הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

9.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52550

⸱

4 במרץ 2015

 ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, University of Ulm

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול המספק כלי לבחינת מנגנוני ויסות של גנים ספציפיים במהלך התפתחות ההיפוקמפוס. שימוש באלקטרופורציה מחוץ לרחם ותרבית פרוסות אורגנוטיפית מאפשר ויסות למעלה ולמטה של ביטוי הגנים המעניינים בתאים בודדים ולעקוב אחר גורלם במהלך ההתפתחות.

תקציר

גנטיקה של עכברים מציעה כלי רב עוצמה הקובע את תפקידם של גנים ספציפיים במהלך ההתפתחות. ניתוח הפנוטיפים המתקבלים בשיטות אימונוהיסטוכימיות ומולקולריות מספק מידע על גנים ומסלולי איתות פוטנציאליים. כדי להבהיר עוד יותר מנגנוני ויסות ספציפיים נדרשת מערכת המאפשרת מניפולציה של מספר קטן בלבד של תאים של רקמה ספציפית על ידי ביטוי יתר, אבלציה או החדרה מחדש של גנים ספציפיים ולעקוב אחר גורלם במהלך ההתפתחות. כדי להשיג זאת אלקטרופורציה מחוץ לרחם של מבנים בהיפוקמפוס, במיוחד הפיתול המשונן, ואחריו תרבית פרוסות אורגנוטיפית מספקת כלי כזה. שימוש במערכת זו ליצירת מחיקות פסיפס מאפשר לקבוע אם הגן המעניין מווסת תהליכי התפתחות אוטונומיים של תאים כמו התפשטות תאי אב או התמיינות עצבית. יתר על כן, הוא מקל על הצלת פנוטיפים על ידי החדרה מחדש של הגן שנמחק או גני היעד שלו. בניגוד לאלקטרופורציה ברחם, גישת הרחם משפרת את שיעור ההתמקדות המוצלח בשכבות עמוקות יותר של המוח כמו הבליטה המשוננת. בסך הכל, אלקטרופורציה מחוץ לרחם ותרבית פרוסות אורגנוטיפיות מספקות כלי רב עוצמה לחקר מנגנוני ויסות בסביבה ילידית למחצה המשקפת תנאים אנדוגניים.

מבוא

ההיפוקמפוס ממלא תפקיד חשוב בזיכרון ולמידה, כמו גם התנהגות רגשית. פונקציה העיקרית אחת מורכבת מהאיחוד של זיכרון לטווח קצר לזיכרון לטווח ארוך, אשר דורש גמישות גבוהה של מערכת העצבים. Gyrus המשונן של ההיפוקמפוס פועל כשער העיקרית למידע קלט, והוא גם אחד משני אזורים במוח עם neurogenesis המתמשכת לאורך בגרות 1,2. הפיתוח של המבנה בהיפוקמפוס מתרחש במהלך עובר מאוחר ובמיוחד בלידה 3 עד 4 שבועות הראשון 3. במהלך ההתפתחות המוקדמת של המשונן gyrus בריכת תאי גזע הוקמה דרושה ללידה, כמו גם neurogenesis למבוגרים 4. נוירונים פיתוח עוברים דרך שלבים שונים, מתאי הגזע דרך מספר שלבים של תאי אב ללא בשלה ולבסוף נוירון הבוגר במהלך לידה, כמו גם neurogenesis למבוגרים. בשלבים שונים של neurogenesis הביטוי שלגנים ספציפיים נדרש כדי לאפשר ההבשלה ואינטגרציה של נוירונים חדשים לתוך המעגלים בהיפוקמפוס 5,6.

