Busulfan כסוכן Myelosuppressive ליצירת ברמה גבוהה יציבה מח עצם chimerism בעכברים

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לפיו התניה של בוסולפן מאפשרת להחליף את מח העצם של עכבר נמען בתאי מח עצם מעכברים תורמים המבטאים בכל מקום חלבון פלואורסצנטי ירוק, בהיעדר הקרנה. טכניקה זו שימושית לחקר הצטברות תאי מח עצם במערכת העצבים המרכזית.

תקציר

השתלת מח עצם (BMT) משמשת לעתים קרובות להחלפת תא מח העצם (BM) של עכברים מושתלים בתאי BM המבטאים סמן ביולוגי מובהק שבודד מעכברים תורמים. טכניקה זו מאפשרת זיהוי של תאים המטופויאטיים שמקורם בתורם בתוך העכברים המקבלים, וניתן להשתמש בה כדי לבודד ולאפיין תאים תורמים באמצעות טכניקות ביוכימיות שונות. BMT מסתמך בדרך כלל על התניה מיאלואבלטיבית עם הקרנה כוללת של הגוף כדי ליצור מרחב נישה בתוך תא ה-BM של עכברים נמענים להשתלת תאים תורמים. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן משתמש בהתניה מיאלוסופרסיבית עם התרופה הכימותרפית busulfan. בניגוד להקרנה, הדורשת שימוש במתקנים מיוחדים, מיזוג הבוסולפן מבוצע באמצעות הזרקות תוך-צפקיות של 20 מ"ג/ק"ג בוסולפן עד למתן מינון כולל של 60-100 מ"ג/ק"ג. יתר על כן, להקרנה מיאלואבלטיבית עלולות להיות תופעות לוואי רעילות ודורשת השתלה מוצלחת של תאי תורם להישרדות העכברים המקבלים. לעומת זאת, התניה של בוסולפן באמצעות מינונים אלה נסבלת בדרך כלל היטב ועכברים שורדים ללא תמיכה של תאים תורמים. תאי BM תורמים מבודדים מעצם הירך והשוק של עכברים המבטאים בכל מקום חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), ומוזרקים לווריד הזנב הצדדי של עכברים מושתנים. כימריזם BM מוערך על ידי כימות מספר תאי GFP+ בדם ההיקפי לאחר BMT. רמות כימריזם >80% נצפות בדרך כלל בדם ההיקפי 3-4 שבועות לאחר ההשתלה ונשארות מבוססות לפחות שנה. בדומה להקרנה, התניה עם בוסולפן ו-BMT מאפשרת הצטברות של תאים שמקורם ב-BM בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), במיוחד במודלים של עכברים של ניוון עצבי. הצטברות זו של מערכת העצבים המרכזית בתיווך בוסולפן עשויה להיות פיזיולוגית יותר מהקרנה כוללת של הגוף, מכיוון שהטיפול בבוסולפן פחות רעיל ודלקת במערכת העצבים המרכזית נראית פחות נרחבת. אנו משערים כי ניתן להנדס גנטית תאים אלה כדי לספק טיפולים למערכת העצבים המרכזית.

