), טמפרטורה, סוג מלח וריכוז, ואינקובטוריםזמן tion (של שני DNA עם AuNP וDNA / AuNP עם יעד). בתנאים מותאמים באופן מלא, תוצאות נצפו בדרך כלל עם <דקות זמן דגירה יעד 5, הממחישות את התועלת של תגובה מהירה יעד של פלטפורמת biosensing AuNP. לדוגמא, באיור 5 זמן הדגירה של aptamer / צעד AuNP הופחת מ O / N (איור 3) עד 30 דקות, ומלח התווסף מייד (<10 שניות) לאחר תוספת היעד ולא 20 דקות מאוחר יותר (איור 3 ) בצפיפות טעינה של 73 D / NP. זה הגדיל את תגובת הקורטיזול ל~ 82% גבוהים יותר מאשר (איור 5 א) הריקים בריכוז 10 מיקרומטר יעד לעומת ~ 40% באמצעות התנאים הקודמים (איור 3). תגובה זו יכולה להיות מכובדת בעין בלתי מזוינת (איור 5). שים לב שהטווח ליניארי של זיהוי קורטיזול הוא שונה מאשר שימוש בתנאים הקודמים, מצביע על כך שתנאים אלה יכולים להיות מותאמים לרצוייםטווח גילוי. חומצת כולית ובקרות 2-methoxynaphthalene (2MNP) לא הניבו תגובה משמעותית (איורים 5 א-ב). חוקרים חייבים להיות מודעים לכך שצמצום זמני דגירה אלה עשויים להקל על תגובה מוגברת של analytes עם משטח AuNP, אשר יכול לתרום לאות כוללת משופרת (יעד) או רקע (מולקולות שאינם יעד). לכן, אפיון עיצוב assay וביצועים זהיר AuNP הוא הכרחי עבור כל זוג aptamer / יעד.

הליך זה מתאר את פרוטוקול לבחירת aptamers קטנה מולקולה-מיתוג מבנה שפועלות בפלטפורמת biosensing כגון assay AuNP המתואר, הדורש שינוי קונפורמציה של DNA כדי לזהות הנוכחות של היעד. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות biosensor אחרות כגון אלקטרוכימיים או הקרינה המתפקדות באותה הנחת היסוד עבור כמעט כל יעד בגודל. כוחו של הפרוטוקול ניתן לפתח בניסוי נוסף על ידיכמה גישות. ראשית, הבחירה עצמה עשויה להיות שיפור פוטנציאלי על ידי חקירת שיטות של אופטימיזציה כגון קביעת T _{מ 'האידיאלי} של הכלאה / ספריית cDNA המספקת אינטראקציה שהיא חלש מספיק כדי אינטראקציה עם יעד מולקולה קטן, אך חזק מספיק כדי להפחית את הכמות רקע רצפים dehybridized אך ורק מתרמודינאמיקה. זה לדחוס מספר המחזורים הנדרשים לבחירה, תוך חיסכון בזמן בעבודה והפחתת הצריכה מגיב. חקירות נוספות לשינויים בבחירה תהיה לקבוע את הריכוזים החיוביים ביותר של חרוזים ו- DNA, כך שאוכלוסייה מגוונת של רצפים חשופה ליעד, במיוחד בסיבוב הראשון. ההצלחה של ניסויי הוכחה של עיקרון אלה מספקת תשתית להשקיע משאבים נוספים לקראת אופטימיזציה והתאמת assay חיץ AuNP לנוזלים פיסיולוגיים. יש צורך לגיטימי לפלטפורמת biosensing מהירה, חזקה שיכול פוnction ככלי אבחון של המצב הפיזיולוגי של אדם, ופיתוח נוסף של assay AuNP בסרום אנושי, זיעה, או רוק יפגוש פער הנוכחי.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads M280 Streptavidin	Invitrogen	112.06D	תואם למגנט DynaMag-2