שימוש בגנטיקת עכבר וניתוח הפנוטיפ על ידי אימונוהיסטוכימיה כמו גם שיטות מולקולריות אפשר הגדרת דפוס ביטוי ותפקודם של רבים מהגנים האלה. בניתוח microarray בנוסף, כמו גם immunoprecipitation הכרומטין (שבב) סיפק מידע על גני מטרה ישירים ועקיפים פוטנציאל 7,8. עם זאת, יש עדיין שאלות רבות פתוחות בנוגע למנגנוני הרגולציה של פיתוח בהיפוקמפוס, בפרט הפיתוח של הגירוס המשונן. כדי להשיג תובנה נוספת כיצד גנים מסוימים מוסדרים מערכת נדרש המאפשרים המניפולציה של מספר קטן של תאים על ידי למטה או למעלה-רגולציה של הגן של ריבית ו / או גני המטרה שלה ולעקוב אחרי גורלם בפיתוח. ברחם electroporation של shRNAs, cDNA של גנים של עניין או recombina Crese מספק כלי כזה. כדי להבטיח את הנוכחות של פלסמידים ביטוי ה- DNA הרצוי או RNA הקטן אמורים לשמש עבור electroporation. גישה זו מיושמת בהצלחה רבה בלימוד פיתוח קליפת המוח 9,10, אך היא גישה מאתגרת יותר בוחנת את התפתחות gyrus המשונן בשל המיקום של המבנים בהיפוקמפוס בשכבות עמוקות יותר במוח.

electroporation ברחם לשעבר ואחריו התרבות הפרוסה organotypic הוא גישה אחת לעקוף בעיה זו 11,12. בניגוד לelectroporation ברחם לא כל העובר אלא רק את הראש משמש מאפשר לכן להציב את האלקטרודות באופן חיובי יותר לכוון את shRNA / DNA להיפוקמפוס והגירוס המשונן. הקבוצה שלנו מועסקות בהצלחה electroporation לשעבר הרחם כדי ללמוד את התפקיד של גורם שעתוק Bcl11b במהלך פיתוח gyrus המשונן 8. יש Bcl11b תפקיד כפול בפיתוח gyrus המשונן על ידי regulating התפשטות תאי אב, כמו גם בידול כפי שהודגם על ידי אימונוהיסטוכימיה. כדי להגדיר מנגנון למעורבות Bcl11b בתהליכים אלה נוספים, פרוטוקולים של קבוצת Polleux 11,12 הותאמו ללמוד gyrus המשונן כמתואר להלן בסעיף הפרוטוקול. בגישה ראשונה השאלה הופנתה אם Bcl11b הוא מסדיר תא התמיינות תאים עצבי אוטונומית. גישה שנייה בדקה האם Desmoplakin, גן המטרה ישיר של Bcl11b, די בכך כדי להציל את הפנוטיפ Bcl11b.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לחוק הגרמני ואושרו על ידי משרדי הממשלה בטובינגן.