מבוא

לאחרונה, היה עניין רב בתפקידים של מיקרוגליה ותאים שמקורם במח עצם (BMDCs) במערכת העצבים המרכזית (CNS), הן במהלך מחלה והן עם הזדקנות רגילה. מיקרוגליה, תאי החיסון המקומיים של מערכת העצבים המרכזית, ידועים כיום כמתפתחים במערכת העצבים המרכזית בעקבות כניסתם של אבות מיאלואידים פרימיטיביים במהלך האמבריוגנזה¹. מיקרוגליה שומרת על היבטים של השושלת המיאלומונוציטית שלהם גם בחיים הבוגרים. בעוד שהראיות מצביעות על כך שתרומת ה-BMDCs למאגר המיקרוגליה היא מינימלית בבעלי חיים בוגרים בריאים¹, התפקיד של BMDCs בהתקדמות של מחלות ניווניות שונות נותר לא ברור. אי ודאות זו מורכבת על ידי העובדה שקשה להבחין בין BMDCs המצטברים בתוך מערכת העצבים המרכזית לבין מיקרוגליה תושבת אנדוגנית, מכיוון שלא זוהה סמן אימונוהיסטוכימי מבחין מקובל אוניברסלי. על מנת לנטר BMDCs in vivo, אנו משתמשים בפרוטוקול השתלת BM (BMT) לפיו תאי BM אנדוגניים של עכבר מקבל מוחלפים באלה של עכבר תורם המבטא בכל מקום חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של מקדם β-אקטין. פרוטוקול זה מאפשר לקבוע הן את הלוקליזציה והן את המורפולוגיה של GFP+ BMDCs בתוך העכבר המקבל באמצעות אימונוהיסטוכימיה, ומאפשר אפיון נוסף של תאים אלה באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ואחריו בדיקות ביוכימיות עוקבות.

עבור BMT מוצלח, תאי BM של הנמען צריכים לעבור כריתה (נקרא מיאלואבלציה) על מנת ליצור מרחב נישה בתוך ה-BM המקבל כדי לאפשר השתלת תא תורם. לעתים קרובות, מיאלואבלציה מושגת באמצעות הקרנת גמא של כל הגוף הגורמת לשבירת גדיל כפול ב-DNA המובילה למוות של תאים, במיוחד בתאים המתחלקים באופן פעיל כגון תאי אב המטופויאטיים^2,3. פרוטוקולי ההקרנה נעשים כדי לגרום למוות מספיק של תאי BM כך שנוצרת קטלניות של בעלי חיים אם בעל החיים המקבל אינו משיג השתלת תאי תורם מספקת מ-BMT (מה שנקרא 'קרינה קטלנית'). עם זאת, הקרנה דורשת מתקן וציוד מיוחדים, יחד עם משאבים וטרינריים וגידול בעלי חיים שאינם זמינים לחוקרים בכל המוסדות. יתר על כן, הקרנה מיאלואבלטיבית עלולה לגרום לנזק קטלני פוטנציאלי לרקמות אחרות, ובשל חיסופרסיה, בעלי חיים מוקרנים רגישים יותר לזיהומים משניים³. ככזה, פותחו משטרי התניה בעוצמה מופחתת (מה שנקרא פרוטוקולי 'RIC') שנועדו למזער את תופעות הלוואי הרעילות של פרוטוקול ההתניה בחולים, במיוחד לשימוש באוכלוסיות בסיכון כמו ילדים וקשישים⁴.

חלק מהפרוטוקולים של RIC מסתמכים על כימותרפיה כגון בוסולפן על מנת לרכך את תא ה-BM. בוסולפן הוא חומר אלקילציה דו-תפקודי של DNA המשמש לעתים קרובות קלינית כחלופה להקרנה^5,6. יש לציין כי ניתן לתת בבטחה את הבוסולפן לעכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית (IP) ואינו דורש את המתקנים והציוד המיוחדים הדרושים להקרנת עכברים. התניה של בוסולפן הייתה בשימוש נרחב במעבדה 7^{שלנו, כמו} גם בכמה פרסומים אחרונים אחרים ^8-11. כאשר משתמשים במינונים של 60-100 מ"ג/ק"ג, ניתן לבסס דרגות גבוהות של כימריזם יציב (>80% תאי GFP+) בדם ההיקפי וב-BM⁷. חשוב לציין, במינונים אלה המיאלואבלציה אינה שלמה ולכן עכברים מסוגלים לשרוד מבלי לקבל תאי BM תומכים (K. Peake, J. Manning, C. Lewis, and C. Krieger, תצפיות שלא פורסמו). יתר על כן, עם התניה מיאלוסופרסיבית של בוסולפן יש בנייה מחדש מהירה של תאים מיאלומונוציטים בדם היקפי על ידי תאים תורמים. עם זאת, החלפת לימפוציטים בדם היקפי על ידי תאים תורמים היא איטית יותר, מה שמדגיש את היעדר הדיכוי החיסוני המתרחש במינונים של 60-100 מ"ג/ק"ג של בוסולפן בהשוואה להקרנה כוללת של הגוף⁷.