מגנט DynaMag-2	Invitrogen	12321D	תואם ל-Dynabeads M280 סטרפטווידין
סטרפטווידין ספרוז ביצועים גבוהים	GE Healthcare	17-5113-01	זהו מוצר סטרפטווידין בצפיפות גבוהה להכנת ssDNA
הידרוקורטיזון	סיגמא	H4001	≥ 98%
פרוגסטרון	סיגמא	P0130	≥ 99%
חומצה כולית	Sigma	C1129	≥ 98%
NanoDrop ND-1000	NanoDrop	ND-1000	הוחלף בדגם ND-2000
Tris Base	Promega	H5135	≥ 99.9%
נתרן כלורי	Sigma	S9888	≥ 99.5%
מגנזיום כלוריד הקסהידרט	פלוקה	63068	≥ 98%
500 מ"ל מערכת סינון	קורנינג	430769	0.22 ומיקרו; m תאית אצטט ממברנה
DNA	ספריית אופרון	מותאם אישית	HPLC מטוהר
כל שאר	ללכידה מותאמים אישית	IDT	& #8212; מותפל; אפטאמרים — HPLC
תרמו-מיקסר	Eppendorf	R	כל דגם עם  בקרת טמפרטורה ומהירות ערבוב יעבוד
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn	Agilent	600674	Taq polymerase ניתן להשתמש גם
בתערובת דאוקסינוקלאוטיד, PCR-Grade	Agilent	200415	מותגים אחרים יעבדו כאן
10x Pfu משובט DNA פולימראז מאגר	Agilent	200532	מאגר זה עבר אופטימיזציה עבור PfuUltra II פולימראז
GeneAmp PCR System	Applied Biosystems	9700	כל מודל המאפשר לחוקר לפתוח מכסה לאופטימיזציה של מחזור יעבוד
Agarose-LE	Ambion	AM9040	≥ 99.9%
אתידיום ברומיד	סיגמא	E-1510	רעילות חריפה, שאיפה; חשד לסרטן
עמודות סינתזה ריקות, 1 ומיקרו; m Expedite Style	Glen Research	20-0021-01	דגם זה אידיאלי בגלל התאמת Luer-Lok לשילוב עם מזרק
החלפת מסננים Expedite	Glen Research	20-0021-0F	1 & micro; m גודל
Illustra NAP-25 עמודות	GE Healthcare	17-0852-01	כל מותג עם עמוד סינון ג'ל שרף בדרגת DNA יעבוד
קלטת דיאליזה Slide-A-Lyzer קלטת	ThermoFisher Scientific	66205	2k MWCO בשימוש
זהב (III) כלוריד הידרט	סיגמא	254169	99.999% טוהר חשוב
נתרן ציטראט דיהידראט	SAFC	W302600	מצאנו כי התרכובת המיוצרת מיצרנים שונים משפיעה מאוד על מבחני AuNP
SpectraMax	מכשירים מולקולריים	M5	התוצאות היו דומות למערכת Bio-TEK
Synergy	Bio-TEK	HT	התוצאות היו דומות למערכת התקנים מולקולריים
HEPES Buffer	Amresco	J848	כל מותג שמייצר מוצר מעוקר יעבוד
250 מ"ל מערכת	סינון קורנינג	430767	0.22 ומיקרו; m קרום אצטט
תאית ספקטרופוטומטר UV	Varian	Cary 300	מותגים אחרים יעבדו כאן
מזרק 5 מ"ל	בקטון-דיקינסון	309646	דגם זה אידיאלי בגלל התאמת Luer-Lok לשילוב עם עמודת Expedite
ThermoEC Minicell Primo	ThermoFisher Scientific	EC320	תואם לספק
כוח ספק כוח	Fisher Scientific	FB300	תואם ל-ThermoEC Minicell Primo
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418	דליק נוזל
2-מתוקסינפתלין	סיגמא	148245	99%
צלחת בדיקה	קורנינג	3370	96 בארות תחתית שטוחה, סטרילית