1. הכנת Micropipettes, פתרונות וממברנות

  1. הכנת Micropipettes
    1. משוך micropipettes זכוכית באמצעות חולץ micropipette עם התכנית הבאה: חום: 540, משוך: 125, מהירות: 20 ועיכוב: 140. כמויות אורך המחט ל -5.5 סנטימטר.
    2. מחטי פוע באמצעות microgrinder להשיג גודל קצה מתאים של 4 מ"מ. אחסן את המחטים בקופסא או 15 סנטימטר צלחת פטרי כדי למנוע פגיעה של הטיפים.
  2. הכנה של פתרונות
    1. פלסמיד דנ"א פתרון
      1. הכן את ה- DNA פלסמיד המכיל את מבנה cDNA הרצוי באמצעות ערכת Maxi-הכנת רעלן פנימית ללא על פי הפרוטוקול של היצרן.
      2. התאם פתרון פלסמיד DNA לריכוז סופי של 3 מיקרוגרם / μl (ללא וקטור ספייק GFP) או 4 מיקרוגרם /μl (עם 1 מיקרוגרם של וקטור ספייק GFP) ברעלן פנימי לשחרר חיץ טריס-EDTA המכיל גרין המהיר (ריכוז סופי של 0.05%).
    2. פתרון במלאי Laminin
      1. לפזר 1 מ"ג של laminin במים סטריליים כדי נפח סופי של 1 מיליליטר. הכן 100 aliquots וחנות μl ב -80 ° C.
    3. פולי-L ליזין פתרון במלאי
      1. לפזר 50 מ"ג של פולי-L ליזין ב 50 מיליליטר של מים סטריליים לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר. הכן 1 מיליליטר aliquots ולאחסן ב-20 ° C.
    4. השלם מאוזן תמיסת מלח של האנק (שלם HBSS)
      1. הכן HBSS השלם על ידי שילוב של 10x HBSS 100 מיליליטר, 2.5 מיליליטר של חיץ 1 M HEPES (pH 7.4), 30 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז, 10 מיליליטר של 100 מ"מ CaCl 2, 10 מיליליטר של 100 מ"מ MgSO 4, ו -4 מיליליטר של 1 M NaHCO 3. מוסיף מים עד לסטרילי 1 ליטר ולאחסן ב 4 ° C.
        הערה: החיטוי כל הפתרונות מצפים 1 M HEPES חיץ ו1 M D-גלוקוז, אשר filter מעוקר.
    5. Slice תרבות בינוני
      1. להכין מדיום התרבות פרוסה על ידי הוספת 35 מיליליטר של Basal נשר בינוני, 12.9 מיליליטר של HBSS המלא (1.2.4), 1.35 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז, 250 μl של L-גלוטמין 200 מ"מ, ו -500 μl של פניצילין, סטרפטומיצין ל להשיג נפח סופי של 50 מיליליטר. להוסיף סרום סוס לריכוז סופי של 5% וחנות על 4 מעלות צלזיוס.
    6. נקודת התכה נמוכה (LMP) Agarose
      1. הכן 4% פתרון agarose LMP על ידי הוספת 2 גרם של LMP agarose 50 מיליליטר של HBSS המלא (1.2.4) ואחריו על ידי חימום במיקרוגל במשך 1-2 דקות בעצמה גבוהה. שמור פתרון זה באמבט מים ב 37 - C ° 39. אחסן את הפתרון ב 4 ° C. והשימוש חוזר.
    7. פתרון paraformaldehyde
      1. במנדף להכין פתרון paraformaldehyde 4% (PFA) על ידי הוספת 4 גרם של paraformaldehyde לשל 1x PBS 100 מיליליטר. מחממים את הפתרון עד 60 ° C ולהוסיף כמה טיפות של 1 N NaOH עד הפתרון הופך גליר.
    8. Permeabilization פתרון
      1. לפזר 9 גרם של BSA ב300 מיליליטר של 1x PBS המכיל Trition 0.3% X-100 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף 10% אזיד הנתרן לאחסון ארוך טווח.
  3. ציפוי של הוספת ממברנה
    1. לדלל aliquot אחד פתרון מניות laminin (1.2.2) וaliquot אחד פתרון poly-L ליזין מניות (1.2.3) במים סטריליים כדי נפח סופי של 12 מיליליטר.
    2. הנח מוסיף קרום ל6 צלחות גם עם כל 2 מיליליטר המכיל גם של מים סטריליים. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת ציפוי על גבי קרום דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2.
    3. לאחר הדגירה לשטוף את הקרום מוסיף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של מים סטריליים ויבשים. השתמש מוסיף קרום מצופה באותו היום או בחנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד ארבעה שבועות בצלחת גם יבשה 6.