השתמשנו בהצלחה בכימריזם המושרה על ידי בוסולפן כדי לחקור BMDCs בעכברים מסוג בר, כמו גם במודלים של עכברים של הפרעות ניווניות של מערכת העצבים טרשת אמיוטרופית צידית (ALS)⁷ ומחלת אלצהיימר. נצפה כי בתנאים מסוימים מצטברים מספר משמעותי של GFP+ BMDCs בתוך מערכת העצבים המרכזית^7,12. חשוב לציין, בדומה להתניה מיאלואבלטיבית עם הקרנה, התניה של בוסולפן ואחריה BMT מספיקה כדי לאפשר הצטברות GFP+ BMDC בתוך מערכת העצבים המרכזית הן בעכברים מסוג פרא, והן בעכברים עם הפרעות נוירולוגיות ^7-11. מכיוון שמכשול מרכזי בטיפול בהפרעות ניווניות של מערכת העצבים הוא היכולת להעביר מולקולות טיפוליות ממחזור הדם למערכת העצבים המרכזית, שם הן יכולות להפעיל השפעות מועילות, זה מעלה את האפשרות שניתן יהיה להנדס BMDCs כדי לבטא מולקולות טיפוליות, ולאחר מכן להשתמש בהן ככלי להעברת טיפולים למערכת העצבים המרכזית של מושתלי בוסולפן מותנים, מנגנון שאנו חוקרים באופן פעיל. למרות שמצאנו כי התניה מיאלואבלטיבית עם הקרנה מובילה להצטברות גדולה יותר של GFP+ BMDCs במערכת העצבים המרכזית בהשוואה להתניה של בוסולפן⁷, להקרנה עשויה להיות רעילות ניכרת בחולים עם הפרעות ניווניות ובמודלים עכבריים של מחלת מערכת העצבים המרכזית.

בעוד שאנחנו, ורבים אחרים, השתמשנו במודלים של BMT כדי לחקור BMDCs בהפרעות ניווניות, היכולת להחליף במידה רבה את תא ה-BM של עכבר מקבל באוכלוסייה ניתנת לזיהוי מובהק של תאי BM היא כלי רב ערך לחקר היבטים שונים של המערכת ההמטופויאטית. זה כולל מגוון רחב של נושאי מחקר כגון התפתחות שושלת המטופויאטית, לוקמיה, השתלת איברים, מחלת השתל נגד המארח ואימונוביולוגיה.

פרוטוקול

הערה: אתיקה הצהרה: פרוטוקול זה נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת סיימון פרייזר (UACC; להתיר מספרי 1037K-1060K 12 ו- 03) ועומד במועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, מדריך NIH ל הטיפול ושימוש בחי מעבדה, והוראת מועצת EEC.

1. שיקולים מיוחדים

הערה: Busulfan הוא רעיל לתאים. נהלי טיפול והשלכה על פי גיליון נתוני בטיחות חומרים והנחיות מוסדיות.

1. לבצע את כל טכניקות סביבה נקיות מחיידקים בזרימה למינרית.
2. לעקר מכשירים לפני השימוש על ידי עטיפה בחומר אריזה מתאימה, כגון חבילת קליפה, ומעוקר.
3. בעוד שהסיכון לזיהום נמוך עם אוויר busulfan בהשוואה לקרינה, להתמודד עם בעלי חיים רק בזרימה למינרית במשך 2 השבועות הראשונים שלאחר השתלה.

2. אוויר שלעכברים נמען

1. לדלל busulfan עד 3 מ"ג / מיליליטר עם פוספט סטרילי שנאגרו (PBS).
   הערה: חשוב לעשות דילול טרי של busulfan רק לפני שימוש בכל יום של זריקה.
2. לנהל 20 מ"ג / קילוגרם של busulfan המדולל לעכברי נמען באמצעות הזרקת IP יומית.
3. חזור על זריקות IP יומיות של 20 מ"ג / קילוגרם busulfan עד מינון כולל של 60-100 מ"ג / קילוגרם נמסר (כלומר, ל- 80 מ"ג / קילוגרם מינון כולל, לנהל 20 מ"ג / קילוגרם של busulfan במשך 4 ימים רצופים).

3. בידוד של תאי מח העצם תורמים

הערה: פרוטוקול זה שמש בהצלחה לבידוד והכנת תאי BM ממרחק של עד 5 עכברי תורם. בדרך כלל תשואת התא לכל עכבר היא כ 30-40 מ'BMDCs, אשר די בו כדי להשתיל 12-16 עכברי נמען. אם יש צורך יותר עכברי תורם הפרוטוקול ייתכן שיהיה הצורך להיות בהתאם.

1. בעקבות היום האחרון של euth אוויר busulfananize עכבר תורם GFP (ישן 05:59 חודשים) באמצעות CO ₂ (או על ידי הליך המתת חסד אחר מקובל במוסד). כדי להימנע מסיבוכי שתל להשתמש תורמי syngeneic שאותו המין כמקבלים.
2. תרסיס עכבר עם אתנול 70%. עור מעלית במספרי כירורגיות הבטן ושימוש עושה חתך דרך העור מחלל הבטן את הרגל לכיוון הקרסול. מחזיק הרגל, בתקיפות למשוך את העור מהקרסול לכיוון הירך חושפת את רקמת הרגל.
3. חתוך את שריר ורקמת שומן מהירך לחשוף את מפרק הירך.
4. תוך משיכת בעדינות על הרגל כדי להאריך את הרגל, לחץ על המספריים נגד מפרק הירך. לחתוך בדיוק מעל הראש של טיפול לקיחת עצם ירך לא לחתוך את עצם הירך עצמו.
5. כדי לעזור לשמור על סטריליות, להחזיק את הרגל על ​​ידי הרגל ולנקות את כל רקמה שנותרה מהעצמות על ידי שפשוף פני השטח העצם עם רקמות autoclaved.
6. הפרד את עצם הירך ועצם שוק על ידי חיתוך דרך מפרק הברך ולמקם את עצם הירך בצלחת תרבות המכילה PBS סטרילי. דגירה על קרח.
7. להסיר ולסלק שוקית על ידי חיתוך בנקודות שבי שוקית מתחברת לעצם השוק. הנח את השוקה בצלחת התרבות עם עצם הירך ולדגור על קרח.
8. חזור על שלבים 3.2-3.7 לרגל השנייה, ואם יש צורך, עכברים תורמים נוספים. לאחר פינוי העצמות, לעקר את הכלים כירורגיים עם מעקר חרוז חם או להשתמש סט חדש של כלים סטריליים לשלבים הבאים.
9. לעצמות הירך, להחזיק את עצם הירך עם מלקחיים ובאמצעות מספריים כירורגיות בזהירות לגלח דיסטלי מסתיים מעל העצם. הסר קטן כמו של עצם הצורך לחשוף את חלל BM.
10. ממלאי מזרק עם 3 מיליליטר של PBS סטרילי ולצרף מחט G 23. נשא בזהירות את המחט לתוך החלל בע"מ ולשטוף את BM לתוך צלחת תרבות סטרילי. הקפד לגרד את החלל הלשדי עם נקודת המחט על מנת להבטיח הסרה של כל התאים הרצויים. לאחר מיצוי,להבטיח שBM האדום הוא כבר לא נראה לעין והעצם מופיע כעת לבן.
11. חזור על השלבים 3.9-3.10 לעצמות ירך שלאחר מכן, איגום כל BM באותה צלחת התרבות.
12. לtibiae, להחזיק את עצם השוק עם מלקחיים ובזהירות "גילוח" הסוף שבו השוקה צורפה לברך לחשוף את חלל BM. לעשות חתך שני לאורך העצם שבו BM האדום הגלוי מסתיים.
13. ממלאי מזרק עם 3 מיליליטר של PBS סטרילי ולצרף מחט 25 G. הכנס בעדינות את המחט לתוך החלל בע"מ (מהסוף שהיה מחובר לברך) ולשטוף את BM לתוך צלחת התרבות המכילה BM מעצמות הירך. לגרד את הקירות של חלל BM עם המחט כדי להסיר את כל התאים. לאחר מיצוי, להבטיח כי BM האדום הוא כבר לא נראה לעין והעצם מופיע כעת לבן.
14. חזור על השלבים 3.12-3.13 לtibiae שלאחר מכן, איגום כל BM באותה צלחת התרבות.
15. בעדינות triturate BM עם טיפ פיפטה 1 מיליליטר לניתק גאמות.
16. להעביר את ההשעיה התא דרך מסנן סל 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 50 מ"ל. יש לשטוף את המנה עם PBS כדי לקבל את כל תאים שנותרו ולהעביר את זה דרך המסנן לתוך צינור צנטריפוגות.
17. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C. להסיר ולסלק supernatant.
18. להשעות מחדש את הכדור ב 3 מיליליטר של חיץ lysing כדורית אדומה. לדגור על קרח במשך 8.5 דקות.
19. להוסיף ~ 30 מיליליטר של PBS סטרילי כדי להרוות את חיץ lysing.
20. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C. להסיר ולסלק supernatant.
21. מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של PBS סטרילי. שמור על קרח.
22. קח aliquot קטן של homogenate התא ולדלל עם PBS (1: 100 לעכבר 1; 1: 200 עבור 2 עכברים, וכו ') כדי לכמת את המספר הסלולרי באמצעות haemocytometer.
23. לדלל את ההשעיה התא עד 8 ​​x 10 ⁶ תאים / מיליליטר ו דגירה על קרח עד הזרקה.