2. הזרקת DNA וElectroporation של E15.5 וE18.5 עוברים

  1. להרדים זמן הזדווגו עכבר נשי על ידי הצבת אותו לחדר הרדמה רווי isoflurane 5% ומחובר למכשיר אדים. הפיצו isoflurane וחמצן בשיעור של 1 ליטר / דקה. לשמור על בעלי החיים בתיבה במשך 2-4 דקות או עד שלא מודע שהוא נבדק על ידי צובט בין כפות של העכבר.
  2. להרדים את העכבר הלא-מודע על ידי נקע בצוואר הרחם ביום עוברי (E) 15.5 או 18.5. לנתח את הרחם המכיל את העוברים 13 ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי המכילה 15-20 מיליליטר של HBSS המלא הקר.
    הערה: מנקודה זו ואילך, לשמור על העוברים ורקמות על קרח.
  3. השתמש במספריים כדי להפריד בין עובר מקרן הרחם והמקום לתוך צלחת פטרי המכילה HBSS שני מלא קר.
  4. תחת מיקרוסקופ לנתח, לנתק את קיר שריר רחם והשליה באמצעות זוג מלקחיים בסדר (# 55) ומספריים. זהירות לשחרר את העובר מן שק החלמון.
  5. השתמש במספרי בון לdecapitatדואר העוברים מעל forelimbs בזווית 60 מעלות. אם הניסוי דורש genotyping של העוברים, לאסוף דגימת רקמה לבידוד הדנ"א הגנומי (חתיכה קטנה של זנב).
  6. העבר את הראש בצלחת פטרי נקייה ויבשה. בגלל הראש נערף בזווית 60 מעלות, הראש צריך להטות לצד אחד כאשר הניחו בצד את גב.
  7. הנח מחט בזהירות לתוך אמצע הקרוב חצי הכדור לגבחת (איור 1 א ', ב'). להזריק כ 2-3 μl (ב 3 או 4 מיקרוגרם / μl) של פתרון ה- DNA על ידי דריכה על הדוושה של Picospritzer III באמצעות 30 ק"ג של לחץ למשך 10-15 אלפיות שני לכל דופק, החלת 5-8 קטניות. המשך ומספר הפעימות תלויים בקוטר של פתיחת המחט עם פתחים קטנים יותר הדורשים יותר זמן. המרווח בין דופק בכל מסתכם לסך של 1 שניות.
  8. לפני הנחת האלקטרודות, חלים כמה טיפות של HBSS המלא על ראשו של embrיו. הנח את האלקטרודות בצורה כזאת, כי המסוף 'השלילי' הוא באותו הצד כמו החדר המוזרק ואלקטרודה 'החיובית' בצד השני של החדר המוזרק מתחת לאוזן של ראשו של העובר (איור 1 ג, ד). החל 5 פולסים של 50 V.
    1. השתמש 3 אלקטרודות מ"מ לE 15.5 ו -5 מ"מ אלקטרודות לE 18.5.

3. Dissection של המוח

  1. לאחר electroporation, לקלף את העור מהראש בעזרת זוג מלקחיים בסדר. באמצעות מספריים האביב לעשות חתך קטן באמצע של המוח הקטן בקו האמצע של הגולגולת.
  2. הכנס את המספריים האביב לתוך החתך וחתך אורכית לאורך תפר sagittal. לקלף את הגולגולת ולנתק את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים בסדר. העבר את המוח כולו לתוך 15-20 פתרון HBSS מלא קר מיליליטר.
  3. , בינתיים לשפוך 4% agarose LMP,המשיך ב37-39 מעלות צלזיוס באמבט מים, לתוך תבנית קליפה משם.
  4. קח את המוח של HBSS השלם על ידי מרית סקופ קטנה וניקוז עודף של HBSS באמצעות נייר טישו קנס או Kimwipes.
  5. מניחים את המוח כולו בעדינות לתוך agarose ולשנות את המיקום שלה עם מחט דקה. שמור את התבנית על קרח עד agarose הוא מוצק והבלוק מחולק (לסעיפי העטרה נורות הריח מצביעות למעלה).