4. השתלת מח עצם

1. Fill מזרק 0.5 מיליליטר (עם מחט אינסולין 28 G) עם 300 μl של השעיה תא מדוללת לכל עכבר להיות מוזרק. הקפד להסיר את כל בועות אוויר הנוכחיות במזרק.
2. מניחים את כלוב העכבר שמכיל את עכברי נמען המותנה בכרית חימום ולאפשר ורידי הזנב להתרחב.
3. קח עכבר נמען ומקום במכשיר ההרחקה. נגב את הזנב עם גזה טבולה כירורגית עם 70% אתנול.
4. בתוקף להחזיק את הזנב ועם השיפוע של עד, בעדינות להכניס את המחט לתוך אחד מורידי הזנב לרוחב ולהזריק את ההשעיה התא.
5. להחזיק גזה כירורגית באתר ההזרקה עד הדימום מפסיק לפני החדרת העכבר לכלוב נקי חדש.

5. הערכת היקף BM chimerism

הערה: רמות chimerism הן בדרך כלל משתנים בדם ההיקפי בשבוע שלאחר BMT 1, וכמו רמות chimerism כזה בדרך כלל נאמדים בלפחות 2 שבועות לאחר BMT. רמות של chimerism צריך להגיע> GFP 80% + תאים בדם ההיקפי בתוך 3-4 שבועות לאחר BMT.