4. חתך vibratome וSlice תרבות

  1. חתוך את אבני agarose LMP ולהדביק אותם לבמה הדגימה באמצעות "דבק סופר". לאחר הדבק היא העברה יבשה שלב הדגימה למגש החיץ של vibratome ולמלא עם קרח קר להשלים HBSS עד הבלוק הוא שקוע בפתרון.
    הערה: לעקר את כל משטחי המכשיר וציוד עם אתנול 70% לפני חתך.
  2. הכן 250 מיקרומטר סעיפי vibratome עבים באמצעות סכין חדש ואחרי.
    1. חתוך את wi הבלוקה ההגדרות הבאות; תדירות - 60 הרץ, משרעת - 0.7 מיקרומטר, מ"מ 16-18 מהירות / sec. חותך את הקטעים המכילים רקמה הרצויה עם ההגדרות לעיל במהירות איטית (9 מ"מ / sec). החל חתך מהמוח האחורי, לאסוף 5-7 חלקים מהמוח.
    2. העבר את החלקים למנת תרבות נקייה 6 היטב המכילה 5 מיליליטר של קרח קר להשלים HBSS בעזרת מרית כפופה ולשמור על קרח עד שכל החלקים נאספים (איור 1E).
  3. להרטיב את הקרום באופן צולב עם של HBSS המלא 100 μl לפני הנחת הסעיפים על הקרום, כדי להקל על ההתמצאות של הסעיפים.
  4. העבר את החלקים בעזרת מרית כפופה על הממברנה (להרים פינה של הסעיף עם מלקחיים ולמשוך אל המרית ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי לדחוף את הסעיף על הממברנה). הנח עד חמישה חלקים בקרום אחד ולארגן באמצעות מלקחיים (איור 1F). אינו חופף חלקים אחד עם השני.
    1. קח את עודף HBSS את הקרום בעזרת פיפטה. הקרומים הספציפיים משמשים כאן מחוברים למסגרת ומוכנסים לתוך צלחת תרבית רקמה, המאפשרת לרקמה להיות בקשר אבל אינו מכוסות על ידי המדיום.
  5. מניחים את הקרום מוסיף לצלחת 6 היטב המכילה 1.8 מיליליטר של מדיום התרבות הפרוסה (1.2.5) (איור 1G, H). דגירה צלחת התרבות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך 11 או 14 DIV DIV. לשנות מחצית בינונית (0.9 מיליליטר) בכל יום שני.
    הערה: בשלב זה, להוסיף חומרים כימיים כמו Bromodeoxyuridine (BrdU; 10 מיקרומטר ריכוז סופי) לתיוג תאים מתרבים בתקשורת במשך 20 שעות הראשונות של זמן התרבות.

5. קיבוע של הסעיפים ואחריו Immunofluorescence מכתים

  1. השתמש בלהב סכין מנתחים נקי וחד לחתוך ולקצץ את הקרומים בהתאם לאורינטציה שלהחלקים.
  2. העבר את החלקים יחד עם הקרום לצלחת 24 היטב המכילה 1 מיליליטר של 4% PFA (1.2.7). דגירה הסעיפים עבור שעה 1 ב RT ואחריו 3 שוטף עם 1x PBS במשך 15 דקות כל אחד. דגירה הסעיפים O / N עם פתרון permeabilization על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
  3. למחרת, דגירה הקטעים עם נוגדנים ראשוניים מתאימים, בדילול מלא בפתרון permeabilization, O / N או במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
  4. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים למשך 15 דקות עם 1x PBS ודגירת O / N ב 4 ° C עם הנוגדנים משני המתאימים מדוללים בפתרון permeabilization.
  5. לאחר הדגירה עם נוגדנים משני, לשטוף את החלקים פעם עם 1x PBS במשך 15 דקות ואחריו מכתים DAPI במשך 10 דקות.
  6. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים עם 1x PBS במשך 15 דקות כל אחד ולהעביר לשקופיות מיקרוסקופ. להוסיף ImmunoMount ומניח בעדינות coverslip על גבי החלקים. ייבש את השקופיות O / N ב 4 ° C וseאל עם לק.
    הערה: שמור את השקופיות תמיד על 4 מעלות צלזיוס.
    1. נתח את התרבויות הפרוסה על ידי מיקרוסקופ confocal (איור 1 ט).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אבלציה של גורם שעתוק Bcl11b גורמת לירידת ערך של התפשטות תאי אב והבחנה עצבית וכתוצאה מכך בגודל המוקטן המשונן gyrus ומספר תא. יתר על כן תאי עצב מוטציה אינם מצליחים להשתלב במעגל בהיפוקמפוס גורם למידה וזיכרון ירידת ערך 8. כדי לענות על שאלות הנוגעות למנגנון הרגולציה (ים) של Bcl11b בתהליכים אלה electroporation ברחם לשעבר הועסק.