1. הכן חיץ FACS (2 EDTA 2% בסרום שור עוברי מ"מ + PBS).
   הערה: חיץ FACS יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
2. מניחים את העכבר בצינור מניעה ולגלח את הפרווה על הרגל האחורית כדי לחשוף את וריד saphenous לרוחב.
3. מעיל דק הרגל עם וזלין ופירס וריד saphenous עם מחט 25 G.
4. לאסוף כ -50 μl דם עם צינור נימי הפרין מצופה. הוסף את הדם לצינור מיקרו צנטריפוגות המכיל 1 מיליליטר של חיץ FACS. מערבבים את הצינור על ידי היפוך ולאחסן על קרח.
5. להחזיק גזה כירורגית באתר ההזרקה עד הדימום מפסיק לפני החזרת עכבר חזרה לכלוב.
6. צנטריפוגה דגימות הדם במשך 5 דקות ב 900 x g. להסיר ולסלק supernatant.
7. להשעות מחדש את הכדור ב 500 μl של חיץ lysing כדורית אדומה. לדגור על קרח במשך 8.5 דקות.
8. הוסף 1 מיליליטר של חיץ FACS כדי להרוות את חיץ lysing.
9. צנטריפוגה הדגימות למשך 5 דקות ב 900 x g. להסיר ולסלק supernatant.
10. לבצע צעד תמוגה שני ב 500 μl של חיץ lysing כדורית אדומה. לדגור על קרח במשך 8.5 דקות.
11. הוסף 1 מיליליטר של חיץ FACS כדי להרוות את חיץ lysing.
12. צנטריפוגה הדגימות למשך 5 דקות ב 900 x g. להסיר ולסלק supernatant. בדוק שהגלולה היא כעת לבנה.
    הערה: אם גלולה עדיין נראית אדומה, ייתכן שיהיה צורך שלב תמוגה נוסף לפני שימשיך לשלב הבא.
13. מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ FACS. צנטריפוגה הדגימות למשך 5 דקות ב 900 x g. להסיר ולסלק supernatant.
14. להשעות מחדש את הכדור ב 300 μl של חיץ FACS ולכמת GFP + תאים באמצעות cytometry הזרימה (הערה: בשלב זה כל immunostaining רצוי של התאים יכול להתבצע, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית, לפני ניתוח תזרים cytometric).

תוצאות

הממשל של 60-100 מ"ג / קילוגרם של busulfan בדרך כלל נסבל היטב על ידי עכברים. עם זאת, בעלי חיים בדרך כלל לרדת במשקל בשלב האוויר (~ 5-10%) ובכך הדיאטה ייתכן שיהיה צורך בתוספת פינוקים כגון זרעי חמניות מוקרנים לעודד אכילה. רמות של chimerism של GFP + תאים> 80% בדם ההיקפי וBM צריכה להיות ברות השגה באופן עקבי באמצעות 60-100 מ"ג / קילוגרם busulfan ^7. המעבדה שלנו השתמשה בהצלחה בפרוטוקול זה כדי לייצר מעל 100 עכברי chimeric עם> GFP 80% + תאים בדם ההיקפי וBM, וכמעט כ...

דיון

אוויר Busulfan מאפשר לדור של chimerism BM ברמה גבוהה בעכברים עם תאי hematopoietic שהם לגילוי בקלות. אוויר זה יכול להתבצע ללא צורך במתקני קרינה. יתר על כן, myelosuppression עם המינונים של busulfan המפורטים בפרוטוקול זה נסבל היטב, מזעור תופעות לוואי רעיל הנגרמות על ידי מינוני myeloablative של קרינה, ולכן עשוי להיות טכניקה מתאימה יותר ליצירת chimerism BM בעכברים צעירים, זקנים, או חולים, כי הם יותר רגיש לקרינת myeloablative. כמה פרוטוקולי RIC להשתמש במינונים נמוכים, שאינו myleoablativ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Busulfex	Otsuka קנדה פרמצבטיקה בע"מ	DIN 02240602	יש לדלל את הבוסולפן ל-3 מ"ג/מ"ל עם PBS סטרילי ממש לפני השימוש. בוסולפן הוא ציטוטוקסי. לטפל ולהיפטר בהתאם ל-MSDS ולהנחיות המוסדיות.
ACK Lysing	Buffer Life Technologies	A10492-01	ניתן להחליף מאגר ליזה אחר, אך ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמני הדגירה בהתאם
Fetal Bovine	Serum Life Technologies	12483-020