בהתייחסו לשאלה האם Bcl11b תא-אוטונומי מווסת את התמיינות תאים עצבית, מחיק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש היפוקמפוס תפקיד חשוב בלמידה וזיכרון. Gyrus המשונן הוא גם אחד משני אזורים במוח שבו neurogenesis מתרחשת לא רק בפיתוח, אלא גם בבגרות. לאחר לידה ותמורת neurogenesis היפוקמפוס מבוגרת באופן דומה מעורב גורמים משותפים רבים. הגדרת מנגנוני הפיקוח של גורמים אלה יהיו מועילות מאוד בהבנת מחלות ניווניות אשר בתורו תוביל לטיפולים חדשים ואמצעי מניעה. כדי להשיג מידע זה דורש מערכת לתפעל תאים בודדים ולבחון אותם בסביבה הטבעית שלהם, כפי שהודגם על ידי electroporation ברחם לשעבר ואחריו התרבות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-Deutsche Forschungsgemeinschaft ל-SB (BR-2215; SFB 497/A9).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Flaming/Brown MicropipettePuller Sutter Instruments Company (ארה"ב)P-97
פיפטות זכוכית עדינהWarner InstrumentsG100F-4
MicrogrinderNarishige, יפןEG-44
יחידת סוגר הרדמהמכשיר הרווארדPY2 34-0412
HalovetVaporizer מכשיר הרווארדPY2 34-0398
מערכת Fluovacמכשיר הרווארדPY2 34-0387
IMS Fluosorberהרווארד מנגנוןPY2 34-0415
תא הרדמהמכשיר הרווארדPY2 34-0460
אלקטרופורטורBEX חברתCUY21 EDIT
פינצטה עם אלקטרודות דיסקחברת BEXLF650P3אלקטרודות 3 מ"מ עבור פינצטה E15.5
עם אלקטרודות דיסקחברת BEX LF650P5אלקטרודות 5 מ"מ עבור E18.5
Picospritzer IIIParker Hannifin CorporationP/N 052-0500-900
HM 650 V להב רוטט מיקרוטום, 230 VThermo Scientific920120
מיקרוסקופ דיסקציהקרל זייס מיקרוסקופ GmbhStemi SV8
מיקרוסקופ הפוךLeicaLeica DM IL LED
מיקרוסקופ קונפוקליLeicaSp5II
6 באר צלחתBD בז#353502
6 באר צלחתCELLSTAR#657160
תרבית רקמות מוסיףBD Falcon#353090
Fast GreenSigmaF7252
LamininSigma
#L2020 פולי-ליזיןסיגמא#P5899
מספריים קפיצייםכלי מדע עדינים15003-08
מספריים בוןעדינים במיוחד כלי מדע עדינים14084-08
מלקחייםדומונט #5511255-20 Inox
HBSS 10xLife Technology14180-046
BMELife Technology41010-26

מקורות

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
  2. Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
  3. Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
  4. Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
  5. Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
  6. Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
  7. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  8. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
  9. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  10. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
  11. Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19(2002).
  13. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
  14. Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
  15. Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
  16. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מיקוד בפיתול השינייםמיקרוסקופיה קונפוקליתצביעה אימונופלורסצנטיתחיתוך בוibratomeהטמעה באגרוזמצע תרבית לפרוסותנוגדנים ראשוניים
Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.